c-myc蛋白在不同毛色羊驼皮肤中的定位及表达

为了探索c-myc蛋白在羊驼皮肤中的定位及表达情况,以不同毛色的成年羊驼为研究对象,采用免疫组织化学方法检测c-myc蛋白在羊驼皮肤组织中的表达和定位.结果显示,c-myc在羊驼皮肤毛囊毛球部细胞中呈阳性表达,根据光密度值分析得出c-myc在棕色羊驼毛囊中显著表达,其相对表达量是白色羊驼的5.51倍.研究表明c-myc可能参与羊驼毛色形成.     

内皮素受体A在不同毛色羊驼皮肤中的分布

利用免疫组织化学技术对不同毛色羊驼皮肤中的内皮素受体A(EDNRA)的分布进行定位分析,并根据其在不同毛色羊驼皮肤中的差异性表达分析其功能。免疫组织化学结果显示,EDNRA在羊驼皮肤的毛乳头、毛根鞘及表皮细胞中均有表达;棕毛组和白毛组皮肤相比较,仅在棕毛组的毛根鞘细胞处的表达显著高于白毛组(P<0.05),其余2个部位处的表达差异不显著(P>0.05)。实验结果提示,EDNRA在不同毛色羊驼皮肤的毛根鞘部存在表达差异,表明其与黑素细胞的形成相关,推测其可能参与不同毛色的形成。     

POMC在不同毛色绵羊皮肤中的表达与定位

【目的】对不同毛色绵羊皮肤中的阿黑皮素原（proopiomelanocortin,POMC）进行定位和表达差异分析,确定POMC与毛色形成的关系,进一步丰富有关哺乳动物毛色形成机制的理论知识。【方法】选取年龄相近的雄性黑色和白色成年绵羊各3只,用取皮器分别在臀部采集皮肤组织3块,对其中一块制作石蜡切片后采用免疫组织化学法确定POMC在不同绵羊皮肤中的定位,另两块置于液氮中冻存后分别提取皮肤总RNA和总蛋白,总RNA经反转录成cDNA后,经NCBI分析比对后设计POMC特异性PCR引物,采用QRT-PCR方法检测POMC基因在mRNA水平的表达差异;总蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后,采用Western blotting方法加入POMC多克隆抗体检测POMC在蛋白水平的表达差异,得出的数据用SPSS19.0软件进行差异显著性分析,探讨POMC对毛色形成机制的调控作用。【结果】免疫组织化学结果显示POMC在黑色和白色绵羊皮肤中均有表达,且表达部位都位于毛囊根鞘周围和表皮的皮肤角质形成层细胞内;QRT-PCR结果显示POMC在黑色绵羊皮肤中mRNA的相对表达量为2.5004±0.2577^**,而在白色绵羊皮肤中POMC的mRNA的相对表达量为1.0032±0.0350,黑色绵羊皮肤中POMC的mRNA的相对表达量为白色绵羊皮肤的2.5倍,二者表达差异极显著（P＜0.01）;Western boltting结果显示黑色绵羊皮肤POMC蛋白水平相对表达量为1.5253±0.0426^*,而白色皮肤中POMC蛋白水平相对表达量为1.0005±0.0180,黑色皮肤POMC蛋白表达量是白色皮肤的1.55倍（P＜0.05）,两者差异显著。【结论】试验表明POMC可在黑色和白色绵羊皮肤中正常表达,且其表达位置一致,但POMC在不同毛色绵羊皮肤组织中mRNA和蛋白的表达水平存在一定的差异,表明POMC的表达量变化会在一定程度上影响毛色的生成。     

