1株变异伪狂犬病病毒的分离鉴定及gE和TK基因序列分析

为了探索伪狂犬病病毒(PRV)流行株的基因变异及遗传演变规律,本试验对福建福州疑似发生猪伪狂犬病的猪场病料,首先选用PCR技术、小鼠接种试验、细胞接种试验及间接免疫荧光鉴定等方法分离鉴定病原,再对病原进行毒价测定、TK和gE基因克隆及序列比对分析。结果显示,病原为PRV野毒,命名为PRV-FJFZ株;PRV-FJFZ株TCID_(50)为10~(-7.2)/0.1 mL,LD_(50)为10~(-3.56)/0.1 mL,对比分析PRV-FJFZ与国外PRV参考毒株的TK和gE基因序列同源性发现,核苷酸的同源性分别为99.5%～100.0%和99.8%～99.9%。TK和gE基因遗传进化树表明,PRV-FJFZ株与当前国内流行的变异PRV毒株在同一分支上,PRV-FJFZ株与国外PRV参考毒株在不同的分支上。本研究结果可为我国PRV的防控净化工作和疫苗株的筛选提供理论依据。     

猪伪狂犬病病毒河北变异株的分离鉴定及其gE基因序列分析

河北省某猪场猪群已免疫伪狂犬病(pseudorabies,PR)gE基因缺失苗,但仍发生了伪狂犬病疫情。本研究经PCR检测、组织病理学观察、免疫组化染色、病毒分离鉴定、动物试验等,从疑似PR病料中分离鉴定了1株伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV),并对该病毒进行gE基因序列分析。结果表明,分离毒gE基因的开放阅读框由1 740 bp组成,编码580个氨基酸。该病毒gE基因与23株PRV参考毒株之间具有较高的同源性,核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.5%～99.9%和95.3%～99.7%,与HLJMDJ2013、HeBLP2014、AHSZ-16株核苷酸同源性最高,均为99.9%。与2012年以来分离的变异株(Fa株除外)的gE基因存在相同的独特分子变异特征。遗传进化分析表明,该病毒与其他亚洲毒株同属第1群。动物试验表明该株病毒对兔具有很强的致病性,攻毒组兔全部发生死亡,并能引起兔出现典型的伪狂犬病神经症状。本研究为河北省生猪健康养殖与疾病防疫提供了数据基础和警示预警。     

一株猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定

为了解广东省猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株的基因变异及遗传演化的情况,本试验对广东佛山疑似暴发伪狂犬病的猪场采集的病料(脑、肺脏、扁桃体、肝脏、脾脏)进行了PCR鉴定,初步鉴定为PRV毒株后,将阳性病料接种非洲绿猴肾细胞(Vero),进行毒株传代培养,对分离毒株进行PCR检测及小鼠感染试验,证实该病毒为PRV,并命名为PRV FS-2015株;并对该毒株进行细胞病变观察、病毒TCID50测定、毒株gC和TK基因扩增及序列分析。结果显示,PRV FS-2015株TCID50为10-7.5/0.1mL。PRV FS-2015株的gC和TK基因序列与国内外PRV参考毒株进行同源性比对分析发现,其核苷酸序列同源性分别为95.8%~100.0%和99.4%~100.0%,氨基酸同源性分别为92.3%~100.0%和98.7%~100.0%。遗传进化分析表明,PRV FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ/YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系更近;但与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha、Yangsan、Min-A、SS和SL株的同源性较低,基因变异较大,表明PRV FS-2015毒株属于近几年流行的变异株。本研究结果可为广东省伪狂犬病的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。     

一株猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定

为了解广东省猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）野毒株的基因变异及遗传演化的情况,本试验对广东佛山疑似暴发伪狂犬病的猪场采集的病料（脑、肺脏、扁桃体、肝脏、脾脏）进行了PCR鉴定,初步鉴定为PRV毒株后,将阳性病料接种非洲绿猴肾细胞（Vero）,进行毒株传代培养,对分离毒株进行PCR检测及小鼠感染试验,证实该病毒为PRV,并命名为PRV FS-2015株;并对该毒株进行细胞病变观察、病毒TCID₅₀测定、毒株gC和TK基因扩增及序列分析。结果显示,PRV FS-2015株TCID₅₀为10^-7.5/0.1 mL。PRV FS-2015株的gC和TK基因序列与国内外PRV参考毒株进行同源性比对分析发现,其核苷酸序列同源性分别为95.8%~100.0%和99.4%~100.0%,氨基酸同源性分别为92.3%~100.0%和98.7%~100.0%。遗传进化分析表明,PRV FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ/YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系更近;但与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha、Yangsan、Min-A、SS和SL株的同源性较低,基因变异较大,表明PRV FS-2015毒株属于近几年流行的变异株。本研究结果可为广东省伪狂犬病的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。     

