牦牛MSTN基因分子克隆及序列分析

设计特定引物对牦牛MSTN基因PCR分段扩增并克隆和测序,利用分子生物学软件进行序列拼接,获得牦牛MSTN基因序列(GenBank登录号EU926670).该基因由3个外显子和2个内含子组成,CDS序列全长为1 128 bp(GenBank登录号EU926671),由375个氨基酸组成.外显子大小分别为373,374,381 bp,内含子大小分别为1 843,2 028 bp.牦牛与普通牛的MSTN基因编码区中,在417位发生一次碱基转换(C→T),但未造成氨基酸改变.不同物种间在该基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列上有较高的相似性,牦牛与普通牛、绵羊、猪、人、狗、小鼠、马、兔子、鸡、猩猩各物种间核苷酸相似性大小分别为99.9％,96.5％,94.3％,89.1％,91.9％,91.3％,93.6％,91.7％,82.0％,92.0％.牦牛与普通牛MSTN氨基酸序列相似性最高,为100％;而与绵羊、猪、小鼠、人、狗、马、兔子、鸡、猩猩各物种间相似性大小分别为93.3％,95.5％,92.5％,94.1％,93.3％,94.9％,94.4％,88.0％,94.4％.生物信息学软件分析发现:牦牛MSTN基因编码蛋白的理论分子量约为42.6 kDa,PI值为6.14,Leu的含量最高(9.9％),其次是Lys(7.2％).牦牛MSTN基因编码蛋白二级结构以β折叠为主,属于跨膜蛋白,跨膜区位于AA6-AA23之间;具有一个分泌信号肽结构,其氨基酸序列MQKLQICVYIYLFMLIVA具有TGF-β家族的特征.     

新疆巴州牦牛Lfcin基因的克隆与分子特征

利用PCR技术首次从新疆巴州牦牛基因组DNA中扩增获得了乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)基因exon 2编码区,其中含有乳铁蛋白素(Lactoferricin,Lfcin)基因编码区序列;利用在线生物软件对Lfcin蛋白的结构进行预测.结果表明:克隆获得了含新疆巴州牦牛LF基因exon 2的DNA序列(GenBank:EU547256),共778 bp,其中LF基因exon 2编码区长165 bp,Lfcin基因编码区长75 bp;序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛该序列存在11个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性;各物种的Lfcin蛋白进化树符合物种进化规律;同源建模预测的Lfcin 3D模型显示,Lfcin为一段由α-螺旋和β-折叠组成的"U型"结构.首次从新疆巴州牦牛品种中克隆获得Lfcin基因编码区全长序列并揭示了其分子特征,为牦牛Lfcin蛋白基因工程和蛋白质功能方面的研究奠定了重要基础.     

八眉猪DQA基因编码区多态性及生物信息学分析

采用克隆测序的方法对八眉猪DQA基因编码区进行多态性分析,并利用生物信息学方法预测八眉猪DQA基因的理化特性及其编码产物的结构功能。结果显示:八眉猪DQA基因编码255个氨基酸,编码区序列有14个碱基变异,11个氨基酸变异,外显子2区域表现出丰富的多态性。DQA基因编码产物是一种不稳定的水溶性蛋白,二级结构为混合型,三级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成。蛋白质功能预测结果显示,信号转导、受体、胁迫应答、免疫应答和生长因子的几率较高。研究结果为八眉猪的抗病分子育种和经济性状相关基因筛选提供理论依据。     

牦牛LPL基因外显子7多态性与生长性状相关性的研究

采用PCR-SSCP技术对5个牦牛品种共398头牦牛脂蛋白脂肪酶基因(LPL)外显子7进行了多态性研究,分析了该基因与牦牛生长性状的相关性.结果表明,牦牛LPL基因外显子7存在2个等位基因3种基因型.各群体在该基因座上呈Hardy-Weinberg平衡状态.三种基因型与牦牛部分生长性状的最小二乘法分析表明,该位点多态与牦牛的体重、体高、胸围存在显著相关(P<0.05),BB型个体体重、体高、胸围显著高于AA和AB型个体.初步推断牦牛LPL基因第7外显子可作为牦牛标记辅助选择的遗传标记之一.     

