黄瓜SRAP反应体系的正交设计优化

采用正交试验设计方法,对影响黄瓜SRAP反应体系的5种因素(dNTP、模板DNA、引物、Taq聚合酶及变性剂)4个水平进行优化筛选,确立了适合黄瓜SRAP分析的优化反应体系,即在10μL PCR反应体系中含有1μL 10×PCR buffer,150μmol/L dNTP,30 ng模板DNA,0.3μmol/L引物、1.5 U Taq聚合酶,PCR产物变性时用10μL变性剂。     

大龙虎泡野生日本沼虾遗传多样性分析

为了深入了解本地日本沼虾的遗传特性,为育种选育提供理论支撑,利用微卫星分子标记技术,对大龙虎泡日本沼虾进行遗传多样性比较分析。结果显示,12个微卫星位点均属于高多态性位点(PIC>0.5);太湖2号养殖群体的等位基因数为4～11,有效等位基因为3.686 4～7.480 5,观测杂合度为0.318 2～0.833 3,期望杂合度为0.744 9～0.884 8;各位点的多态性为0.691 9～0.851 7,属于高遗传多样性的群体。大龙虎泡野生群体等位基因数为1～2,有效等位基因为1.00 0 0～2.000 0,观测杂合度为0.000 0～1.000 0,期望杂合度为0.000 0～0.517 2,各位点的多态性为0.000 0～0.375 0,属于遗传多样性较低的群体。2个群体均有7个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡,大龙虎泡野生群体另出现3个位点无法进行Hardy-Weinberg平衡检验。太湖2号养殖群体的7个位点表现出来的是杂合子缺失,大龙虎泡野生群体的7个表现的是杂合子过剩。分子方差分析显示,有36.15%(P<0.01)的遗传变异来源于群体间,而6...     

利用正交设计优化烟草SRAP反应体系

利用正交设计L16(45)对烟草SRAP-PCR反应体系的五因素(Taq酶,Mg2 模板DNA,dNTP,引物)在四个水平上进行优化试验,PCR结果用统计软件SPSS V13.0分析,得出如下结论:各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中Taq酶量影响最大;筛选出各反应因素的最佳水平,建立烟草SRAP-PCR反应的最佳体系(25μL)为:Taq酶1.0 U,Mg2 1.5 mmol/L,模板DNA 30.00～120.00 ng,dNTP0.1 mmol/L,引物0.40 μmol/L.最后,应用烟草SRAP-PCR最佳反应体系对PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了筛选,得出SRAP-PCR扩增以52℃退火温度、35个循环次数为最佳.这一优化系统的建立为今后利用SRAP标记技术对烟草进行基础研究提供了一个标准化的程序.     

花生SRAP-PCR反应体系的正交设计优化

本研究利用正交设计L16(45)对花生SRAP-PCR反应体系的5因素(引物,Taq酶,Mg2+,模板DNA和dNTP)在4水平上进行优化试验,结果表明,各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中引物浓度的影响最大;最佳反应体系20μL包含:引物0.4μmol/L,Taq酶1U,Mg2+2.5mmol/L,模板DNA30ng,dNTP0.2mmol/L,不足部分以ddH2O补足。这一体系的建立为今后利用SRAP标记技术对花生进行分子遗传学基础研究提供了有力的支持。     

丁香酚对日本沼虾麻醉效果的研究

研究了丁香酚对日本沼虾的麻醉效果。在不同浓度(100,200,300,400和500mg/L)和不同温度(17,22和27℃)条件下,观察日本沼虾的麻醉状态和苏醒状态,然后对试验数据进行统计分析。结果表明(P<0.05):日本沼虾进入麻醉状态所需的时间(麻醉时间)随丁香酚浓度的升高而缩短,随麻醉温度的升高而缩短;苏醒所需时间(苏醒时间)随丁香酚浓度的升高而加长,随麻醉温度的升高和而缩短;苏醒后第14d统计,各实验组存活率均为100%。多重比较结果表明(P<0.05):对于麻醉效果的影响,不同的麻醉浓度之间存在显著差异,不同的麻醉温度之间也存在显著差异;对于恢复效果的影响,麻醉浓度100mg/L和200mg/L之间的差异不显著,浓度400mg/L和500mg/L之间差异也不显著,麻醉温度17℃和22℃之间差异不显著,其他两两相互比较,差异均显著。研究表明,丁香酚对日本沼虾的麻醉效果良好,是一种合适的麻醉剂。     

