蓝猪耳的养护及病虫害防治技术

概述新潮奥运花卉蓝猪耳生产过程中的技术要点.详细介绍蓝猪耳常见病虫害,如苗期猝倒病（立枯病、枯萎病）、枯萎病、叶斑病、丛枝病、白粉病、炭疽病、病毒病、蓟马、蜗牛、红蜘蛛、蚜虫、斑潜蝇、鳞翅目螟类害虫的病征、病状和防治措施.     

根癌农杆菌介导蓝猪耳转化系统的建立

 通过对影响根癌农杆菌介导蓝猪耳转化效果各种因素的研究, 建立了蓝猪耳高效稳定的遗传转化系统。研究结果表明, 农杆菌侵染叶片外植体效率最高; 外植体预培养不利于农杆菌的侵染; 乙酰丁香酮能大大提高根癌农杆菌转化蓝猪耳的效率。另外, 菌液浓度、侵染和共培养的时间及再生的途径等均对转化效率有一定的影响。叶片外植体与农杆菌共培养后, 经过抗性芽的诱导、根的再生, 70 d左右就可以获得抗性苗。抗性植株经GUS染色、PCR分析和Southern blot检测, 外源基因已经整合到蓝猪耳基因组中, 转化频率为7%～8%。     

蓝猪耳花器官的发生与发育

玄参科植物蓝猪耳（Torenia fournieri）的萼片、花冠、雄蕊和雌蕊原基都具两侧对称性,且为合萼、合瓣花,雄蕊着生在花冠上,子房两心皮两室。花器官分化顺序为萼片、雄蕊原基、花瓣原基、雌蕊原基。5枚萼片原基发生顺序不一致,其式样为近轴面1原基－远轴面2原基－2侧生原基,萼片原基的发育是同步的;雄蕊原基先于花瓣原基发生,但其发育比花瓣原基缓慢,4枚雄蕊原基几乎同时发生;5枚花瓣原基同时发生,且远轴面的两枚花瓣原基后来有愈合迹象。与同科Agalinis densiflora花发育比较,两种植物花器官原基发生的时间和先后顺序有较大的差异。与同科地黄属（Rehmannia）、苦苣台科（Gesneriaceae）异叶苣苔属（Whytockia）、尖舌苣苔属（Rhynchoglossum）和台闽苣苔属（Titanotrichum）的花器官发生和发育比较,发现玄参科和苦苣苔科的花器官发生和发育关系比较复杂,5属并不能笼统划分为两种不同的式样,认为以子房室数和胎座类型划分玄参科和苦苣苔科的可靠性仍需进一步探讨。     

蓝猪耳45S rDNA的荧光原位杂交作图及其核型分析

 以番茄45S rDNA为探针,结合核型分析和荧光原位杂交(FISH)技术,对蓝猪耳染色体的核型以及45S rDNA在染色体上的定位进行了研究。结果表明,蓝猪耳染色体的核型为1A型,核型不对称系数为57.46,染色体相对长度变异范围为4.455% ～ 6.990%,最长染色体与最短染色体的比值为1.57,染色体相对长度组成为 2L + 4M2 + 12M1,核型公式为2n=2x=18=14m + 4sm (2SAT)。在蓝猪耳体细胞有丝分裂中期染色体和间期核中,均发现45S rDNA有2个杂交信号,且信号在有丝分裂中期位于第5对染色体短臂的近着丝粒处。基于上述结果绘制了蓝猪耳染色体的核型图。     

香菇ras和gpd启动子的克隆与功能鉴定

以香菇基因组DNA为模板,利用PCR技术克隆了香菇1个ras启动子Lras,2个gpd启动子Lgpd1和Lgpd2.这3个启动子的大小分别为715bp、1056bp和611bp,与已报道的ras和gpd启动子的同源性很强.对这3个启动子的分析结果表明,它们都含有丰富的启动子顺式作用元件.将这些启动子片段分别与GUS基因连接构建了表达载体,并将这些表达载体导入草菇菌丝体中,检测其活性,最终显示3个片段都有启动GUS基因表达的能力,其中Lgpd1启动子活性最强,Lras启动子次之,Lgpd2最弱.     

异源韧皮部特异启动子在转基因枳中的表达

为了筛选在柑橘韧皮部中特异表达的启动子,构建GRP、Rolc、RSSl异源韧皮部特异启动子控制GUS报告基因的植物表达载体,转化枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]上胚轴。GUS组织化学染色分析表明,3个启动子均显示了维管束组织特异性。其中,GRP启动子活性强,且具有严格的韧皮部组织特异性;Rolc启动子活性最强,在根和茎中呈组成型表达;RSSl启动子活性最弱。Real-time RT-PCR和GUS酶活性分析进一步证明了GRP启动子具有较强的韧皮部组织特异性,该启动子有望应用于柑橘抗黄龙病基因工程育种。     

