马氏珠母贝Rab7基因序列特征及其与耐低温性状的关系

Rab蛋白是膜泡运输过程中的重要调节因子,在囊泡运输和水产动物的免疫应答中行使重要功能。本研究鉴定了马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)的Rab7基因(Pm-Rab7),分析了Pm-Rab7在6个组织中及在温度胁迫(低温组17 ℃、对照组22 ℃、高温组32 ℃)下的表达模式,筛选和比较分析了马氏珠母贝耐低温选育系(low temperature resistant line, R) F3和北部湾野生群体(Beibu Gulf wild population, W)的Pm-Rab7外显子区的SNP位点。结果显示,Pm-Rab7序列全长为1 153 bp,5′端、3′端和开放阅读框(ORF)序列长度分别为30、505和618 bp,共编码205个氨基酸;Pm-Rab7具有一个RAB保守结构域,并与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)相似度最高(92.79%)。系统进化树结果显示,Pm-Rab7与太平洋牡蛎等软体动物聚为一支。Pm-Rab7在所检测的组织都有表达,其中在性腺和鳃中的表达显著高于外套膜和肝胰腺等组织(P<0.05)。Pm-Rab7温度胁迫后时序表达分析发现,在17 ℃低温组,Pm-Rab7的表达量呈先上升再下降的趋势,在6 h~3 d内均显著高于22 ℃对照组(P<0.05),在1 d时达到峰值;在32 ℃高温组,Pm-Rab7表达量总体稳定,仅12 h时显著高于对照组(P<0.05),其他时间点与对照组无显著差异(P>0.05);说明该基因的表达与马氏珠母贝对低温胁迫的响应密切相关。Pm-Rab7基因的外显子区域在马氏珠母贝耐低温选育系和北部湾野生群体中共检测到7个SNP位点,其中3个位点的基因型频率在2个群体间具有显著性差异,说明这些位点可能与其耐低温性状相关。结果表明,Pm-Rab7可能在马氏珠母贝耐低温适应过程中发挥重要作用,研究结果可为深入探讨马氏珠母贝对温度变化的环境适应性研究提供参考资料。     

马氏珠母贝激光育苗的研究

马氏珠母贝是培育海水珍珠的主要贝类。近年来,由于近亲繁殖,种群退化,贝体越来越小,致使培育的人工珍珠颗粒也越来越细。为了改良品种,培育出数量多、质量好的马氏珠母贝苗,我们从1982年起,进行激光育苗研究,并于1987年结合生产试     

马氏珠母贝TNFR27基因克隆与功能初探

肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)是一类重要的细胞因子受体,主要参与细胞凋亡、宿主免疫防御、炎症等生物过程。本研究采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了马氏珠母贝TNFR27(PmTNFR27)的cDNA全长并进行生物信息学分析,运用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测了PmTNFR27 mRNA在马氏珠母贝不同组织、脂多糖(LPS)、聚肌胞苷酸(Poly(I:C))及镉胁迫后的表达模式。结果显示：PmTNFR27 cDNA全长为1 524 bp,5′UTR长为186 bp,3′UTR长为248 bp,包含28 bp的poly(A)尾巴,开放阅读框(ORF)为1 062 bp,编码353个氨基酸;结构域预测表明PmTNFR27具有一个典型的CRD结构域和一个跨膜蛋白结构域,符合肿瘤坏死因子受体超家族特征;多序列比对结果表明贝类种间的相似性不高,但功能结构域位置较保守。系统进化树结果显示马氏珠母贝与其他贝类聚为一簇。qPCR结果显示,PmTNFR27 mRNA在马氏珠母贝各组织中均有表达,在鳃中表达量最高。LPS刺激后,PmTNFR27基因在鰓中的表达量于3 h达到最高,于72 h降到最低;Poly(I:C)刺激后,PmTNFR27基因在鰓中的表达量在6 h、12 h显著上升并达到最高至96 h时降到最低。镉胁迫后,3 h表达量达到最高,24 h、48 h表达量显著下降。研究结果显示PmTNFR27可能参与了马氏珠母贝的免疫应答反应。     

