潍坊某猪场一起伪狂犬病的诊治

2014年9月山东潍坊某猪场发生疑似猪伪狂犬病疫情,采集病死仔猪的脑组织等,利用Vero细胞做病毒分离,并设计一对伪狂犬病病毒(PRV)gE基因片段的特异性引物对分离病毒进行PCR鉴定及家兔接种试验.结果表明:脑组织上清液接种Vero细胞后有典型的细胞病变;PCR扩增产物电泳后显示出990bp长的目的片段,目的片段基因序列与6株PRV毒株的gE基因序列核苷酸同源性在97.7％～ 100％之间,证实该病毒为PRV;分离病毒接种家兔出现典型的伪狂犬病症状.临床诊断结合实验室鉴定以及动物接种试验,确诊该病例为猪伪狂犬病.     

猪伪狂犬病病毒流行株gE基因的遗传变异分析及其对仔猪致病性的初步研究

[目的]了解我国猪伪狂犬病病毒流行株 gE基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性。[方法]利用 Vero 细胞从疑似伪狂犬病病毒（PRV）引起的流产死胎猪的脑组织进行病毒分离。通过PCR进行初步鉴定,对分离株 gE基因序列进行系统进化树分析以及该病毒对6周龄左右仔猪的致病性试验。[结果]成功分离到1株 PRV 毒株,命名为 PRV N5B 株,该病毒能在 Vero 细胞上增值,在15代 TCID50达到107.125/0.1 ml;PCR检测可扩增出特异性条带;gE基因全长1740 bp,系统进化树分析表明分离株与2012年以来新流行的毒株属于同一个相对独立的分支,核苷酸同源性高达99.7%～100%;而与以往发表的国内外相关序列比较,在2个不同的位置分别有3个连续碱基的插入。动物试验表明,2 ml的该病毒（106/0.1 ml）滴鼻接种能使6周龄左右仔猪100%死亡。[结论]该研究中的 PRV N5B分离株 gE基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性试验对于目前流行的猪伪狂犬病的防控及新的疫苗的研发提供理论依据。     

表达PRRSV NADC30-like毒株GP5-M的重组伪狂犬病病毒的构建及其生物学特性探究

为获得一株能够融合表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)GP5-M蛋白的重组伪狂犬病病毒PRV-GP5-M毒株，以猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)变异株TK基因缺失株PRV FJ01/TK-为病毒载体，以gI/gE基因为插入靶点，利用同源重组技术和CRISPR/Cas9技术敲除gI/gE基因，并在gI/gE位置上插入CMV-GP5-M表达盒，经噬斑纯化，成功构建能够正确表达GP5-M蛋白重组病毒PRV-GP5-M。进一步对该毒株的稳定性、生长动力学、培养特性、安全性等生物学特性进行探究。结果表明，该重组毒株具有良好的遗传稳定性、安全性，易于增殖培养。研究结果为靶向PRRSV GP5与M蛋白生成新的PRRSV疫苗提供了新的线索，同时可为预防近些年流行的PRRSV NADC30-like毒株和PRV变异株的疫苗研发提供重要参考。     

猪伪狂犬病毒湖北株gE基因的克隆与序列分析

[目的]通过对从湖北省某猪场分离获得的伪狂犬病毒的gE基因克隆和测序,分析其遗传变化规律。[方法]参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies Virus,PRV)gE基因的序列设计1对引物,对PRV湖北株gE基因进行PCR扩增和序列分析,PCR产物克隆到pMD 18-T载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,与GenBank收录的国内外其他地区的标准参考毒株进行同源性分析和比较。[结果]与标准参考毒株的核苷酸序列同源性为95.0%~98.0%,进化树分析表明,PRVHBXS2014株与河南焦作株EU561349-China同属于一个分支,亲缘关系较近,但存在个别位点的基因突变。[结论]为有效防控该病提供参考。     

