均匀设计优化杨属的SRAP—PCR反应体系

采用均匀设计方法,对影响杨属SRAP-PCR体系的MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板浓度等因素分别进行了U16(45)和U12(35)两轮优化,建立了适用于杨属的SRAP-PCR反应体系。在25μL反应体系中,MgCl23.5mmol/L、dNTPs0.20mmol/L、引物0.44μmol/L、TaqDNA聚合酶1.50U、模板浓度28ng/L为最适条件。在此基础上又对退火温度进行了摸索,结果发现,扩增结果对退火温度变化不敏感。最后运用优化体系对杨属3派10个种共16个单株的DNA进行扩增验证,结果获得的DNA条带清晰,多态性比较丰富。说明这一优化的SRAP-PCR反应体系可用于杨属不同种间亲缘关系、系统进化和遗传多样性等方面的研究。     

盾叶薯蓣ISSR-PCR扩增条件研究

以盾叶薯蓣的叶片制备ISSR-PCR DNA 模板.通过单因子试验分别研究了模板DNA质量和浓度、Mg2 浓度、Taq酶用量、dNTPs浓度以及退火温度对盾叶薯蓣ISSR-PCR扩增的影响,建立了适宜于盾叶薯蓣的ISSR反应体系和扩增参数,即15μL反应体系中包括:20 ng/L模板DNA,1×Taq酶缓冲液,1.0 U Taq聚合酶,2.5 mmol/L MgCl2,0.2 μmol/L引物和0.3 mmol/L dNTPs.并从46个ISSR引物中筛选出10个带纹清晰、多态性丰富的引物,并确定了这些引物的适宜退火温度.     

狗牙根EST-SSR反应体系优化及其遗传多样性初步分析

利用 L16（4）5正交实验设计,对新疆狗牙根 EST-SSR反应体系进行优化;并将该体系初步应用于14份新疆典型区域的野生狗牙根材料,通过聚类分析研究供试材料的亲缘关系.结果表明,新疆狗牙根 EST-SSR反应最优体系为：20μL反应体系中含模板DNA 100 ng,引物0.5μmol/L,2μL 10×Buffer,MgCl21.5 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.5 U.运用该体系对14份新疆狗牙根材料进行PCR扩增,条带较清晰,可用于新疆狗牙根 EST-SSR标记的进一步研究.对14份狗牙根的多样性及其亲缘关系分析结果表明,狗牙根 Nei’s 基因多样性指数（H）变异范围为0.2077~0.3153,平均为0.2550;Shannon信息指数（I）在0.2540~0.4394.     

小麦SRAP-PCR体系的正交设计优化（摘要）

[目的]优化小麦SRAP-PCR技术体系。[方法]以小麦丰优68为试材,利用正交设计L16（45）对小麦SRAP-PCR反应体系中的5因素（Taq聚合酶、Mg2＋、模板DNA、dNTPs、引物）在4个水平上进行优化试验。[结果]不同因素对小麦SRAP反应体系影响的大小顺序为：Mg2＋〉Taq聚合酶〉dNTPs〉模板DNA〉引物;优化的小麦SRAP-PCR体系为：在20μl反应体系中,包括10×PCR buffer2.0μl、Mg2＋2.0mmol/L、Taq聚合酶2.0U、dNTPs0.2mmol/L、模板DNA40ng、引物0.6μmol/L。[结论]该优化体系为小麦资源SRAP遗传分析奠定了技术基础。     

沙棘SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选

为建立适合沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的SRAP-PCR反应体系,对影响SRAP-PCR的Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、模板DNA浓度进行了优化.优化后的反应体系为Mg2+3.0 mmol/L、Taq DNA聚合酶2U/25μL、引物0.8 μmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、模板DNA 30ng/25μL,反应总体系25 μL.利用此体系从30对引物组合中筛选出17对适合沙棘SRAP-PCR的引物,有助于沙棘的分子标记辅助育种研究.     

四倍体菘蓝ISSR-PCR反应体系优化与遗传差异分析

采用单因子试验,研究引物、dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶及退火温度对PCR扩增的影响,用其建立优化四倍体菘蓝的ISSR-PCR反应体系,分析不同四倍体菘蓝株系的遗传差异性.结果发现ISSR-PCR最佳反应体系为:在25 μL的反应体系中,引物浓度为0.76 μmol/L,dNTPs浓度为190 μmol/L,MgCl2浓度为200 μmol/L,Taq DNA 聚合酶用量为1.5U,模板DNA浓度为20 ng/μL;确定了不同引物最佳退火温度;菘蓝株系间具有中等偏高的遗传差异性,多态性条带达58.22％.表明采用单因子试验可以快速建立ISSR-PCR反应体系,可用于菘蓝遗传差异性分析.     

牡丹SRAP反应体系的建立及正交设计优化

采用L16(45)正交试验设计,对牡丹SRAP(sequence related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)反应体系中的Mg2+浓度、Taq聚合酶、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度5因素4水平正交优化,建立了适合于牡丹基因组的SRAP-PCR优化扩增反应体系,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,dNTPs为0.3 mmol/L,Taq酶1.5 U,引物为0.4μmol/L,模板DNA 1.0 ng/μL,总体积20.0μL。     

通江百合SRAP-PCR体系优化及引物筛选

利用正交设计和单因素试验相结合的方法,从模板DNA,引物,dNTPs,Taq DNA聚合酶,Mg2+等5因素4水平来优化通江百合SRAP-PCR反应体系,优化后的反应体系为Mg2+ 2.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.25 U,dNTPs 0.25 μmol/L,引物0.25 μmol/L,模板DNA 50 ng,总体积为25 μL.依据优化后的体系从144对引物中筛选出扩增条带清晰,多态性丰富的引物组合24对,体系验证结果表明,优化后的体系具有较高的稳定性和重复性.     

火焰兰属SRAP-PCR 体系的建立优化及验证

为建立火焰兰SRAP-PCR体系,采用U20(55)均匀试验设计,以10份火焰兰种质基因组DNA为模板,用3对SRAP引物对DNA模板、Mg2+、引物、Taq DNA聚合酶和dNTPs等5个因素的浓度进行优化组合和验证.结果表明,提取的火焰兰基因组DNA纯度高、完整性好;利用引物对Me6/Em6进行PCR扩增,对20个处理初步筛选出扩增条带较清晰,多态性丰富的处理,再用2个DNA模板进行复筛,获得最佳反应体系(20μL):模板DNA 60 ng、Mg2+2.0 mmol/L、引物1.0 μmol/L、Taq DNA聚合酶1.2 U、dNTPs 0.20 mmol/L.最后用2对引物、8份火焰兰种质来验证优化SRAP-PCR体系,其所获条带清晰,多态性丰富.     

长蛸ISSR-PCR优化反应体系的建立及优化研究

以长蛸DNA为模板,利用单因子试验分别对影响长蛸ISSR-PCR反应的DNA浓度、Taq DNA聚合酶、Mg2＋、dNTPs和引物的浓度进行了优化,并通过梯度PCR确定最适退火温度,最终确定长蛸最佳反应体系和PCR扩增程序为：25μL体系,其中包括Taq DNA聚合酶1.5 U,Mg2＋2 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.4μmol/L,DNA模板量约50 ng确立退火温度为52℃。利用所建立的ISSR-PCR反应体系,通过对24份野生长蛸样本的检验,获得了清晰、重复性好、多态性高的条带,研究结果对于把ISSR标记技术引入研究长蛸不同地理群体遗传多样性和遗传结构具有重要意义。