马氏珠母贝亲代选择对子一代的影响

研究了马氏珠母贝不同亲本规格对后代的影响,以期为育种和苗种生产中的亲贝选择提供科学的理论指导。试验从来自同一养殖群体的2000个随机个体马氏珠母贝中选取规格最大（壳长55.89±1.65mm）、中等（壳长48.55±0.81mm）、最小（壳长42.22±2.51mm）的性成熟个体各50个作为亲贝（♀∶♂=1∶1）,按规格分成大、中、小3组,分别进行各组内亲本个体群交,在相同环境及试验条件下分析亲本选择对子代生产性能的影响。结果表明,大规格亲贝优于中规格亲贝（P〈0.05）;中规格亲贝优于小规格亲贝（P〈0.05）;马氏珠母贝亲代选择对子一代生产性能具有显著影响（P〈0.05）。这表明马氏珠母贝大规格亲贝群交后代表现出明显的生长优势,截断选择策略有效。     

马氏珠母贝“南科1号”品系

马氏珠母贝,又称合浦珠母贝（Pinctada martensi Dunker,也有用Pinctada fucata Gould）,是生产海水珍珠的主要贝类。目前,我国培育“南珠”的主导品种为杂交贝或其后代,该贝虽然生长快、壳型大,但壳薄、软体部瘦小,插核后死亡率高、留核率低,不是适宜的植核母贝。     

马氏珠母贝人工育苗中的技术问题

近年来不少单位在马氏珠母贝育苗过程中因技术问题而使育苗效果差、经济效益低。为此笔者根据育苗实践谈几个技术问题。 1.亲贝和幼虫的优选 优选亲贝的标准是:3～4龄,活力强,外形完整,贝体厚大;生殖腺丰满,在足基处的两个乳头状突起较高,呈乳白色或橙红色,不透明,吸出的卵子放在载玻片上不易分散,卵子大小整齐,呈圆形或椭圆形,精子游动活泼。这样的亲贝育苗效果最好。幼虫的优选     

马氏珠母贝激光育苗机理的探讨

马氏珠母贝激光育苗，其产量比常规育苗增加１０倍以上，激光能增强精子的活力，提高精液品质，可影响卵子的通透性，使卵子新陈代谢中的某些反应发生良性变化。激光能抑制中致病菌及霉菌的生长，使受精卵发育成健壮的胚胎、幼虫、幼苗。所以，激光育苗是一种投产少，效益极高的育苗方法。     

马氏珠母贝EST微卫星的筛选

构建了马氏珠母贝的血液、足、鳃、胃、肝、心脏、外套膜、珍珠囊和感染多毛虫马氏珠母贝的血液(血感)等9个组织的cDNA文库,测序获得了6979个EST序列,从中查找到了268个重复序列,隶属于243个EST,含微卫星的EST数占EST总数的3.48%.珍珠囊cDNA文库含微卫星的序列所占比例最高,为6.16%,血感的最低,为1.65%.双碱基重复序列130个,占48.5%,(AT/AT)n类型最常见;三碱基类型的83个,占约31%,其中(AAT/ATT)n和(AAG/CTT)n较多;四碱基重复的有30个,占11.2%,(AAAT/ATTT)n占了该类型的约50%.一共能够设计151对微卫星引物,有130对可以扩增,占合成引物总数的86.09%,其中,多态性引物45对.多态性EST-SSR的筛选将为马氏珠母贝的分子遗传学研究、种质鉴定和野生资源保护等提供可靠的工具.     

马氏珠母贝精子的超低温保存

通过比较不同pH值（5．5-9．5）、不同盐度的海水等作为基础液对马氏珠母贝精子保存的影响,选择其中无激活精子作用又对其生理特性（活力,寿命,受精能力等）无影响者,加入二甲亚砜抗冻剂配制成超低温保存的抗冻保护液,精液与保护液按1：10和1：20的比例混合,样品按4组不同的降温程序平衡后转入液氮冷冻,比较其超低温冻存的效果。结果表明：以海水（pH7．5—8．0）为基础液,配制10％DMSO作为抗冻保护液,精液与保护液比例为1：20,在低温（0-4℃）中平衡约30min,在距液氮面15cm、5cm处分别停留5min、10min后转入液氮（-196℃）,冻存精子效果良好。冷冻24h、48h及5个月后,在38—40℃下水浴解冻复苏后,用终浓度0．25‰的氨海水刺激,精子存活率可超过60％,受精率可达80％。     