山东省部分地区猪伪狂犬病病毒分离株gC抗原基因的变异分析

为了解当前山东省猪伪狂犬病病毒(PRV)流行特点及病毒gC抗原基因的变异情况,本研究对2018年来自山东省不同地区的23份猪伪狂犬病疑似病料进行PRV的分离鉴定,并对分离株的gC抗原基因进行扩增及序列分析。结果表明,共分离到9株PRV;gC基因同源性比对结果显示,分离株与2012年之后国内PRV变异株的核苷酸及氨基酸序列的同源性均高于欧美毒株;遗传进化树及推导氨基酸序列分析结果显示,分离株与国内2012年后分离到的变异毒株同属于GenotypeⅡ;因此,推测目前山东省流行的PRV以变异毒株为主。9株分离株与Bartha-K61疫苗株相比,糖基化蛋白gC在潜在抗原位点和O-糖基化位点的重要位置(aa23～aa453)发生改变,这或许会影响分离株的抗原性,从而有助于其逃避宿主免疫防御,最终造成疫苗诱导产生的中和抗体不能有效地中和目前流行的变异PRV。本研究为变异PRV的防控及相关疫苗研制提供了一定的理论依据。     

猪伪狂犬病病毒山西株胸苷激酶基因序列分析

采用PCR方法对2011-2013年山西省分离的2株猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）的胸苷激酶（TK）基因进行了克隆和测序,并将其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外主要流行毒株Bartha株、Becker株、Ea株、Kaplan株、LA株、Min-A株、NIA-3株、SH株、SL株和Yangsan株进行了同源性分析。序列分析结果表明,核苷酸同源性分别为99.7%、99.6%、99.8%、99.7%、99.7%、94.4%、99.1%、57.2%、99.5%、99.7%;氨基酸同源性分别为99.1%、99.1%、99.7%、99.4%、99.4%、90.3%、98.1%、49.7%、98.8%、99.1%。另外在核苷酸序列中起始密码子上游有3段GC box的序列,终止密码子下游有多聚腺苷加尾信号AATAAA;TK基因均由320个氨基酸组成,氨基酸序列中有疱疹病毒TK基因共同的保守序列-R*Y*DG**G*GK*T-和-FDRHP*A***C*P*AR-。     

猪伪狂犬病病毒GZYY2015变异株的分离鉴定

本试验旨在从贵州省贵阳市云岩区某养猪场送检的经检测为猪伪狂犬病（PR）的样品中分离猪伪狂犬病病毒（PRV）。用细胞接毒试验、理化试验和透射电镜观察等方法分离、鉴定病原,测定病原的毒价后进行动物试验和gD、gE基因序列比对分析。结果显示,细胞接毒试验成功分离能致Vero细胞产生典型病变的PRV。理化试验表明,该分离毒株对5-碘脱氧尿核苷（idoxuridine,IUDR）和有机溶剂氯仿敏感,不耐酸和热。在透射电镜下可见近圆形、有囊膜、150~160 nm大小的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体,有实心和空心2种形态;动物试验表明,该毒株对兔具有较强的致病性,可导致接种部位奇痒;核酸鉴定结果表明,扩增获得的PRV gD基因开放阅读框（ORF）为1 209 bp,gE基因ORF为1 740 bp。GenBank比对结果显示,gD基因与PRV JS 2012株（登录号：KP257591）、PRV HNB株（登录号：KM189914.3）核苷酸序列相似性均为99.8%,与疫苗株Bartha-K61（登录号：JF797217.1）相似性为98.7%;gE基因与PRV JS2012株（登录号：KP257591）、PRV HNB株（登录号：KM189914.3）和PRV Qihe547（登录号：KU056477）核苷酸序列相似性均为99.9%。基于gD、gE基因推导的氨基酸序列的遗传进化分析发现,gD、gE基因与国内变异株均位于同一进化分支,对gE基因的遗传变异性分析结果表明,该分离毒株符合PRV变异株的变异模式。本试验结果表明,成功分离PRV变异株,可为贵州省PRV的流行病学遗传进化分析及免疫防控等提供参考。     

伪狂犬病病毒变异株的鉴定及伪狂犬病的防控

2011年以来伪狂犬病病毒（PRV）变异株在中国大范围流行致伪狂犬病（PR）再次暴发。广东某猪场发生疑似PR引起母猪较大范围的流产,为此本试验展开对该病诊断和防控方法的研究。随机抽取流产和未流产母猪血清,应用ELISA检测PRV gE和gB抗体;同时采集发病仔猪脑组织PCR检测PRV gH片段。对全场母猪紧急接种PRV变异株灭活苗,分别应用ELISA和中和试验检测免疫前后的血清抗体。结果显示,已发生流产母猪血清PR gE抗体均为阳性,而未流产母猪血清抗体见弱阳性;流产母猪PRV gB抗体的S/P值高达4.0,未流产母猪也达3.3。PCR检测3头病仔的脑组织均为阳性,测序表明其gB基因与2012年流行毒株BJ-YT-2012序列相似性为100%。ELISA检测免疫灭活疫苗前母猪血清PRV gB抗体S/P值为1.603,免疫4周后升高到2.88;特别是中和抗体从1：24升高到1：213。这与免疫疫苗1周后母猪流产开始减少,2周后母猪少见流产的结果吻合。研究结果提示,PRV经典株疫苗产生的PRV gB抗体对变异株的保护作用不佳,而变异株疫苗的保护效果显著。     