越南油茶HMGCR基因的克隆及表达分析

为研究越南油茶(Camellia vietnamensis T. C. Huang ex Hu)中HMGCR (3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)基因的分子作用机制,本研究采用同源克隆得到HMGCR基因全长并命名为CvHMGCR,对其进行生物信息学分析及表达模式研究。结果表明,CvHMGCR全长1 800 bp,包括一个1 770 bp完整的开放阅读框,编码589个氨基酸,与茶树(Camellia sinensis)、毛柄连蕊茶(Camellia fraterna)、喜树(Camptotheca acuminata)、风铃辣椒(Capsicum baccatum)和三七(Panax notoginseng)的HMGCR蛋白序列相似度均在75%以上,系统发育树显示Cv HMGCR与茶树(Camellia sinensis)、毛柄连蕊茶(Camellia fraterna)和喜树(Camptotheca acuminata)的HMGCR蛋白序列聚为一支。预测其蛋白分子质量为63.1kD,理论等电点为6.37,有两个跨膜螺旋区,属于不稳定疏水性蛋白。序列比对分析表明,CvHMGCR有4个...     

牦牛MITF-M基因序列分析及其在皮肤组织中表达水平

研究牦牛MITF-M基因编码区序列及其编码蛋白的结构,以及其在皮肤组织中mRNA的表达水平,探讨MITF-M基因与牦牛毛色形成相关性,以期为揭示牦牛毛色形成分子机理奠定基础。采用RT-PCR技术扩增,成功获得了牦牛MITF-M基因编码区序列。采用生物信息学方法,预测分析MITF-M基因及其编码蛋白的基本理化性质、二级结构等;采用半定量PCR检测技术,检测出MITF-M基因mRNA在牦牛各组织器官中表达水平;通过荧光定量PCR技术检测出在牦牛不同颜色皮肤组织中MITF-M基因mRNA表达水平。结果表明,扩增得到的MITF-M基因的编码区是一条长为1 460 bp的DNA序列。将牦牛的MITF-M基因序列命名为YAK MITF-M,并且在NCBI数据库中注册该基因的登录号为KM985448。牦牛MITF-M序列基因含有一个长度为1 242 bp的开放性阅读框,编码413个氨基酸,二级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主,β折叠和延伸链较少。MITF-M基因编码产物氨基酸邻接系统树表明,牦牛MITF-M与黄牛、绵羊等物种的MITF-M氨基酸具有高度相似性。在牦牛各组织器官中,MITF-M基因mRNA仅在皮肤组织中特异性表达,且在不同毛色牦牛皮肤组织中,MITF-M在黑色被毛皮肤组织中mRNA表达量显著高于白色被毛皮肤组织(P0.01)。     

牦牛MSTN基因内含子Ⅱ遗传多样性研究

利用PCR-SSCP技术研究了5个牦牛群体共计401头个体的MSTN基因第2内含子的多态性.结果表明:牦牛MSTN基因第2内含子存在多态性,测序发现该片段第192 bp处有一个A 到G的单碱基突变.所检测的5个牦牛群体中,除新疆巴州牦牛群体未检测到AA基因型,其他4个群体中均发现AA、AB和BB 3种基因型,大通牦牛、甘南牦牛、青海高原牦牛群体中均以BB型为优势基因型,而天祝白牦牛和新疆巴州牦牛则以AB为优势基因型.不同牦牛群体中均检测到A,B两个等位基因,并且B基因频率均高于A基因频率,B等位基因为各牦牛群体中的优势等位基因.各群体经过χ~2检验,在该基因座上,甘南牦牛、天祝白牦牛、青海高原牦牛3个群体处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05),大通牦牛、新疆巴州牦牛两个群体处于不平衡状态(P＜0.05).分析了5个牦牛群体的遗传结构,发现大通牦牛的基因杂合度、有效等位基因数、多态信息含量等均最低,分别为:0.171,1.207,0.157;而天祝白牦牛的基因杂合度,有效等位基因数、多态信息含量等均最高,分别为:0.490,1.961,0.370;新疆巴州牦牛的基因杂合度、有效等位基因数、多态信息含量等均略低于天祝白牦牛.     