Mitf-M在羊驼皮肤组织的表达与序列分析及免疫组织化学定位

【目的】克隆羊驼皮肤组织表达的Mitf-M CDS序列,比较分析羊驼皮肤组织Mitf-M的特征,进一步定位分析Mitf-M蛋白表达的位置,为深入研究羊驼毛色基因表达机制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增方法分段扩增Mitf-M CDS区,分别利用Clustal X和BioEdit生物学软件对氨基酸序列进行多重序列比较分析,免疫组织化学技术对Mitf-M蛋白定位分析。【结果】羊驼皮肤组织表达的Mitf-M的CDS区由419个氨基酸组成,具有bHLH-zip转录家族的保守结构域,该基因与牛和犬亲缘关系最近,Mitf-M蛋白主要分布于羊驼皮肤组织毛球基底层细胞之间与毛乳头周围的黑色素细胞中。【结论】与其它物种相比较,羊驼皮肤组织表达的Mitf-M蛋白保守性很强,在进化过程中的变异不大,可见Mitf-M为毛发的色素沉积提供重要的物质基础。     

内皮素受体在不同毛色绵羊皮肤中的表达和定位分析

 【目的】研究内皮素受体A和B(endothelin receptor A and B, EDNR A and B)在绵羊皮肤中的表达与定位,以及在不同毛色中的差异比较,探讨其在绵羊毛色形成中的作用及其相关机制。【方法】以不同毛色的成年绵羊为研究对象(设黑色毛和白色毛两组),用RT-PCR法检测EDNR基因在不同毛色皮肤中的表达,并使用实时荧光定量PCR技术分析不同毛色绵羊皮肤EDNR基因的相对表达量,采用免疫组织化学法和Western blot法对EDNR在绵羊皮肤中的表达进行定位和定量分析。【结果】荧光定量PCR结果显示黑色绵羊中EDNRA的相对表达量是白色绵羊的1.2648倍,EDNRB的则是1.8248倍;Western blot结果显示,皮肤组织粗蛋白提取物中含有EDNR蛋白,且受体A在黑白两组皮肤中表达不显著(P＞0.05),受体B在黑色组的表达显著高于白毛组(P＜0.05);免疫组化实验结果显示,EDNR蛋白在两组皮肤的表皮和毛囊中均有表达,通过光密度分析,受体A在黑毛皮肤各处细胞中的表达显著高于白毛皮肤,受体B则在除毛根鞘之外的其它两处细胞中表达显著高于白毛皮肤(P＜0.05)。【结论】实验结果提示,EDNR参与绵羊皮肤黑素细胞的生成,且两受体作用效应存在差异。     

羊驼皮肤KAP3.2基因3′端序列的cDNA克隆及序列分析

利用大规模筛选表达序列标签(ESTs)方法,从羊驼皮肤cDNA文库中筛选出角蛋白关联蛋白(Ker-atin Associated Protein,KAP)KAP3.2基因的3′端序列,Genbank序列号为EV554632。利用生物信息学方法对此序列进行分析,结果表明,该基因片段大小为454bp,完整的ORF编码35个氨基酸;通过对其功能域分析得出,不含信号肽,在系统进化上,羊驼与人和黑猩猩的遗传距离较近。     

一氧化氮合酶异构体在不同毛色羊驼皮肤毛囊中的存在差异

【目的】研究羊驼皮肤毛囊中一氧化氮合酶(nitric oxide synthases,NOS)的存在差异。【方法】Dopa染色定位黑色素细胞;利用免疫组化和免疫印迹技术对不同毛色羊驼皮肤毛囊中NOS进行定位与定量分析,分析NOS在不同毛色羊驼皮肤毛囊中表达的差异。【结果】Dopa染色显示黑色素细胞存在于羊驼毛囊鞘和毛乳头中。免疫组化结果显示3种NOS在白毛组和棕毛组皮肤毛囊中均有阳性产物。NOS1和NOS3表达呈弱阳性,NOS2表达呈强阳性;NOS1在毛乳头细胞无阳性产物,在白毛组毛囊鞘细胞与棕毛组无显著差异(P0.05);NOS2在棕毛组毛囊鞘细胞与白毛组无显著差异(P0.05),在棕毛组毛乳头细胞极显著高于白毛组(P0.01);NOS3在毛囊鞘细胞无阳性产物,在白毛组毛乳头细胞与棕毛组无显著差异(P0.05)。免疫印迹显示NOS2在棕毛组显著高于白毛组(P0.05)。【结论】NOS2参与调节羊驼毛色形成,为NO信号调节羊驼毛色形成机制的研究提供试验数据。     

