草莓中贝壳杉烯氧化酶基因( STGA3)中两个不同编码序列的克隆

 以保守氨基酸序列设计了简并性引物的方法, 克隆‘丰香’草莓( Fragaria gradiflora‘Fengxiang’) 贝壳杉烯氧化酶基因部分序列, 发现叶片和花蕾中合成赤霉素的贝壳杉烯氧化酶的序列不同, Southern杂交方法检测在草莓基因组中存在3个拷贝的目标基因, 表明在草莓中至少有两个不同基因共同编码贝壳杉烯氧化酶, 以响应不同发育信号的调控。     

‘巨峰’葡萄细胞分裂素氧化酶基因CKX3的克隆与表达分析

结合同源克隆和RACE技术在‘巨峰’葡萄（Vitis labruscana Bailey × V. vinifera L.‘Kyoho’）中克隆了细胞分裂素氧化酶基因CKX3,分析了该基因的表达特性及其对细胞分裂素的响应。序列分析表明,该基因cDNA全长为2 049 bp（GenBank登录号：KP689597）,ORF（开放阅读框）为1 569 bp,编码522个氨基酸,具有FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）结合结构域和细胞分裂素结合结构域。该基因定位在葡萄的7号染色体上,具有4个内含子,5个外显子。氨基酸序列多重比对和系统进化树分析显示‘巨峰’葡萄CKX3与荷花NuCKX3亲缘关系最近,与毛果杨同源性较高。基因表达分析结果显示‘巨峰’葡萄CKX3主要在根部和花序中大量表达,其次是在卷须和果实中有较高的表达,在茎和叶中的表达量较低;在花序发育过程中,在盛花期前表达量较低,盛花期以及盛花后表达量增加。在6-BA处理葡萄叶片后,CKX3的表达与细胞分裂素氧化酶的活性都高于对照。     

西瓜花叶病毒2号外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

以郑州地区西瓜花叶病病叶分离物－西瓜花叶病毒２号（２－ＷＭＶ－２）为毒源，从繁殖寄主西葫芦病叶中分离，鉴定了病毒，以病毒基因组ＲＮＡ为模板，逆转录合成ｃＤＮＡ，通过多聚酶链式反应（ＰＣＲ），从ｃＤＮＡ中扩增和克隆了病毒外壳蛋白（ＣＰ）基因，其中包括３’端非编码区，完成了全部核苷酸序列分析，ＣＰ基因全长１０９９个核苷酸，其中编码区长９０３个核苷酸，编码３０１个氨基酸，３’端非编码区长１９６个核苷酸。     

西瓜NBS类同源序列的克隆与分析(摘要)

R基因产物是植物抵抗病原物侵害的重要组成部分,在目前已经发现的植物抗病基因中,NBSLRR类占了绝大多数,在植物抗病基因中占有重要地位。NBS结构域是NBS-LRR基因编码蛋白中最保守的部分,含有8个保守基序,包括P-loop(又称Kinase-1a)、Kinase-2a、Kinase-3a和GLPL疏水结构域等。对西瓜NBS的克隆和分析将有助于筛选西瓜抗病基因及各种抗病基因的分子标记,而且通过对西瓜NBS的结构、表达和调控的研究,将有助于深入阐释西瓜的抗病机制。以根结线虫抗病西瓜材料‘红籽瓜’和感病西瓜材料‘ZDPI0006’为试材,根据西瓜NBS保守区设计简并引物及特异引物50对,根据葫芦科抗病基因序列在西瓜基因组数据库搜索同源序列,并以此设计特异引物1对,分别提取西瓜叶片g DNA和RNA并反转录成c DNA,采用PCR扩增西瓜抗病基因同源序列,琼脂糖电泳检测回收目标条带,克隆测序后结果提交到Gene Bank进行序列比对,提交至Pfam在线分析蛋白质功能,利用Clustalx与其他物种的抗病基因进行同源性分析,利用dnasp等软件进行序列多态性分析。结果表明,49对引物中共有43对引物在抗、感材料中成功扩增到目的片段,其中有4对引物在抗感材料中扩增出差异片段,简并引物W856在抗、感材料间扩增到一条约750bp的差异片段,测序结果提交至NCBI比对显示其与预测的黄瓜抗TMV的N端类似蛋白存在88%的同源性,根据葫芦科抗病基因在西瓜基因组数据库搜索同源序列设计的特异引物W6580在抗、感材料间扩增出大小一致的约800bp的片段,测序结果提交至NCBI比对,结果显示其与预测的黄瓜抗线虫类似蛋白存在90%的同源性,dnasp软件分析显示抗、感材料之间存在4个单核苷酸多态性位点。     