牦牛CAPN4基因启动子区突变对胴体及肉质性状的影响

为检测CAPN4基因在牦牛群体中的多态性,分析CAPN4基因启动子区突变对甘南牦牛胴体及肉质性状的影响,寻找与牦牛此类性状相关的分子遗传标记。采用PCR-SSCP技术检测830头甘南牦牛、大通牦牛和天祝白牦牛CAPN4基因启动子区突变并分析其多态性,运用SPSS 19.0软件中的GLM模型分析基因突变对甘南牦牛胴体及肉质性状的影响。牦牛CAPN4基因启动子区存在a.-1222GA的单碱基突变,检测到AA、AB和BB 3种基因型。相关性分析结果表明,a.-1222GA的突变对不同年龄甘南牦牛胴体和肉质性状有一定影响,其中4,6岁牦牛BB型个体熟肉率显著高于AA型或AB型(P0.05);3,6岁牦牛AB型个体失水率显著高于BB型或AA型(P0.05),而5岁牦牛BB型个体肌肉失水率显著高于AA型(P0.05);3,5岁牦牛BB型个体的眼肌面积显著高于AA和AB型(P0.05)。等位基因A对4,6岁牦牛熟肉率、各龄牦牛肌肉保水性和眼肌面积均存在不利影响;除5岁牦牛携带等位基因A个体的胴体重显著低于未携带者外,该突变对其他年龄段牦牛胴体重及全部牦牛个体的肌肉嫩度无显著影响。CAPN4基因启动子区a.-1222GA突变影响不同年龄段甘南牦牛部分胴体及肉质性状,可作为甘南牦牛此类性状的遗传标记。     

红褐色乌苏里貉和吉林白貉 KIT 基因第二外显子的克隆及多态性分析

选取野生型乌苏里貉、红褐色乌苏里貉和吉林白貉各3只为研究对象,利用克隆测序技术,得到长为276 bp的KIT基因第二外显子序列,分析其多态性及与其他物种的同源性。结果显示：红褐色乌苏里貉KIT基因第二外显子与犬、狐、家猫、虎鲸、野猪、马的同源性分别为97％,97％,92％,89％,87％,87％;对野生型乌苏里貉、红褐色乌苏里貉和吉林白貉KIT基因第二外显子序列进行对比分析发现,3种貉序列完全匹配,说明在此处未发生突变。     

烟台黑猪SLA-DQA基因编码区多态性及生物信息学分析

采用PCR-SSCP、克隆测序和生物信息学等方法对烟台黑猪SLA-DQA基因多态性进行研究,预测其蛋白质结构并分析其功能特征。结果显示:SLA-DQA基因exon 2、exon 3、exon 4分别检测出4种等位基因,5种基因型、6种等位基因,8种基因型、4种等位基因,7种基因型,包括3种新等位基因。SLA-DQA基因共编码255个氨基酸,编码区共发现32个核苷酸突变和13个氨基酸变异,exon 2多态性最为丰富。蛋白质结构预测结果显示二级结构中无规则卷曲和延伸链比例最高,α螺旋数量多且集中,β折叠最少。功能预测结果显示,SLA-DQA基因蛋白质在能量代谢、结构蛋白和生长因子等方面几率较高。本研究结果可为SLA-DQA基因在猪抗病分子育种中的应用提供理论依据。     