酪氨酸酶在不同被毛颜色羊驼皮肤组织中的表达与定位

【目的】研究酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)在不同毛色羊驼皮肤组织中的表达与定位,为揭示羊驼被毛颜色形成的机制奠定基础。【方法】采用半定量RT-PCR方法检测TYR mRNA在不同毛色羊驼皮肤组织中的相对表达量,采用免疫组织化学技术对TYR在羊驼皮肤中的表达进行定位。【结果】不同毛色羊驼皮肤组织中均有TYR基因mRNA的表达,有色被毛皮肤组织中TYR的基因mRNA表达量显著高于白色被毛组织的表达量;在有色被毛皮肤组织中,TYR阳性反应区主要集中于毛球部位,即毛根成形部;而白色被毛组织中,TYR阳性反应区主要位于毛根壶腹部及膨大部,即毛根永久部。【结论】综合分析TYR基因mRNA表达量及蛋白定位结果可知,TYR是成熟黑色素细胞的标记分子之一,羊驼毛色形成取决于成熟黑色素细胞在毛囊组织中的相对数量及分布部位。     

c-KIT在不同毛色山羊皮肤中的表达

为了研究c-KIT在不同毛色山羊皮肤组织中的表达与定位并探索c-KIT在毛色形成中的作用机制,以黑山羊、白山羊为研究对象,利用实时定量PCR技术分析其相对表达量,并采用免疫组织化学技术进行c-KIT表达定位分析。结果表明,在山羊皮肤组织中,c-KIT主要分布在皮肤上皮部、汗腺、皮脂腺、毛囊漏斗部以及内外根鞘。c-KIT在黑山羊、白山羊毛色皮肤组织中表达部位、表达水平无显著差异,表明c-KIT的表达量、表达部位不是造成黑山羊、白山羊色差异的主要因素。     

拟南芥ATMYB2转录因子的cDNA序列分析及其细胞定位

根据GenBank中收录的拟南芥At Myb2基因(GenBank登录号:AK229140)的cDNA序列设计1对引物,对拟南芥中叶片提取的总RNA进行扩增和克隆,并将拟南芥ATMYB2蛋白氨基酸序列进行同源性比较和蛋白定位分析.结果表明:At Myb2基因cDNA全长为816 bp,编码272个氨基酸和1个终止密码子,具有2个典型的MYB类转录因子基因的DNA结合区,分别为23-70、79-118位氨基酸,属于典型的R2,R3-MYB转录因子;经过氨基酸比对发现,拟南芥ATMYB2蛋白与水稻的ATMB18蛋白同源性最高,为44.60%.对拟南芥At Myb2基因进行RT-PCR扩增,结果表明基因片段未发生任何突变;通过拟南芥ATMYB2与EGFP形成融合蛋白对AT-MYB2进行了定位,发现ATMYB2蛋白在细胞核内能够表达,符合作为转录因子的表达特征.     

白色青年羊驼皮肤的基因表达分析

 【目的】研究羊驼皮肤功能发生的规律和机理以及发现新的功能基因。【方法】用SMART技术构建白色青年羊驼皮肤cDNA文库,随机挑取13 800个克隆进行规模测序。预处理后,获取高质量的表达序列。用CAP3对高质量序列进行拼接;BLAST对拼接序列进行同源比较,以注释功能;CLUSTER对已知序列进行聚类;根据标准基因词汇体系,并结合人组织基因表达谱分类标准,对具有注释信息的基因聚类进行分类,构建羊驼皮肤的基因表达谱。【结果】cDNA文库库容量达106PFU,从中获得高质量序列7 286条（在GenBank中命名为ASCD）。拼接成5 837条一致性序列,包括446条重叠群和5 391条单一序列。1 732条无相应注释,被认为是新基因。聚类成4 968个单基因簇（Unigene）。该基因表达谱最显著的特点是代表基本转录和翻译系统以及细胞骨架结构的转录本的表达丰度处于最高水平,原胶原I型（Procollagen typeI）等单个基因表达丰度处于较高水平。此外,还发现可能与羊驼毛质量、生长和毛色相关的基因。【结论】首次构建了羊驼皮肤cDNA文库和基因表达谱;获取的大量基因信息反映了青年期白色羊驼皮肤的生理特性和功能;该文库的构建是有效地发现新基因的理想资源。     