河北免疫猪场猪伪狂犬病病例的诊断

为了对河北某免疫猪场发生的疑似猪伪狂犬病进行确诊,并针对猪伪狂犬病毒开展进一步的研究工作,本试验对该猪场送检的病猪进行剖检,将其脾、肺、肾及淋巴结的混合研磨液经PK15细胞接种分离,后经PCR扩增及动物回归试验,证实成功分离的病毒为伪狂犬病毒(PRV),并命名为SH151218。根据GenBank上传的PRV及其gE基因序列,设计了1对检测引物以及1对扩增gE基因的引物,并对其gE基因进行了序列分析,SH株属于GI亚型,与哈尔滨变异株同源性最高,所分离的PRV毒株为变异强毒株。此变异株的发现对PRV变异机制的研究及研制新疫苗提供了基础。     

大肠杆菌外膜蛋白A在原核表达载体中的克隆表达

对大肠杆菌的外膜蛋白A基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达,为大肠杆菌重组疫苗的构建奠定基础.以大肠杆菌分离株308-2菌株基因组DNA为模板,用PCR法对基因ompA进行扩增,产物与T载体连接,经测序鉴定正确后与表达载体pET32a(+)连接构建表达ompA的重组质粒,将此重组质粒转化入表达宿主E coli Ros...     

江西省猪伪狂犬病原流行病学调查及其gB、gE及TK基因遗传变异分析

为了解江西省猪伪狂犬病原流行情况及遗传变异情况,对2017—2018年收集的疑似伪狂犬样品,以1对针对猪伪狂犬病毒gE基因的检测引物进行病原检测,并随机挑选15株PRV阳性样品,对PRV病毒复制必需的糖蛋白gB基因和主要毒力基因gE与TK基因克隆测序及遗传进化分析,用以探究其遗传变异关系。临床结果显示:猪伪狂犬病毒检出率由2017年的4.76%PRV gB/gE/TK全基因序列遗传进化分析结果表明:调查的15株伪狂犬病毒毒株与中国株处于同一分支,与美国株Bartha差异较大。核苷酸同源性分析结果表明:15株PRV gB基因相互间同源性为98.9%～100%;与参考毒株的gB基因的同源性96.7%～100%;gE基因相互间同源性为99.1%～100%;与参考毒株的gE基因的同源性98.1%～100%;TK基因变异相对较小,相互间同源性为100%,与参考PRV毒株的gE基因的同源性99.1%～100%。研究结果表明,gB基因和gE基因存在较多的变异,可能是当前流行毒株抗原变异及毒力增强从而使现有疫苗免疫保护力不佳的主要原因。     

犬瘟热病毒N基因原核表达质粒的构建

为了对N蛋白表达作为诊断用抗原、检测犬瘟热病毒(CDV)特异性抗体提供参考依据,以已构建的含犬瘟热病毒N基因的pMD18-N质粒为模板,利用特异性引物进行PCR扩增,得到1572 by的N基因开放阅读框,将所得N基因克隆至经相同双酶切处理后的pET32a(+)原核表达载体中,获得重组质粒pET32a(+)-N,并转化至...     

猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI缺失突变株的构建及生物学特性研究

【目的】为研制针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的疫苗提供候选毒株。【方法】构建针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的gE/gI缺失重组转移质粒pMD-LA-RA及携带EGFP标记基因的重组转移质粒pMD-LA-EGFP-RA,将pMDLA-EGFP-RA与伪狂犬病病毒流行毒株PRV AH进行同源重组,利用EGFP为筛选标记,获得携带EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–/EGFP~+,以此毒株与pMD-LA-RA进行第2次同源重组,筛选去除EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–,并通过生长曲线、易感细胞连续传代和动物免疫评价其增殖能力、遗传稳定性及免疫原性。【结果】通过2次同源重组,结合荧光观察、空斑纯化和PCR检测,成功获得了PRV AH gE~–/gI~–,经PCR鉴定、荧光观察及测序鉴定,证实该毒株g E和g I基因被成功缺失,且不携带EGFP标记基因。生物学特性研究结果表明,该毒株增殖能力与亲本毒株相当,遗传稳定性及免疫原性良好。【结论】采用同源重组技术成功构建了免疫原性良好的猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI基因缺失突变株,为研制针对流行毒株的基因缺失疫苗奠定了一定的基础。     