马氏珠母贝浮游幼虫不同阶段的选择效应

研究了在马氏珠母贝浮游幼虫期的选择效应,分别在担轮幼虫期和眼点幼虫期对幼虫进行了选育,以期通过在浮游幼虫期的选择来降低良种选育中的工作量和加快选育进程。试验结果表明,1)担轮幼虫早期上浮组比后期上浮组在D型幼虫孵化率上提高了5.1%,D型幼虫畸形率降低了10.1%;2)担轮幼虫早期上浮组在第17d的大小和成活率以及稚贝出池时的大小和育成率都显著地(P0.05)高于担轮幼虫后期上浮组;3)眼点幼虫早期附着组在稚贝出池时的大小和育成率上都显著地(P0.05)高于眼点幼虫后期附着组。研究结果表明对马氏珠母贝在幼虫浮游期的选择具有显著的效应(P0.05)。     

马氏珠母贝转录组数据的重新组装

对本实验室和其他学者已经发表的马氏珠母贝外套膜和珍珠囊的454焦磷酸测序转录组数据以及NCBI中的EST数据进行了重组装、同源序列比对和GO注释分析。重组装获得了30266个contig,平均长度522 bp,其中最长的contig为4144 bp;NR数据库BLAST分析获取了2310个相似性contig(E≤10?5),其中1902个在模式动物(人、小鼠、海胆、线虫、斑马鱼、果蝇或者太平洋牡蛎和珠母贝)中可以查找到同源序列。基因注释(GO)结果表明,注释到生物学过程的3846个contig可分为23个亚类,其中代谢过程蛋白、细胞过程蛋白和生物学调控蛋白为contig数量最多的3个亚类;注释到分子功能的4601个contig共分为11个亚类,其中结合蛋白的contig数量最多,其次是具有催化活性的蛋白和结构分子活性蛋白;注释到细胞成分的2992个contig分为17个亚类,其中细胞和细胞组成部分的contig数量最多,其次分别是细胞器和大分子复合体contig数量。本研究结果有助于开展外套膜和珍珠囊特异性表达基因的大规模筛选。     

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii) FBP基因的克隆及其对温度胁迫的响应

果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)是催化糖异生过程中的限速酶,当动植物处于温度胁迫等不良环境条件时,FBP通过参与糖异生途径以维持机体的糖平衡,在动植物抗逆过程中起着重要作用。本研究通过RACE技术获得了马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii) FBP(Pm-FBP)基因cDNA全长,并使用实时荧光定量PCR技术检测了该基因在马氏珠母贝不同组织中的表达量,以及在17℃(低温组)、22℃(对照组)、32℃(高温组)条件下鳃中的时序表达模式。序列分析显示,Pm-FBP全长为1381 bp,具有54 bp的5¢ UTR和62 bp的3¢ UTR,开放阅读框(ORF)为1020 bp,编码339个氨基酸,预测分子量为37.13 kDa,等电点为6.02。Pm-FBP具有一个Pfam FBPase保守结构域,6个潜在的O-连接糖基化位点(Ser36、Ser56、Ser57、Ser76、Ser80和Thr115),1个潜在的N-糖基化位点,1个金属结合位点(Asp-Pro-Ile/Leu-Asp-Gly/Ser-Thr/Ser)和46个磷酸化位点。多序列比对结果显示,Pm-FBP与长牡蛎(Crassostrea gigas)FBP的相似性最高,为83%;系统进化树显示,Pm-FBP与长牡蛎等贝类聚为一支,然后再与其他软体动物聚为一大支,节肢动物和脊椎动物分别聚类,进化树总体聚为三大支。实时荧光定量结果显示,Pm-FBP在所检测的闭壳肌、鳃、性腺、肝胰腺、足和外套膜等组织中均有表达,在性腺表达量最高,肝胰腺和鳃中有较高表达;对Pm-FBP时序表达的分析发现,Pm-FBP在低温组和高温组实验时间范围内均出现先上升后下降的趋势,且在72 h时达到最大值,表明Pm-FBP参与了马氏珠母贝对温度胁迫的响应;在120 h时,高温组和低温组的Pm-FBP表达量均显著下降,表明Pm-FBP可能主要在短期的温度胁迫中发挥作用。本研究结果为进一步探索马氏珠母贝对温度胁迫的适应性提供了参考资料。     

Purification and Characterization of an Antioxidant Protein from Pearl Oyster (Pinctada fucata martensii)

Protein from pearl oyster (Pinctada fucata martensii) was purified and characterized. Results showed that the pearl muscle protein (PMP) was composed of a single polypeptide with a molecular weight of approximate 11.6 kDa and contained 95.1% of the protein and 4.92% of the carbohydrate of the oyster. The polypeptide appears to be a glycoprotein, since the Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy of the PMP shows the typical characteristics of protein and polysaccharides. The denaturation temperature of the PMP was 81.3°C by differential scanning calorimetry. Circular dichroism spectroscopy showed that the PMP has a highly ordered structure. The PMP (200 μg/mL) showed a high oxygen radical absorbance activity (ORAC) of 6.57 μmol Trolox/μmol protein. Its antioxidant activity was stable at temperatures from 30–80°C and pH 2–10. The antioxidant activity was significantly inhibited by Zn²⁺, Ca²⁺, and EDTA and enhanced by Mn²⁺. The results suggest that the PMP could be used as a potential natural antioxidant.     