天祝白牦牛KAP1.1基因亚型B2A克隆及鉴定

通过对天祝白牦牛高硫角蛋白基因启动子B2A克隆得到其序列,将序列提交到NCBI,登录号:KJ910005,并对其进行生物信息学分析,通过亚细胞定位,磷酸化分析,二级、三级结构和保守结构域预测结果比较,MEGA 5.10软件进行NJ法进化树构建和Meg Align进行蛋白质相似分析来分析B2A基因与KAP1.1(Keratin associated protein1.1)基因的差异性。B2A基因的CDS区全长为471 bp,共编码156个氨基酸,二级结构含有延伸链、β转角和无规卷曲3种。B2A蛋白和KAP1.1蛋白的亚细胞定位,磷酸化分析,保守结构域,二级结构、三级结构和同源性差异较大。但是从功能预测结果显示2个蛋白功能完全一致,并且使用Clustal X进行氨基酸序列比对分析显示B2A蛋白从第33位开始相对于KA1.1蛋白有10个氨基酸的缺失以外,其余序列之间的保守性相当高。因此,可以证明B2A基因是KAP1.1基因的基因亚型。     

草莓果实多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是一类植物体内广泛存在的由核基因编码的能与铜结合的金属蛋白酶。它是诱导许多果蔬等农产品产生酶促褐变的主要原因,同时在植物的生长发育、抗病虫害及果实品质形成等方面也起到了一定的作用。本文用RACE的方法,从草莓幼果cDNA中成功扩增出PPO基因的3′端部分序列。序列分析表明该基因片段编码424个氨基酸。与其他物种PPO核苷酸序列比较相似性为72％-80％,氨基酸相似性为82％～87％。草莓多酚氧化酶基因的成功克隆,为草莓抗褐变的研究及果实品质的改良打下了坚实的理论基础。     

矮牵牛自交不亲和性基因sx的克隆及功能初步分析

利用NCBI、CODEHOPE、Primer Premier5.0等数据库和生物软件设计兼并引物,以矮牵牛花柱cDNA为模板,利用RT-PCR扩增到1条长为417 bp的序列,在GenBank中比对发现,该序列与SX基因相似性最高。然后以SX序列为模板设计特异性引物,RT-PCR扩增到1条全长为747 bp的目的片段,测序结果分析表明,该基因核苷酸序列开放阅读框全长660 bp,编码220个氨基酸,其中包括有22个氨基酸的跨质膜信号肽区,和5个保守区(C1-C5)以及2个高变区(Hva, Hvb),据前人研究所知,该基因具有S-核酸酶功能。同时,从番茄DNA中克隆到一长为717 bp的花粉特异性启动子LAT52。为了使SX基因能在花粉中发挥其S-核酸酶功能,去掉22个氨基酸跨质膜信号肽(命名为sx)之后,与番茄花粉特异性启动子LAT52嵌合构建植物表达载体并转化拟南芥。 TTC染色结果表明,LAT52能特异性的在花粉中调控sx基因的表达,使花粉活力很低甚至没有活力,从而使转基因植株不育。     

芥菜型油菜4-二氢黄酮醇还原酶基因的克隆和表达分析

利用同源克隆方法, 在芥菜型油菜中克隆了DFR基因。在DNA和cDNA中扩增的DFR基因大小分别为 1 612 bp和1 214 bp。该基因含有5个内含子, 开放阅读框为1 158 bp, 预计编码385个氨基酸, 预测分子量为42 886.0 Da, 推测的等电点为5.54。DFR基因在芥菜型油菜紫叶芥和黑籽近等基因系的叶片、胚和种皮中都表达, 在四川黄籽中只在叶片和胚中表达。DFR基因在四川黄籽种皮中不表达, 导致种皮中花色素和原花色素不能合成, 从而种皮透明, 形成黄籽, 因此DFR基因是油菜种皮颜色形成途径中一个关键基因。本研究为利用该基因与种子、种皮特异启动子构建反义表达载体或RNAi载体, 阐明油菜种皮颜色形成的分子机理和创造黄籽油菜新种质奠定了基础。     