梨矮化砧木‘中矮1号’生长素氢转运体基因PcAHS及其启动子的克隆与表达分析

以梨（Pyrus communis L.）紧凑型矮化砧木‘中矮1号’及其母本‘锦香’新梢韧皮部为试材,根据转录组测序结果设计特异性引物,克隆到1个长1 239 bp的基因序列。该序列在两个品种间不存在差异,均编码412个氨基酸,其氨基酸序列与苹果（np_001280772.1）、梅（xp_008242099.1）、毛果杨（xp_002306421.2）、草莓（xp_00428771.1）的生长素氢转运体基因（AHS）编码的氨基酸序列的相似性在67% ~ 99%之间,命名为PcAHS。qRT-PCR分析发现,‘中矮1号’新梢韧皮部中PcAHS的表达量均低于母本‘锦香’,推测其启动子序列存在差异。‘中矮1号’及其母本‘锦香’PcAHS 基因上游启动子长度分别为828 bp和888 bp,二者相似性89.1%。序列分析发现‘中矮1号’PcAHS基因启动子有一段58 bp（–496 bp ~–553 bp）的缺失;利用植物顺式作用元件数据库PLACE和PLANTCARE分析表明,‘中矮1号’启动子含有一个‘锦香’没有的BPBF转录因子结合元件P-box。推测‘中矮1号’PcAHS基因启动子特有的片段缺失和P-box转录因子结合元件可能是导致其表达量低并通过影响生长素的运输最终引起矮化的原因。     

基于转录组测序的西瓜果肉硬度相关基因表达分析

以脆肉型‘京欣3号’西瓜和硬肉型‘甜王’西瓜为样品,评价果肉硬度表型差异,并利用转录组测序技术检测2个品种间差异表达基因。结果发现‘,甜王’西瓜品种果肉硬度是‘京欣3号’西瓜的1.9倍,表型与‘京欣3号’西瓜具有显著性差异。转录组测序结果显示,与‘京欣3号’西瓜相比‘,甜王’西瓜样品有5 342个基因差异表达,其中2 360个基因上调表达,2 982个基因下调表达。差异基因主要注释在碳水化合物代谢、信号转导、脂质代谢等途径,其中与果肉硬度变化的候选基因主要包括果胶酯酶、果胶裂合酶、聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶、纤维素合酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、酸性几丁质酶、几丁质酶、木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶和脂氧合酶基因。钙调蛋白、乙烯反应转录因子、乙烯不敏感样蛋白、WRKY转录因子、MYC2转录因子、过氧化氢酶、呼吸爆发氧化酶和脱落酸受体PYR1参与果肉细胞活动信号转导,可能与果肉硬度相关。     

荔枝多酚氧化酶基因启动子克隆与功能分析

【目的】获得多酚氧化酶(PPO)基因启动子序列并初步分析其功能,为进一步研究PPO基因表达规律及应用PPO基因启动子提供基础。【方法】通过TAIL-PCR和接头PCR方法相结合获得荔枝PPO基因启动子序列并进行生物信息学分析,序列缺失结合瞬时表达法分析核心启动子调控元件。【结果】从‘妃子笑’荔枝基因组中克隆获得了1048bp的荔枝PPO基因启动子序列,含有多种顺式作用元件。不同长度的启动子序列均能驱动GUS基因在‘妃子笑’、‘无核’和‘紫娘喜’荔枝叶片和果皮中表达,但都不能驱动GUS基因在‘妃子笑’和‘紫娘喜’荔枝种子中表达。【结论】获得了荔枝PPO基因启动子序列并获得了其调控基因表达的部分规律。     