利用ITS和AFLP标记探讨中国、日本和澳大利亚3种珠母贝的亲缘关系

我国合浦珠母贝 Pinctada fucata 的命名较混乱,与日本的 P.fucata martensii 和澳大利亚的 P.imbricata 的分类关系存在争议。用 ITSs 序列和 AFLP 标记对这3个种的遗传关系进行了分析。结果表明这3个地理种的遗传分化很低,种内和种间的遗传距离相互重叠,AFLP 数据的聚类分析表明澳大利亚种群大部分个体单独聚合成一支,主成分分析结果相似。种问的遗传距离与分化程度与其地理距离呈正相关。分子方差结果也表明种间的差异较小,低于6%。这些结果表明这3个种实际上是同一物种。由于大西洋的 P.imbricata 与澳大利亚的不同,因此根据分类命名的优先原则,正确的种名应为 P.fucata。     

Estimating the heritability for growth-related traits in the pearl oyster,Pinctada fucata martensii (Dunker)

Twelve paternal half-sib families (or 36 full-sib families) of the pearl oyster, Pinctada fucata martensii (Dunker), were produced according to the requirements of hierarchical genetic mating design. A total of 4320 individuals, aged 15 months, were measured for seven growth-related traits. Predicated upon the additive-dominance genetic analysis model, varying genetic variance components and then heritabilities of the growth-related traits of interest were estimated using analysis of variance. Results showed that seven growth-related traits had larger additive genetic variances (P<0.05); the dominance genetic variance of shell weight (SW) was smaller (P>0.05), the dominance genetic variances of other six traits were all larger (P<0.05). Narrow- and broad-sense heritabilities for the seven traits were, respectively, 0.64 ± 0.10 and 0.78 ± 0.12 for shell length, 0.49 ± 0.06 and 0.63 ± 0.09 for shell height, 0.38 ± 0.14 and 0.54 ± 0.16 for shell breadth, 0.41 ± 0.17 and 0.56 ± 0.11 for hinge length, 0.53 ± 0.11 and 0.68 ± 0.08 for body weight, 0.35 ± 0.07 and 0.55 ± 0.08 for tissue weight and 0.67 ± 0.10 and 0.75 ± 0.16 for SW. All heritability estimates were statistically significant (P<0.05). According to these results, the mass selection procedure is suggested for the breeding of P. martensii.     

Effects of replacing microalgae with an artificial diet on pearl production traits and mineralization‐related gene expression in pearl oyster Pinctada fucata martensii

The effects of replacing dietary microalgae with artificial diet on pearl production traits and biomineralization‐related gene expression were investigated in pearl oyster (Pinctada fucata martensii). Three experiment groups (EG1, EG2 and EG3) were set. EG1 and EG3 were separately fed Platymonas subcordiformis and artificial diet (D4), respectively, and EG2 was fed with mixed P. subcordiformis and D4. A control group (CG) was cultured in natural sea. All groups were continuously fed for 150 days. The results showed that the survival rates of EG1, EG2 and EG3 were significantly higher than that of CG. No significant differences in retention rate and pearl thickness were observed among the four groups, but CG had the lowest values of both parameters. The relative expression levels of EGFR and FGF18 mRNA did not significantly differ among EG1, EG2 and EG3. Moreover, the relative expression levels of GHITM and TβR I mRNA significantly varied among the groups and EG3, and EG1 had the highest and lowest relative expression levels of GHITM and TβR I mRNA respectively. The relative expression levels of nacrein and chitin‐binding mRNA significantly differed among the groups, and EG1 had the lowest expression levels of nacrein and chitin‐binding mRNA. No significant differences in the relative expression levels of MSI60 and TIMP mRNA were observed among the groups. The results suggested that D4 can replace part of microalgae, which is helpful for further studies on developing artificial diet of pearl oyster.