枇杷果实总RNA的提取及八氢番茄红素合成酶基因(PSY)片段的克隆

【目的】为从枇杷果实中提取高质量的RNA,【方法】以枇杷果实为材料,对6种总RNA提取方法进行分析和比较。【结果】结果表明,在裂解前先用70%丙酮和80%乙醇分别对枇杷果皮和果肉进行预处理,再结合CTAB-LiCl法,得到的总RNA质量较好,OD260/OD280在1.8～2.2,OD260/OD230超过2.0,得率分别为幼果果皮56.78μg.g-1,幼果果肉40.62μg.g-1,成熟果果皮40.86μg.g-1,成熟果果肉9.24μg.g-1;并根据其他植物的八氢番茄红素合成酶基因(PSY)保守区设计引物,用以上方法提取的RNA为模板进行RT-PCR,得到453 bp的基因片段,其推导的氨基酸序列与其他植物的同源性高达95%,推测该片段为PSY基因。【结论】先用70%丙酮和80%乙醇分别对枇杷果皮和果肉进行预处理,再结合CTAB-LiCl法,得到的RNA质量好,可用于后续的分子生物学研究。     

香蕉果实特异表达启动子驱动下的乙肝表面抗原基因植物表达载体的构建

研制经济方便的新型乙肝植物口服疫苗是全球控制乙型肝炎的现实要求。研制乙肝植物口服疫苗遇到的一个主要的困难是HBsAg基因在受体植物中的表达量低。香蕉是植物口服疫苗理想的受体。因此,以香蕉为受体,进一步提高HBsAg基因表达量的研究非常必要。从pBIL2载体上克隆了香蕉果实特异表达的BanLec启动子,并引入了HindⅢ、BamHⅠ酶切位点;利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切YEPFLAG-HBS获得了HBsAg基因;通过BamHⅠ酶切位点,利用T4DNA连接酶连接了BanLec启动子和HBsAg基因,形成BanLec-HBsAg连接片段;再把该片段通过EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点插入pCAMBIA2300植物表达载体,成功构建香蕉果实特异表达启动子驱动下的乙肝表面抗原基因表达载体。     

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体的构建

应用反义RNA技术抑制甜瓜成熟过程中内源乙烯的合成,从而培育耐贮运品种是解决甜瓜延熟保鲜难题的可行新方法。根据GenBank中甜瓜、黄瓜ACC合成酶基因氨基酸保守序列设计引物,从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到约0.7kb的ACC合成酶cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为777bp,编码258个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

番茄花药特异表达启动子LAT52的克隆与表达载体构建

采用半巢式PCR方法,从番茄基因组中扩增出了花药特异表达启动子LAT52。该序列与GenBank公布的同源序列相似度达98％,并鉴别到一个TAAAAAA简单重复序列。     

番茄花药特异表达启动子LAT52的克隆与表达载体构建

采用半巢式PCR方法,从番茄基因组中扩增出了花药特异表达启动子LAT52。该序列与GenBank公布的同源序列相似度达98％,并鉴别到一个TAAAAAA简单重复序列。将LAT52启动子与GUS基因拼接,构建成了双元表达载体。     

K~+、Mn~(2+)对番茄果实中番茄红素积累及其关键酶基因表达的影响

为探讨利用外源物质调控番茄果实中番茄红素积累的机制,以高代自交系番茄为材料,进行K~+、Mn~(2+)处理后对其果实不同转色期的番茄红素及其相关酶的基因表达量进行动态监测。结果表明:K~+处理下的番茄红素含量在果实进入半熟期后积累迅速,至完熟期明显高于对照,K~+处理下各种酶基因表达量的变化与番茄红素含量积累规律一致,在果实发育坚熟期至完熟期PSY1(八氢番茄红素合成酶1)、PSY2(八氢番茄红素合成酶2)、PDS(八氢番茄红素脱饱和酶)、ZDS(ζ-胡萝卜素脱饱和酶)基因的表达量增加,该阶段的番茄红素含量也迅速积累;Mn~(2+)处理下果实番茄红素含量一直低于对照,其番茄红素积累迅速期在果实坚熟期至完熟期,Mn~(2+)处理下果实转色5个时期的PDS、ZDS基因表达量均明显低于对照。Mn~(2+)抑制了PDS、ZDS的表达从而降低了番茄红素含量的积累;然而,Mn~(2+)处理下番茄果实坚熟期至完熟期PSY1、PSY2基因表达量迅速升高,促使番茄红素含量在该阶段迅速积累。本研究说明番茄果实发育坚熟期至完熟期可通过K~+调控而使该阶段的番茄红素含量迅速积累,可通过使用外源物质来调控番茄果实中番茄红素的含量。     