西瓜抗根结线虫相关基因的克隆与表达分析

【目的】筛选西瓜(Citrullus lanatus)抗根结线虫相关基因,克隆其全长CDS序列,检测根结线虫接种后其在抗病材料和感病材料中的表达特征,分析其与西瓜根结线虫抗性的关系。【方法】以抗根结线虫的野生西瓜‘09005’和易感根结线虫的栽培西瓜‘ZDPI0006’为试材,用已知的植物抗线虫基因在葫芦科基因组数据库中比对,从结果中筛选到西瓜的相关基因Cla006580,与甜菜抗孢囊线虫基因Hs1~(pro-1)同源性达到65%,命名为Cla Hs1~(pro-1)。克隆Cla Hs1~(pro-1)基因的CDS区序列并进行生物信息预测分析,在根结线虫接种处理和CK处理72 h内利用q RT-PCR技术检测不同抗性的西瓜根系中Cla Hs1~(pro-1)的表达特征。【结果】从野生抗病西瓜‘09005’和栽培易感西瓜‘ZDPI0006’中均克隆得到Cla Hs1~(pro-1)基因,CDS区序列全长1 434 bp,编码478个氨基酸,含有Hs1pro-1_N和Hs1pro-1_C两个蛋白保守结构域,抗、感材料之间存在4个SNP位点。RT-PCR分析显示‘09005’在接种根结线虫后Cla Hs1~(pro-1)表达趋势呈先抑后扬,而在CK中呈先扬后抑,二者相反;‘ZDPI0006’在接种根结线虫后Cla Hs1~(pro-1)表达趋势呈先上扬后抑制再上扬,与CK中表达趋势一致。【结论】西瓜Cla Hs1~(pro-1)基因在抗病材料中表达特征与根结线虫接种密切相关,而在感病材料中与根结线虫接种无明显相关性,是西瓜抗根结线虫可能的候选基因。     

牡丹ACC氧化酶基因cDNA克隆及全序列分析

 以牡丹品种‘洛阳红’（Paeonia suffruticosa 'Luoyang Hong'）花瓣为材料,用CTAB法提取总RNA,根据已报道的ACC氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO）保守氨基酸序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增得到1条821 bp的牡丹ACO基因同源片段。利用该已知中间序列,通过快速扩增cDNA末端技术(Race)及序列拼接,最终得到该基因cDNA全长序列,命名为Ps-ACO1,GenBank登录号为DQ337251。分析结果表明,Ps-ACO1 cDNA全长1 221 bp,包含一个939 bp的开放读码框,5'非翻译区长65 bp,3'非翻译区长117 bp,编码产物为含有312个氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列与烟草、苹果、桃等植物的ACO同源性都达80%以上。     

西瓜抗病基因同源序列的克隆与分析

以植物丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶类（STK）抗病基因产物催化结构域l的保守氨基酸序列设计简并引物,以西瓜基因组DNA为模板进行PCR,扩增,得到大约500bp的目的条带。重组质粒经PCPo检测后进行测序,获得1个有效序列,可以编码完整的氨基酸序列。同源性分析表明其具有STK保守结构域,与已经克隆的Pto、LrlO和Lectin等基因在氨基酸水平上的同源性为40．O％～54．O％。     

牡丹ACC氧化酶基因的克隆与反义载体的构建

根据报道的牡丹ACC氧化酶基因(DQ337251)cDNA序列,设计一对特异引物,以牡丹品种"洛阳红"基因组DNA为模板,用PCR扩增方法克隆出牡丹ACC氧化酶基因的部分片段,并将其连接到pMD18-T载体上进行测序.结果表明,克隆的序列全长为467 bp,其中包括一个长度为157 bp的序列,推测它可能是一个内含子,其它序列与已报道序列同源性为98.2%;用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒和载体pBI 121酶切、连接,构建牡丹ACC氧化酶基因的反义表达载体.     