甜瓜CmACOⅠ启动子组织特异性表达研究

 为进一步明确甜瓜果实软化的分子机理,构建了ACC氧化酶Ⅰ基因（CmACOⅠ）启动子与GUS基因融合的植物表达载体,采用根癌农杆菌介导法转化甜瓜‘甘甜一号’。通过卡那霉素抗性和 PCR检测筛选呈阳性的转化植株,取不同组织进行X-Gluc染色。结果表明,转化植株的根、茎、叶、花、果实等器官组织经X-Gluc染色后,只在花药组织和成熟果果皮中出现蓝色斑点,其余组织均未检出,表明甜瓜CmACOⅠ启动子能够驱动GUS基因在转基因甜瓜花药和成熟果果皮中特异表达。     

‘嘎啦’苹果MYB12基因启动子的克隆与功能分析

以‘嘎啦’苹果基因组为模板,用PCR方法扩增得到苹果MYB12基因启动子(ProMYB12)。利用在线分析网站Plant CARE和PLACE对启动子上存在的顺式作用元件进行了预测。构建pCAMBI0390-ProMYB12-GUS植物瞬时表达载体并转化农杆菌,瞬时转染野生型番茄Micro-Tom(Lycopersion esculentumcv.Micro-Tom)用以研究启动子的启动活性。结果表明:克隆获得的启动子长度为1 290bp。启动子序列中存在大量的顺式作用元件,既有转录必备的TATA-box和CAAT-box,也存在非生物胁迫和植物激素响应元件以及大量的光调控元件,此外还存在一些组织特异性表达元件。‘嘎啦’苹果MYB12启动子驱动的GUS基因在番茄的花和种子处有较高的表达量,表现出一定的组织特异性。     

柑橘CsTBL1启动子的克隆及其在转基因拟南芥中的活性分析

以奥林达夏橙[Citrus sinensis(L.)‘Olinda’]为材料,克隆了CsTBL1基因编码起始位点上游长度为2 361 bp的启动子序列。生物信息学预测表明,该启动子中含有多个与逆境应答相关的顺式作用元件。为进一步分析CsTBL1启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用浸花法转化拟南芥,对T3代转基因拟南芥进行GUS活性染色。结果显示,CsTBL1启动子在1～3 d龄幼苗所有组织中的活性都非常强,在7～20 d龄幼苗的子叶和根中的活性仍然较强,但在下胚轴中基本检测不到活性。在50 d龄幼苗中,只在叶、茎的毛状体以及还在生长的根中检测到GUS活性。转基因植株的GUS表达受到1–氨基环丙烷–1–羧酸(乙烯合成前体,ACC)、脱落酸(ABA)、甲基茉莉酸(MeJA)和水杨酸(SA)诱导。上述结果表明CsTBL1可能在植物发育和抗外界逆境胁迫中起到非常重要的作用。     

柑橘CsHB1启动子的克隆及功能分析

以‘伏令夏橙’叶片基因组DNA为模板,克隆了CsHB1启动子5′端转录起始位点上游分别为1 741 bp和1 613 bp的区域序列。序列分析表明这两个启动子区序列相似度为90.7%,存在141 bp的差异片段,该差异片段中含有2个Box4元件。通过PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测,结果表明CsHB1的不同启动子序列含有多种响应元件,如胚乳特异性元件、分生组织表达元件、光反应元件、热应激反应元件、MYB结合位点等。为进一步分析CsHB1启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体prCsHB1::GUS,并用农杆菌介导法转化拟南芥,获得prCs HB1-1::GUS拟南芥纯合材料13株和prCs HB1-2::GUS拟南芥纯合材料10株。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色鉴定,结果表明两类启动子表达载体已成功转入拟南芥中并进行了表达,其表达部位主要集中于愈伤组织和花药中,而在种荚、叶片及幼苗中未检测到GUS蛋白的表达。     

萝卜遗传转化体系的建立

系统研究了影响根癌农杆菌介导的萝卜(Raphanus sativus L.)遗传转化的若干因素,建立了萝卜遗传转化体系:即切取萝卜带柄子叶外植体,先进行2 d预培养,用OD600为0.3~0.5的EHA105农杆菌菌液侵染5~7 min后,再进行5 d共培养,然后将外植体转接到MS+6-BA 6 mg.L-1+NAA 0.05 mg.L-1+Cef 500 mg.L-1的培养基上进行7 d延迟筛选,再将外植体转接到MS+6-BA 6 mg.L-1+NAA 0.05 mg.L-1+Cef 500 mg.L-1+Hyg 5 mg.L-1的培养基上进行10 d的抗性筛选。结果共获得126个抗性芽,其中8个抗性芽经PCR检测扩增出目的基因的启动子BcA9,约850bp,阳性率为6.3%,初步验证目的基因已经转入萝卜再生芽中。     

橙色大白菜遗传转化体系的初步建立

以06J28橙色大白菜子叶段为外植体,通过根癌农杆菌介导CMS7311-orf224基因,探讨了潮霉素、头孢霉素、预培养时间、农杆菌浓度、感菌时间和共培养时间等因素对橙色大白菜遗传转化的影响.试验结果表明,子叶段预培养2~3 d后,在OD600值为0.3~0.5的农杆菌EHA-105菌液中侵染5 min,再共培养2~3 d,在培养基中加入5 mg/L Hyg (抗性筛选)和500 mg/L Cef(脱菌)可得到转化植株.试验初步建立了橙色大白菜遗传转化体系,为大白菜种质资源创新奠定了基础.     