番茄microRNA基因沉默载体的构建方法

该试验提出了一种简单且快速构建番茄中人工miRNA表达载体的方法,以包含miR319a前体骨架的质粒pRS300为模板,以重叠PCR技术来扩增miR1917的前体。miR1917的靶基因是LeCTR1,是乙烯反应中的一种负调控因子。含有miR1917的重组前体成功地转化到表达载体pGreen0029-35s中,通过植物根癌农杆菌C58介导的叶盘法成功获得了转基因植株。此种方法可为番茄中miRNA的作用机理研究提供一定的理论基础。     

银杏GinNdly基因的植物表达载体构建

未知功能的植物基因一般需要通过转基因植物来研究和验证。银杏(Ginkgo biloba L．)是一种童期很长的古老植物，LEAFY基因是一个花分生组织特征基因，调控着植物开花的时间。用植物双元表达载体质粒pCAMBl-Al301构建了开花基因，LEAFY的银杏同源基因GinNdly的反义与正义植物表达载体。因pCAMBlAl301质粒的多克隆位点处没有启动子和终止子，将pB1121的35S启动子和nos终止子引入该质粒。通过PCR检测和酶切验证，证明质粒构建正确，为研究银杏花分生组织特征基因GinNdly奠定了基础。     

LEAFY基因植物表达载体的构建

本研究采用植物中间表达载体pBll21构建拟南芥花分生组织特性基因-LEAFY基因的植物表达载体。LEAYY基因带有植物组成型启动子-CαMV35S。该表达载体的构建为利用LEAFY基因进行木本果树遗传转化创造了条件。     

甜瓜果实酸性转化酶基因反义表达载体的构建(英文)

应用RNA反义技术抑制甜瓜果实发育过程中酸性转化酶活性,促进蔗糖积累,从而为培育优质品种提供了可行的新方法。将已克隆到pMD18-T载体上的甜瓜酸性转化酶基因用BamHⅠ和HincⅡ双酶切,得到该基因编码区1038bp的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的BamHⅠ/SmaⅠ克隆位点,构建了甜瓜酸性转化酶cDNA反义表达载体(Anti-MAI1)。采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。利用叶盘法转化烟草,经PCR和PCR-Southern杂交检测,证明此基因已整合入烟草的核基因组中。     

番茄果实特异性LYC-B 干扰载体的构建及在不同颜色果实中的表达特异性验证

为了研究番茄LYC-B 干扰对类胡萝卜素合成主要酶和主要代谢产物的影响,构建了果实特异性的番茄红素β- 环
化酶LYC-B 干扰载体,并验证了其在不同颜色番茄果实中的有效性。依据X13437.1 扩增番茄果实特异启动子E8,构建了果
实特异性载体E8-pBI121,其在粉色、红色、绿色和紫色的番茄果实中均能表达。依据X86452.1 扩增番茄LYC-B 从61～861
bp 间长度为801 bp 的片段LYC-B1 和从 480～781 bp 间长度为302 bp 的片段 LYC-B2,构建了以CaMV 35S 为启动子的LYC-B
干扰表达载体pBI121-B1B2,以E8 替换CaMV 35S,构建了果实特异性干扰载体E8-pBI121-B1B2。采用农杆菌注射法分别
侵染番茄叶片和果实,GUS 染色显示,pBI121-B1B2 在叶片、果实和种子中均表达,E8-pBI121-B1B2 只在果实和种子中表达。     

矮牵牛CHS基因启动子克隆、序列分析及植物表达载体构建

应用PrimerPremier5.0软件,根据GenBank数据库报道的查尔酮合成酶基因启动子序列(EF199747)设计1对特异性PCR扩增引物,以矮牵牛品种‘午夜蓝色’叶片总DNA为模板,用TaqDNA聚合酶成功扩增出1条约0.5kb的DNA片段,回收该片段并连接到pMD18-T载体上。结果表明:经测序该启动子片段长550bp;bl2seq分析结果表明该启动子与目标序列相似性高达100%;PLACE在线分析显示在克隆片段中含有TATAbox、CAATbox、capsite、antherbox、box1、box2、Gbox及TACPyAT-box等顺式元件;并构建了矮牵牛CHS基因启动子融合标记基因GUS的植物表达载体pPhCHS::GUS。     

多心室番茄果重遗传规律的研究

应用2个番茄自交系材料多心室和少心室进行正交、反交及回交,应用数量遗传学原理分析各世代的遗传效应.结果表明:多心室番茄果重遗传受多基因控制的数量遗传,其遗传效应符合加性-显性遗传模型,其中以加性效应为主,显性方差所占分量极小,属于不完全显性;控制果重的最少基因数目约是2对.多心室番茄果重狭义遗传力为36.36%.     