西瓜花叶病毒2号外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

以郑州地区西瓜花叶病病叶分离物──西瓜花叶病毒２号（２－ＷＭＶ－）为毒源，从繁殖寄主西葫芦病叶中分离、鉴定了病毒。以病毒基因组ＲＮＡ为模板，逆转录合成ｃＤＮＡ，通过多聚酶链式反应（ＰＣＲ），从ｃＤＮＡ中扩增和克隆了病毒外壳蛋白（ＣＰ）基因，其中包括３’端非编码区，完成了全部核苷酸序列分析。ＣＰ基因全长１０９９个苷耷酸，其中编码区长９０３个核苷酸，编码３０１个氨基酸，３’端非编码区长１９６个核苷酸。Ｚ－ＷＭＶ－２ＣＰ基因的编码区比Ａ－ＷＭＶ－２，Ｕ－ＷＭＶ－２两株系的ＣＰ基因编码区分别长出６０个核耷酸，多编码２０个氨基酸。与两个株系相比，编码区的核昔酸序列同源性分别为８８．５％和８７．０％，氨基酸序列同源性分别为９０．０％和８８．７％，３，端非编码区的同源性分别为６８．３％和７１．８％。若不考虑Ｚ－ＷＭＶ－２多出的６０个核苷酸及２０个氨基酸，则上述同源性依次为９５．４％、９３．７％、９６．４％、９５．０％、８８．８％和９３．４％。构建了含ＷＭＶ－２ＣＰ基因的大肠杆菌表达载体，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，表达出了与天然病毒外壳蛋白分子量相同的蛋白。     

砂梨扩展蛋白基因cDNA克隆及全序列分析

设计植物EXP扩展蛋白简并引物,以砂梨果实cDNA为模板,克隆得到EXP基因cDNA片段,该片段长465 bp。根据该片段序列,分别设计2条5’和3’末端扩增的特异引物,利用RACE技术,获得了该片段的5’端和3’端序列。用DNAMAN5.22软件对3个序列进行拼接和分析,获得了该基因的cDNA全长,命名为Pyp-EXP。该cDNA全长为1 395 bp,5’端起始密码子ATG始于72 bp,3’端终止子TAG止于830 bp,Ploy+(A)从1 363～1 395 bp。该基因已在GenBank基因数据库注册,注册号为EF602031。Pyp-EXP核苷酸序列有一个759 bp完整的开放阅读框,编码区与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃的同源性分别为96%,96%,94%和86%;该cDNA推导编码252个氨基酸,含有1个组氨酸(His_Phe_Asp,HFD)功能域,与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃中相应序列同源性分别为98%,97%,95%和93%。该基因的克隆为研究扩展蛋白的时空表达及其在果实发育和成熟过程中的作用奠定了基础。     

洋瓜砧嫁接西瓜初报

洋瓜与西瓜具有良好的嫁接亲和性和共生亲和性，表现出高抗西瓜枯萎病的特性。对西瓜品质无不良影响，中心糖度和Ｖｃ含量分别较自根苗提高１．２°（度）和０．４８ｍｇ／１００ｇ。     

月季CBF 转录因子基因的克隆及表达分析

 根据CBF（C-repeat binding factor）AP2/EREBP 保守区设计1 对简并引物,采用PCR 方法对月季‘寒锦4 号’（Rosa hybrida‘Hanjin 4’）CBF 转录因子基因中间片段进行克隆;再根据中间片段区域设计了两对特异引物,采用反向PCR 方法对该基因的5'和3'端的序列进行克隆,将中间片段与反向PCR 产物拼接得到CBF 基因全长序列,命名为RhCBF,GenBank 注册编号为EF582843;该基因序列长758 bp,ORF 为603 bp,编码200 个氨基酸;同时,根据基因序列设计1 对特异引物,利用荧光定量PCR分析月季CBF 在不同逆境胁迫下的表达情况。结果显示低温和盐均可以诱导RhCBF 的表达,而干旱处理不能诱导其表达。     