农杆菌介导的百合遗传转化体系的建立

 通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法, 建立了凝望星空百合(Lilium ‘Star Gazer’) 愈伤组织和西伯利亚百合(Lilium ‘Siberia’) 叶片的遗传转化体系。试验结果表明: 以愈伤组织和叶片为受体, 均能取得较理想的转化效果; 根癌农杆菌OD600介于0.5～1.0时, 能获得较高的转化率; 40 mg·L ^{- 1}的潮霉素对愈伤组织和叶片有很好的筛选效果; 在共培养培养基中, 去除NH₄NO₃对提高百合转化效率有极显著的效果。对转基因百合进行PCR检测, 结果表明gus基因已整合到百合基因组中。     

番茄micro-TOM 活体再生体系的建立

番茄micro-TOM 是生物学研究的模式植物，它的离体再生体系对遗传转化及发育生物学研究至关重要。但是micro-
TOM 组培再生体系费时费力，容易污染。本试验通过对活体植株进行去头去腋芽诱导，建立了高效快捷、不依赖外源激素
的番茄micro-TOM 活体再生体系，为简化番茄遗传转化奠定了基础，也为植物再生机理研究提供了良好的实验材料。     

根癌农杆菌介导寒富苹果转化体系的建立

以寒富苹果组培苗叶片为外植体,利用植物表达载体上含潮霉素抗性基因的根癌农杆菌EHA105(pCAMBI-A1301)和含卡那霉素抗性基因的根癌农杆菌EHA105(pCAMBIA2301)对影响寒富遗传转化效率的因素进行系统研究。结果表明,寒富叶片对潮霉素反应敏感,在附加潮霉素的培养基上寒富叶片褐化较为严重。潮霉素和卡那霉素适宜的筛选质量浓度分别为4 mg.L-1和25 mg.L-1。农杆菌介导寒富苹果转化体系的建立以MS+TDZ 2.0 mg.L-1+NAA 0.5 mg.L-1培养基为叶片离体再生芽培养基。适宜的转化条件为:菌液浓度D 600nm=0.5、叶片外植体在菌液浸泡8 min、共培养时间为3～4 d、推迟4 d进行筛选培养。抗性基因对转化效率具有明显的影响,EHA105(pCAMBIA2301)的平均抗性芽再生率(0.96%)比EHA105(pCAMBIA1301)的平均抗性芽再生率(0.58%)高出几乎50%,EHA105(pCAMBIA2301)的抗性芽再生率最高达1.87%。GUS组织化学染色和PCR鉴定结果表明本研究获得了寒富苹果转基因植株。     

梨糖转运相关基因PbTMT4启动子克隆及功能分析

以‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri‘Dangshan Suli’)为材料,利用梨基因组数据库,通过PCR获得了糖转运相关基因PbTMT4(Pbr032130.1)2 211 bp的CDS序列及其编码起始位点上游长度为1 220 bp的启动子序列。使用农杆菌介导法将PbTMT4导入拟南芥,与野生型对照植株相比,转基因拟南芥植株的生长速度更快,抽薹、开花时间更早,叶片糖积累量更高。生物信息学分析表明,该启动子中含有多个与逆境应答、激素信号和光信号相关的顺式作用元件。为进一步分析PbTMT4启动子功能,构建了该启动子与GUS基因融合的植物表达载体并转化拟南芥。对T_3代转基因拟南芥各组织进行GUS活性染色和半定量分析,发现GUS基因在根、茎、叶、花和果荚中均有表达,NaCl、干旱、GA_3、MeJA以及光照处理均能一定程度上提高转基因拟南芥中GUS基因的转录水平。逆境处理发现,PbTMT4转基因株系较野生型植株受到的伤害小。研究结果初步表明,PbTMT4可促进转基因拟南芥发育并提高糖积累量,可能在抗非生物胁迫中起重要的调控作用。     

莴苣高效瞬时表达体系的建立

 以GUS基因作为报告基因, 利用农杆菌真空渗透法, 采取正交试验设计对莴苣(Lactuca sativa L. sp) 的瞬时表达条件进行研究, 建立了高表达水平的瞬时转化体系(乙酰丁香酮200 μmol /L、菌液密度OD₆₀₀值0.8、真空处理30 min、共培养6 d) 。应用结果表明: 优势组合的表达水平比对照的表达水平提高16.3倍。