评价番茄砧木组培苗对南方根结线虫的抗性

对引自意大利的番茄抗性砧木进行组织培养并鉴定其组培苗对南方根结线虫的抗性。结果表明:砧木组培苗与砧木实生苗相比对南方根结线虫的抗性显著下降,但与对照合作908相比抗性仍较高,差异达显著水平;砧木组培苗嫁接合作908后的抗性与没有嫁接的组培苗抗性变化一致。抗性砧木及组培苗接种南方根结线虫后与没有接种的植株生长势差异不显著,而合作908在接种南方根结线虫后生长势受到明显抑制。     

成都番茄青枯菌生理分化和品种抗性鉴定

初步鉴定出成都地区番茄青枯菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）属小种１，并根据其对不同寄主的致病力不同进一步划分成４个致病类型；还用３个不同菌株接种鉴定了成都的６个主要番茄栽培品种的青枯病抗性，结果表明６个品种均不抗青枯病，属高感品种     

不同授粉处理对pat－2／pat－2基因型番茄结实性的影响

以具有单性结实基因型的Ｓｅｖｅｒｉａｎｉｎ（ｐａｔ－２／ｐａｔ－２）和Ｍｏｎａｌｂｏ（ｐａｔ－２／ｐａｔ－２）及其非单性结实的姊妹系Ｍｏｎａｌｂｏ（＋／＋）为试验材料，研究了在４种不同授粉处理下的坐果率、单果重、产籽量及单株产量等方面的差异。结果表明：具有ｐａｔ－２／ｐａｔ－２基因型的番茄材料在不授粉条件下仍能坐果且果实正常膨大，而普通基因型番茄材料则不能坐果；但在正常授粉条件下，ｐａｔ－２／ｐａｔ－２型番茄产籽量低于其普通型姊妹系；就同一ｐａｔ－２／ｐａｔ－２型番茄而言，未经授粉的坐果率、单果重、单株产量等方面的一项或两项仍在不同程度上低于其正常授粉处理，其差异幅度及表现形式因材料不同而异；蕾期授粉可对ｐａｔ－２／ｐａｔ－２型番茄材料的坐果和产量产生较明显的促进作用     

等渗Ca(NO_3)_2和NaCl对番茄幼苗生长的影响

等渗Ca(NO3) 2 和NaCl溶液对番茄幼苗具有不同的盐效应。 2 8、 56mmol/LCa(NO3) 2 溶液对其生长的抑制作用小于等渗的NaCl溶液 ,而 84mmol/LCa(NO3) 2 溶液对幼苗生长的抑制程度与等渗的NaCl溶液无显著差异。Ca(NO3) 2 主要通过渗透胁迫影响植株生长 ;而NaCl主要通过离子胁迫抑制植株的生长 ,包括细胞质膜结构的破坏和K吸收的减少。     

番茄转ER-sHSP基因植株构建及其抗冷性研究

 将CaMV 35S启动子驱动的内质网小分子热激蛋白基因导入番茄, 比较转基因、未转基因和转空载体番茄的抗冷能力。冷胁迫下, 同对照相比, 转基因番茄的冷害症状轻, 叶绿素含量的损失少, 体内积累的丙二醛(MDA) 含量少, 电解质外渗程度低, 具有较高的净光合速率和最大光化学效率, 并易于恢复由低温所引起的光抑制, 表明转基因番茄具有较强的冷胁迫耐性, 说明内质网小分子热激蛋白在植物抗冷过程中发挥重要作用。     

外源亚精胺(Spd)对盐胁迫下番茄幼苗生理生化指标的影响

以耐盐性不同的2个番茄品种江蔬14号（耐盐性较弱）和白果强丰（耐盐性较强）为试验材料,采用叶面喷施亚精胺（Spd）,共4个处理（营养液＋0mmol／LNaCl＋0mg／LSpd、营养液＋0mmoI／LNaCl＋100mg／LSpd、营养液＋100mmol／LNaCl＋0mg／LSod、营养液＋100mmoL／LNaCl＋100mg／LSod）下．研究了外源亚精胺对番茄幼苗生理生化指标的影响。结果表明：喷施Spd能降低番茄幼苗叶片的相对电导率、丙二醛（MDA）和游离脯氨酸（Pro）的含量,在盐胁迫下其降低作用更明显;两个品种相比较,Spd对盐胁迫下耐盐性较弱的江蔬14号作用效果更明显。Sod还能调节叶片内过氧化物酶（POD）的活性,使之在盐胁迫下变化更稳定;提高番茄幼苗的根冠比,对干物质积累量,叶绿素a、b的含量也有明显的影响,但是因处理时间的累积和品种不同而产生不同的作用效果。     

黑龙江省番茄根结线虫病病原鉴定及抗病种质资源筛选

对黑龙江省大庆市温室内的番茄根结线虫进行形态鉴定和苗期抗病性鉴定技术研究,结果表明该线虫为南方根结线虫;采用接种苗龄３０ｄ（天）,接种深度１０ｃｍ,接种量５０００条·株－１,接种天数５０ｄ（天）为最佳组合。用该鉴定方法对１８份番茄材料进行苗期抗根结线虫病鉴定,筛选出免疫材料２份,高抗材料４份,强抗材料４份,中抗材料２份,微抗材料１份,其余５份为易感材料。