NaCl胁迫对不同西瓜品种种子发芽及其幼苗生长特性的影响

用不同浓度NaCl溶液分别对西瓜品种"郑抗2号"、"郑抗3号"、"中科1号"和"中科6号"进行浸种处理,研究不同西瓜品种的耐盐特性并筛选耐盐品种。结果表明:不同浓度NaCl溶液处理对西瓜种子的发芽特性、幼苗生长特性的影响因品种不同而有显著差异。其中种子发芽率、过氧化物酶活力随NaCl浓度的增加而下降,而叶绿素的含量表现为先上升后下降。在4个品种中"郑抗3号"的发芽特性、幼苗生长特性等方面均强于其它品种。     

适合压砂地种植的九个西瓜和甜瓜品种

介绍了适合压砂地种植的5个西瓜品种(“宁农科1号”、“金城5号”、“陇抗九号”、“美丰西瓜”、“西农8号”)和4个甜瓜品种(“玉金香”、“银帝”、“早黄蜜”、“玉露二号”)的植物学特征和果实特性,以期为农业技术推广部门提供新品种推广依据和为瓜农生产用种提供参考.     

西瓜雄性不育系‘Se18’抗氧化酶活性和内源激素含量变化分析

以西瓜雄性不育系‘Se18’为试材,研究开花期间花蕾和叶片中抗氧化酶活性和内源激素含量的变化。结果表明:不育株雄花花蕾在整个发育时期,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性升高,过氧化氢酶(CAT)活性降低;可育株中CAT活性升高,SOD和POD活性降低。不育株和可育株雄花花蕾中的生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA_3)、玉米素核苷(ZR)、茉莉酸(JA)和油菜素内酯(BR)及异戊烯基腺嘌呤核苷(IPA)等7种内源激素含量变化趋势不同,且含量差异明显。其中,不育株中IAA、GA_3、BR和IPA含量降低,JA含量升高;可育株中JA、BR、GA_3和IPA含量降低,IAA和ZR含量升高。不育株叶片中的IAA、ZR和BR含量显著下降,ABA和JA含量显著上升;IAA/ABA、IAA/GA_3、IAA/JA、IAA/ZR、IAA/BR、IAA/IPA及ABA/GA_3、ABA/ZR在不育株和可育株间的变化趋势不一致,且差异较大。因此推测上述抗氧化酶活性变化和内源激素含量异常可能与西瓜雄性不育的发生密切相关。     

嫁接对西瓜根际微生物种群数量及群落结构的影响

分别采用微生物培养的方法、16S rDNA PCR-RFLP方法和phl D基因PCR-RFLP方法研究了嫁接对西瓜根际微生物种群数量、细菌群落结构及拮抗菌（2, 4-DAPG产生菌）群落结构的影响。结果表明：① 嫁接西瓜根际细菌和真菌数量有所提高,而放线菌数量则有所减少。② 嫁接西瓜与自根西瓜具有1个相同的主要根际细菌基因型;不同砧木嫁接的西瓜与自根西瓜也分别具有不同基因型的细菌。③ 嫁接西瓜具有与自根西瓜不同的主要根际拮抗菌基因型。     

西瓜果实总糖含量QTL分析

【目的】为了探讨西瓜果实中总糖含量的遗传规律并找到与总糖含量相关的QTL位点,【方法】以高糖品系‘花园母本’为母本,低糖品系‘LSW-177’为父本,配制杂交组合,构建含有180个单株的F2代群体,分别测量成熟西瓜果实中心和边缘部分果糖、蔗糖和葡萄糖含量,并将3者之和相加作为总糖含量进行遗传图谱构建及QTL分析。【结果】构建的遗传连锁图谱共包含45个SSR标记,分属于13个连锁群,覆盖基因组长度为547.3 cM,标记间平均距离为12.44 cM,检测到与中心和边缘总糖含量相关的QTL位点各一个,均为加性遗传效应,贡献率分别为6.56%、7.90%,分布在第3、12连锁群上,LOD值分别为3.1、3.29,找到与中心和边缘总糖含量紧密连锁的标记4个(MU8184-3、MCPI-12、TJ116、MU8558-3),该研究结果为进一步开展西瓜糖含量相关基因定位和克隆研究提供理论依据。【结论】西瓜果实总糖含量为数量性状遗传,由多基因共同控制,中心部分总糖含量QTL位点表现为正向加性效应,边缘部分总糖含量QTL位点表现为负向加性效应。