绵羊ACSL1基因cDNA序列克隆及其序列分析

为研究绵羊长链脂酰辅酶A合成酶1(Long-chain fatty acyl-Co A 1,ACSL1)基因功能,以绵羊肝组织总RNA为模板,应用RACE技术扩增得到了绵羊ACSL1基因完整的CDS区以及3'端序列,利用生物信息学软件对已知序列及其预测蛋白结构进行了分析。结果表明:绵羊ACSL1基因序列开放阅读框长为2 100 bp,共编码699个氨基酸,理论分子质量为82.76 ku,理论等电位点为5.38,为疏水性蛋白,无信号肽,不属于分泌蛋白,经序列对比发现其与牛和猪的同源性为97%。     

Polymorphism Analysis on Partial Sequence of Pig Obese Gene of Different Breeds by PCR-SSCP

Obese gene (ob gene) was identified in mouse adi- pose tissues in 1954, and it has an autosomal reces- sive genetic pattern[1]. Mouse ob gene is located on chromosome 6, whose mutation will lead to seriously genetic fatness. Human ob gene is mapped on q31…     

金龟子部分种类COI基因序列比较分析

对会龟总科(Scarabaeoidea)6种金龟子线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(COI)基因部分序列进行了PCR扩增和序列测定,并从GenBank中检索4个种的COI基因序列,比较其同源性并获得了长度为624bpCOI片段.10个种的COI序列分析结果表明:该基因序列共有440个变异位点,192个简约信息位点.表现出明显的A+T偏倚(63.6%).转换(TV)和颠换(TS)在科内、科间存在明显差异.科内种问TV+TS小,各科不同种与外群之问TV+TS较大;TV/TS则呈现相反的趋势.以黑蜣科(Passalidae)的具角黑艳甲(Odontotaenius disjuncttts)作为外群,采用P-distance法重建了10种金龟子邻接树(N-J)和最小进化树(ME)拓扑结构,结果表明:丽金龟属内科内、鳃金龟科内的不同种分别优先聚集,再与其他科相聚集,显示科内、属内的种间有较近的亲缘关系,说明COI基因序列可用来研究属内或科内种群的系统发育问题.     

猪HK2基因的克隆及序列分析

为克隆猪己糖激酶2基因,分析其生物功能,采用已报道的人及小鼠HK2的cDNA序列为依据,利用电脑克隆策略获得的ESTs设计引物,扩增新的猪HK2基因cDNA序列。将PCR产物克隆测序,分析获得的核苷酸序列及其编码蛋白的特性,分离的开放阅读框全长2754bp,编码917个氨基酸,与人和小鼠的核苷酸序列同源率分别为90%和87%,与人和小鼠的氨基酸序列同源率分别为96%和94%,利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其蛋白结构,为进一步开展猪HK2基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。     

银狐Gdf8基因cDNA的克隆与序列分析

根据已报道的犬科狗的Gdf8基因cDNA编码序列设计一对引物,利用RT—PCR技术扩增银狐的Gdf8基因cDNA的编码序列,将PCR产物连接到质粒pMD18-T载体上,然后转化到JM109大肠杆茵中,得到阳性克隆,同时进行序列的测定和分析。测序结果与已报道的Gdf8基因cDNA编码序列的大小相同,为1128bp。该序列与狗的同源性为99．2％,仅有9个核苷酸差异,推断的氨基酸序列仅有3个差异。