猪伪狂犬病毒C株的分离鉴定

在流行病学调查中分离到的1株伪狂犬病毒,命名为猪伪狂犬病毒C株,并对其进行鉴定、纯化。在gE和gI基因段上设计特异性引物进行PCR检测,闽A株在5 000 bp处出现目的条带,该毒株在1 500 bp附近出现目的条带,对目的条带测序,扩增产物大小为1 538 bp,在第989—4 468位基因缺失,缺失片段大小为3 570 bp,该缺失片段包含了伪狂犬病病毒的主要毒力基因(gE基因),除此缺失片段外,分别在第873、4 665、4 666、4 950位发生了碱基突变,同猪伪狂犬病病毒Bartha K61同源性为95.0%—96.0%,与PRV Bartha K61不是同一个毒株。用该毒株对部分省市分离到的伪狂犬毒株和标准毒株闽A株进行中和试验,中和指数为708—6 761,该毒株可完全中和临床分离的伪狂犬病毒株,故可用作候选疫苗毒株。     

绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

 为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a（+）构成重组子,经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达绿色荧光蛋白,经15% SDS PAGE鉴定,结果显示：重组质粒pET32a AcGFP1中的AcGFP1序列与Clontech公司的pIRES AcGFP1质粒的AcGFP1序列完全一致,表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因AcGFP1的原核表达质粒。此外,pET32a AcGFP1转化Rosetta（DE3）,经不同浓度的IPTG诱导,SDS PAGE检测均获得高效表达,为今后构建pET32a(+) TAT AcGFP1融合表达载体以及深入研究TAT的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。     

OsMAPK4基因的原核表达及蛋白纯化

构建OsMAPK4基因的原核表达载体,对表达产物进行鉴定和纯化,为转OsMAPK4基因植株后期的Western Blot检测提供抗原。用PCR方法从本实验室已构建的植物表达载体pUM4上扩增OsMAPK4基因,将其克隆至pET32b原核表达载体,构建重组载体pET32b-MAPK4。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,用Western Blot进行蛋白鉴定。结果表明,原核表达载体构建正确;SDS-PAGE分析及Western Blot鉴定中,均出现了与DNAMAN预测的43.6 ku大小一致的蛋白条带;得到纯化蛋白。成功构建了OsMAPK4基因的原核表达载体,得到纯化蛋白,为转OsMAPK4基因水稻植株体内蛋白表达活性的检测提供了抗原。     

红鳍东方鲀去乙酰化酶SIRT3基因的克隆及原核表达

从红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肝脏组织中提取总RNA,通过RT–PCR扩增,获得SIRT3基因的编码阅读框(ORF),用原核表达载体p ET32a(+)构建p ET32a/SIRT3重组质粒,用异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)将重组质粒p ET32a/STRT3在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示,红鳍东方鲀SIRT3基因(tr SIRT3)ORF区大小为1 263 bp大小,编码420个氨基酸。经IPTG诱导表达后,获得1个带组氨酸(His)标签的融合蛋白,目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了相对分子质量约66 000的重组蛋白。     

金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因的克隆及其原核表达(英文)

[Objective] The study aimed to clone the FnBP ligand binding gene of Staphylococcus aureus and run prokaryotic expression by constructing a prokaryotic expression vector. [Method] The gene encoding FnBP ligand binding gene was amplified from S.aureus chromosomal DNA by PCR technique. After T-A cloning, plasmid pMD18- FnBP was constructed. pMD18- FnBP and pET28a(+)were digested by BamH Ⅰ and EcoR Ⅰ double enzymes, then the purified FnBP ligand binding gene was subcloned into the expression vector pET28a(+), and the prokaryotic expression vector pET28a-FnBP was thus constructed. The constructed plasmid pET28a-FnBP was transformed into Escherichia coli BL21(DE3) competent cells. The bacterium was induced by IPTG and the expressed products were analyzed by SDS-PAGE and Western blot. [Result] The gene fragment with the length of 370 bp was amplified by PCR approach. One approximately 30 kD exogenous protein was observed in SDS-PAGE analysis. Western blot analysis indicates the protein has antigenicity of S.aureus. [Conclusion] The FnBP ligand binding gene of S.aureus was successfully cloned and expressed in prokaryotic cells.     