牦牛血红蛋白β链基因多态性分析

研究采用PCR-SSCP技术对110 头牦牛血红蛋白β基因第2 外显子序列进行多态性分析,并对不同的等位基因进行测序,开展等位基因数、核苷酸多态位点、氨基酸多态位点分析。结果表明,110 头牦牛血红蛋白β基因第2 外显子共发现2 个等位基因,其中A为优势等位基因,A等位基因与B等位基因仅在外显子2 第58 位点存在A-T的变异,导致了丝氨酸（Ser）到苏氨酸（Thr）的变异,可能影响血红蛋白与氧的亲合力,是牦牛运氧能力较黄牛佳的原因。与黄牛血红蛋白β基因序列对比发现,牦牛的血红蛋白β链基因序列与黄牛血红蛋β链基因序列的同源性较高,高达98.94%。     

猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出PCV1ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-PCV1-ORF2并对其测序,结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与Genbank上发表的PCV1ORF2基因的同源性介于97.3%～99.9%,与PCV2-ORF2基因同源性介于67.9%～68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区域比较保守;抗原表位预测表明PCV1ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

三河马生长激素基因的克隆与序列分析

为进一步探明三河马遗传分化,参考牛(M57764)、羊(AF002110)、猪(M17704)、人(J03071)和鼠(X12630)等哺乳动物GH基因序列,设计一对特异引物,用PCR方法从三河马基因组中扩增出一条长约2kb的DNA片段。PCR产物经pGEM-Teasy载体转化感受态DH5α株大肠杆菌,获得重组克隆子。DNA测序表明:三河马生长激素基因DNA序列长1923bp,含完整的5个外显子和4个内含子,与猪、狗、牛、羊的GH的cDNA序列同源性分别为94.47%,92.63%,90.06%和90.37%。其cDNA所编码氨基酸与猪、狗、牛、羊同源性分别为97.21%,96.74%,88.84%和88.37%,表明该基因在进化过程中是保守的。     

高羊茅光周期调控基因CONSTANS的克隆与分析

本研究以坪用型"黔草1号"高羊茅为实验材料,基于多年生黑麦草CONSTANS(CO)基因序列设计引物,利用3'RACE和5'RACE方法扩增CO基因。结果表明,从高羊茅中分离出CO基因,命名为FaCON-STANS。经序列分析,cDNA全长1557bp,编码376个氨基酸,具有完整的开放阅读框(ORF,166～1296bp),氨基端具有B-box型锌指结构域,碳端具有CCT(CO,CO-like,TOC1)结构域。进一步的同源性分析表明,Fa-CONSTANS蛋白与禾本科植物的CO蛋白亲缘关系较近,与其它植物的亲缘关系较远。     

猪嵴病毒CH441株VP1基因的克隆与序列分析

为了深入研究嵴病毒(sw Ko V)主要结构蛋白基因VP1,根据Gen Bank中已发表的猪嵴病基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法扩增猪嵴病毒CH441株VP1基因,并对其进行克隆与测序分析。结果表明,sw Ko V CH441株的VP1基因为762 bp,与Gen Bank已发表的嵴病毒属的15株嵴病毒序列的VP1基因相比较,sw Ko V CH441株的VP1基因与其他各毒株VP1基因的核苷酸同源性为81.5%~90.2%,氨基酸同源性为86.6%~96.9%,进化分析显示,sw Ko V CH441株与GS-1株之间的亲缘关系较近。生物信息学分析显示,VP1蛋白理论等电点(p I)为4.40,理论分子质量为26.978 2 k Da;其序列上共发现18个磷酸化位点,分别为Ser(7)、Thr(6)和Tyr(5),而蛋白的磷酸化与信号转导有关,预测该蛋白为一重要的信号转导分子;无信号肽和跨膜区。为进一步开展sw Ko V CH441株VP1基因在遗传变异等方面的研究奠定了理论基础。