酶解制备日本沼虾游离精子方法的研究

为了获得数量多且存活的游离青虾精子,首次采用胰蛋白酶消化日本沼虾精荚的方法,获得了游离日本沼虾的精子。通过观察游离精子形态,并经台盼蓝染色,以每克精荚所获得形态正常、结构完整且不被染色的存活精子数为依据,探究胰蛋白酶处理的最佳条件。在p H 7.1的条件下,设计三因素四水平正交试验,设置不同酶浓度(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)、处理时间(5 min、10 min、15 min、20 min)和处理温度(30℃、35℃、40℃、45℃),根据正交试验结果确定酶处理最佳反应条件。结果表明,酶浓度对获得游离精子影响最大,其次是处理温度和处理时间。酶处理的最适条件为:酶浓度0.8%,处理时间10 min,处理温度40℃。经优化验证试验,表明上述理论组合确为最佳组合。本研究通过酶解法获得较多数量的存活游离精子,为进一步研究日本沼虾精子提供了获得游离精子的方法。     

正交设计优化青蒿SRAP-PCR反应体系及引物筛选

为了建立青蒿的SRAP最佳扩增体系,并筛选出SRAP多态性引物,本研究以青蒿叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg^2+、dNTP Mix、Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板5种因素5个水平,对青蒿SRAP反应体系进行研究。结果表明,青蒿SRAP-PCR最佳反应体系为:引物0.6μmol/L、Mg^2+2.0 mmol/L、模板DNA 5.1 ng、Taq DNA聚合酶2.0 U、dNTPs 0.25 mmol/L,总体积为25μL。各因素对扩增反应均有不同影响,其中引物浓度的影响最大,dNTPs的影响最小。运用该体系对不同种质资源的青蒿进行验证,证明该体系稳定可靠,并在30个引物组合中筛选出了25对扩增条带清晰,多态性丰富的引物组合。这一结论为今后利用SRAP标记技术进行青蒿分子遗传学研究提供了科学依据。     

日本沼虾捕捞后保活试验初报

对影响日本沼虾存活的几大因素,包括存养密度、水温、水中溶解氧、氨氮、呼吸强度等进行了探讨.从多个方面深入了解各个因素对日本沼虾存活的影响程度并总结出相对合理的保活条件.     

应用正交设计建立芍药的SRAP反应体系

为快速建立优化的芍药SRAP扩增反应体系,应用L25(56)正交表,研究了Taq、Mg2+、随机引物、dNTPs和DNA模板5种反应组分的浓度变化对SRAP扩增结果的影响,直观分析和稳定性检测结果表明:正交设计可高效建立优化稳定的芍药SRAP反应体系;用该法建立的芍药SRAP-PCR优化反应体系为:25μL反应体系中含10×PCR Buffer(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.3,500 mmol/L KCl)2.5μL,MgCl22.5 mmol/L,dNTP各0.25 mmol/L,引物各0.3μmol/L,TaqDNA聚合酶1 U,DNA模板120 ng。     

X射线灭活活体日本沼虾精子的初步研究

为检测X射线对日本沼虾精子的灭活效果,利用X射线对雄性日本沼虾进行不同时间的照射处理,将处理后的雄虾与刚完成生殖脱壳的雌虾交配。待雌虾产卵后,计数雌虾抱卵天数,并在显微镜下观察卵的畸形情况。X射线管照射强度为100 k V,5 m A,源距10 cm,照射时间为0、30、60、90、120 min。结果发现:照射30 min组的抱卵天数及卵的畸形率较0 min组无变化,卵的畸形率为0,卵能正常发育至孵化出膜。随着照射时间的增加,在30~90 min之间,雌虾抱卵天数逐渐减少,且所抱卵的畸形率呈上升趋势。照射120 min组的抱卵天数较90 min组变化不大,卵的畸形率达100%。在本试验照射时间范围(0~120 min)内,灭活日本沼虾精子遗传物质的最佳照射时间为90~120 min。     

不结球白菜SRAP反应体系的建立与优化

以菜薹基因组DNA为模板,通过正交试验设计,从Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物及模板5种因素4个水平对不结球白菜SRAP反应体系进行优化,建立了适合不结球白菜的SRAP-PCR优化反应体系.利用该优化体系,选用30对芸薹属SRAP引物,对5份不结球白菜的基因组进行扩增,筛选出7对具有2条以上特异扩增条带的SRAP引物,验证了该优化体系的稳定性.     