金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因的克隆及其原核表达

[目的]克隆金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因,并构建原核表达载体,进行原核表达：方法]设计引物,采用PCR方法扩增FnBP配体结合区基因,BA克隆后,构建了克隆质粒pMD18-FnBP。用BarnHI和EcoRI双酶切pMD18-FnBP和pET28a（＋）,将纯化的基因FnBP亚克隆至pET28a（＋）,构建重组表达质粒pET28a-FnBP,并将其转化至大肠杆茼感受态B121（DF3）中,IPTG诱导表达,并对表达产物进行分析。[结果]PCR扩增出1条约370hp的目的片段,表达产物经SDS-PAGE分析,在30kDa处出现了与目的蛋白一致的外源蛋白带．Westem blot分析表明该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性。[结论]已成功构建了FnBP配体结合区基因,并在原核细胞中表达。     

猪肠球菌溶血素cylA基因原核表达载体的构建

以猪致病性粪肠球菌染色体DNA为模板,PCR扩增溶血素cylA基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET32a中,构建pET32a-cylA重组质粒,并将pET32a-cylA质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)。经HindⅢ、XhoI双酶切及测序鉴定,并与已发表的肠球菌溶血素cylA基因序列比较,同源性达99.8%。表明成功构建猪肠球菌溶血素cylA基因的重组表达质粒,为制备单抗、开发疫苗及其致病机制研究奠定了基础。     

牛A组轮状病毒VP4全基因的克隆与原核表达

以G6型牛轮状病毒总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增牛轮状病毒VP4开放性阅读框,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pEASy-T3载体中,成功构建出克隆质粒pEASY-T3-VP4.经双酶切后再将该基因重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建出原核表达质粒pET32a-VP4.将pET32a-VP4转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约108 KD的融合蛋白带,成功构建了能够稳定表达VP4蛋白的基因工程菌株,为进一步研制牛轮状病毒基因工程疫苗奠定了基础.     

大肠杆菌原核表达载体pSBET-His的构建

为了构建原核表达载体pSBET-His。pSBETa质粒经XbaI和BamH I限制性内切酶双酶切,获得原核表达载体的骨架。以pET28a(+)为模板,通过高保真PCR法应用T7 promoter引物和T7 terminator引物对pET28a(+)载体T7表达区域进行扩增,PCR产物电泳纯化后经双酶切和纯化获得138 bp含His-Tag序列的片段。将pSBET原核表达载体骨架和含有His-Tag序列的片段进行连接后转入DH5α感受态细胞中,经菌落PCR及酶切筛选构建pSBET-His。成功构建了pSBET-His原核表达载体。应用该载体表达的蛋白质,可采用镍离子亲和层析法进行纯化。该研究为应用pSBET-His载体进行烟草丛顶病毒ORF4的原核表达研究奠定了基础。     

牦牛铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建及其表达研究

【目的】为解决医用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)来源的限制,利用基因工程方法构建牦牛Cu,Zn-SOD原核表达系统,为重组牦牛Cu,Zn-SOD作为注射用药奠定基础。【方法】RT-PCR扩增牦牛Cu,Zn-SOD编码基因,构建Cu,Zn-SOD/pET22b(+)重组表达载体,并转化到E.coli BL21(DE3)宿主菌,经IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE、活性染色及邻苯三酚法进行检测,采用BradFord方法测定融合蛋白浓度。【结果】本试验成功获得了牦牛Cu,Zn-SOD cDNA,长456bp,编码152个氨基酸。与普通牛SOD编码基因序列cDNA一致率为99.6%,氨基酸序列一致率为98.7%,表达产物分子质量约为32kD。酶粗提取液比活约为35U·mg-1。重组蛋白浓度0.2772(mg·mL-1)。【结论】本研究成功构建了牦牛Cu,Zn-SOD/pET22b(+)原核表达载体,表达量较高、稳定性强,重组表达产物具有较高生物学活性。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。