利用正交设计优化牡丹SRAP-PCR反应体系

利用正交设计L16(45对牡丹SRAP-PCR反应体系的五因素(Taq,Mg2+,模板DNA,dNTP,引物)在四个水平上进行优化试验,得出如下结论:各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为:Tap,引物,dNTPs,Mg2+,模板DNA;筛选出各反应因素的最佳水平,建立牡丹SRAP-PCR反应的最佳体系(25μL)为:Taq酶0.5 U,Mg2+2.0 mmol/L,模板DNA 50 ng,dNTF 0.2 mmol/L,引物0.30 μmol/L.这一优化系统的建立为今后利用SRAP标记技术对牡丹进行相关研究提供了帮助.     

木薯SRAP扩增体系的建立与优化

建立适宜木薯DNA的SRAP扩增体系,为木薯分子标记和基因图谱的构建打下基础。以木薯基因组DNA为模板,采用序列相关扩增多态性(sequence related amplified polymorphism,SRAP)技术对木薯DNA进行PCR扩增,逐级优化反应参数。最佳SRAP-PCR反应体系(10Ll)为：DNA (50ng/μl) 0.5μl、10×PCR buffer (Mg2+) 1.0μl、dNTPs (20mM) 0.2μl、primer (50ng) 0.3μl、Taq polymerase (5U/μl) 0.2μl。该程序和体系能很好地满足木薯基因组SRAP扩增的要求,SRAP标记能够很好应用于木薯遗传研究。     

龙眼SRAP反应体系的建立和优化

采用分步优化的方法对影响龙眼SRAP-PCR反应的模板DNA用量、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、TagDNA聚合酶用量等进行了研究。确立了适合龙眼SRAP分析的反应体系,即体系总体积25μl,包含1×PCR Buffer ,Mg2+ 2.0mmol/L,dNTPs 0.5 mmol/L,引物0.3μmol/L,模板DNA 10ng, TaqDNA聚合酶1.5 U。结果表明,该体系能很好地满足龙眼基因组SRAP扩增的要求,SRAP标记应用于龙眼遗传研究是可行的。     

余甘子SRAP反应体系的优化

本文报道通过正交设计和单因素优化实验建立余甘子SRAP-PCR优化体系。实验表明PCR反应各因素（模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物）对扩增结果均有不同的影响。采用50 ng模板DNA,2.0 mmol?L-1 Mg2+, 0.4 mmol?L-1 dNTPs, 0.3 μmol?L-1 引物的20 μL反应体系可扩增出最清晰丰富的多样性条带。使用该优化体系检测12份余甘子种质资源样品,结果稳定可信,适用于分子遗传研究。     

芦笋SRAP反应体系优化及引物筛选

本研究以芦笋基因组总DNA为模板,通过对芦笋SRAP反应体系的重要参数进行优化,建立了一套适用于芦笋的SRAP反应体系:25μL的反应体系中,模板DNA量80ng、Mg2+浓度3.0mmol/L、上下游引物各0.2μmol/L、dNTPs0.3mmol/L、Taq DNA聚合酶1U以及1×Buffer。扩增程序为:94℃预变性3min;94℃30s、35℃30s、72℃1.5min,5个循环;然后退火温度提高到50℃,35个循环;最后72℃延伸10min。比较琼脂糖凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SRAP扩增产物的多态性,结果发现:6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物比琼脂糖的效果好。利用该优化体系筛选引物,从256个SRAP引物组合中筛选出239个,它们具有扩增条带清晰、丰富、重复性好的优点,证明了此优化体系稳定可靠。     

桃SRAP-PCR反应体系的建立与优化

建立适宜桃基因组DNA的SRAP-PCR扩增体系,为桃基因图谱的构建和分子标记打下基础。以桃基因组DNA为模板,通过正交试验设计,从dNTPs、Mg2+、Taq酶、引物、模板5种因素4个水平对桃SRAP-PCR反应体系进行优化,所建立的体系为25μL:dNTPs为0.12 mmol/L,Mg2+为4 mmol/L,Taq酶2 U,引物为0.3 mmol/L,模板DNA50ng。PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性l min,35℃复性l min,72℃延伸l min,5个循环;94℃变性l min,50℃复性l min,72℃延伸l min,35个循环,72℃延伸10 min。