猪伪狂犬病病毒四川株的分离鉴定及UL43基因序列分析

从四川某猪场发病仔猪体内分离到1株病毒,该毒株能在Vero、MDBK、PK15、ST、MDCK、BHK21、Marc145、鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖并产生细胞病变。通过蚀斑克隆对其进行纯化,克隆毒株在Vero细胞上为3.0×107TC ID50/0.1mL。该病毒在Vero细胞上连传15代,其TCID50变化很小。病毒对5-溴脱氧尿核苷、氯仿敏感。用该病毒接种家兔和仔猪均出现典型的伪狂犬病症状,gE-ELISA检测接种分离毒的仔猪血清,伪狂犬病毒(PRV)抗体阳性。电镜观察可见直径110～140 nm的典型疱疹病毒粒子。上述结果表明分离株为PRV,并命名为SE株。根据已发表的UL43序列设计1对引物,以分离毒株基因组DNA为模板进行PCR扩增,对目的产物进行克隆及测序分析,结果与GenBank收录的其他PRV毒株(Becker、Ea)的UL43核苷酸序列同源性为98.8%,氨基酸同源性分别为95.2%、97.3%。     

伪狂犬病病毒YN株分离成功

今年3月,云南邱北牛发生疑似伪狂犬病病例,我所检验科从病牛脑组织中分离出1株伪狂犬病病毒,取名YN株,并进行了动物接种、细胞接种、细胞培养物电镜负染观察、回归家兔实验、病理学检查等初步鉴定。伪狂犬病毒YN株的分离成功,确定了云南存在本病。目前,正对该毒株进行系统鉴定。     

伪狂犬病病毒GD1406变异株的抗原性分析

为了解近年来广东省伪狂犬病病毒(PRV)变异情况,本研究从猪场收集Bartha-K61活疫苗免疫后的猪血清559份,经ELISA筛选出326份gB抗体阳性且gE抗体阴性的猪血清,进行中和试验,分析血清中的疫苗抗体对Bartha-K61株和临床分离到的PRV GD1406野毒株的中和能力。进一步应用小鼠进行交叉免疫保护性试验。结果显示,187份gB阳性且gE阴性的猪血清样品对Bartha-K61株和PRV GD1406野毒株的平均中和抗体滴度分别为1:57和1:13,并且免疫Bartha-K61株使小鼠免受PRV GD1406野毒株致死性攻击的保护率仅为20%,而免疫PRV GD1406野毒株使小鼠免受Bartha-K61株致死性攻击的保护率为100%,免疫灭活PRV GD1406野毒株使小鼠免受PRV GD1406野毒株致死性攻击的保护率为40%。根据试验结果推测,PRV GD1406野毒株与Batha-K61株之间存在抗原差异性,现用疫苗不能有效抵抗PRV变异株攻击。本研究结果将为PRV的防控提供实验依据,为研制PRV新疫苗提供新的思路。     

猪伪狂犬病病毒变异毒株HeNZK-2014的分离鉴定及gE基因序列分析

为了解猪伪狂犬病病毒（PRV）变异毒株的特点,本研究采集临床疑似PRV感染发病猪的淋巴结等组织样品进行PCR鉴定,选取仅PRV阳性的组织样品经研磨除菌后取上清接种于PK-15细胞进行病毒分离培养、蚀斑纯化、PCR和间接免疫荧光法（IFA）鉴定,采用Reed-Muench法测定PRV的TCID₅₀,接种小鼠并观察临床症状,对纯化的PRV和死亡小鼠脑组织样品进行gE基因PCR扩增及测序分析。结果显示,PRV阳性病料接种于PK-15细胞24 h后出现典型细胞病变（CPE）,经3轮蚀斑纯化后PCR和IFA鉴定结果均为阳性,分离株命名为HeNZK-2014,其TCID₅₀为10^-9.77/0.1 mL;以1×10⁸个TCID₅₀病毒悬液接种小鼠22 h后可引起小鼠出现奇痒、撕咬、死亡等典型猪伪狂犬病症状,死亡小鼠脑组织样品PRV PCR检测结果为阳性;纯化病毒和死亡小鼠脑组织样品gE基因核苷酸序列同源性为100.0%,与GenBank中2011年以前登录的经典毒株位于不同分支,与2011年之后中国流行毒株位于同一分支,在第48和496位各有1个天冬氨酸（D）的插入,具有变异毒株的典型特征。本研究成功分离了1株PRV变异毒株,为进一步开展针对PRV变异毒株的疫苗及其防控研究奠定了基础。     

伪狂犬病病毒FS-2015株gE和gB基因序列分析

为了解猪伪狂犬病病毒（porcine pesudorabies virus,PRV）gB和gE基因变异及遗传演化情况,本研究针对PRV FS-2015野毒株,应用"蚀斑法"对组织病料中病毒进行三轮纯化,应用全长扩增引物对FS-2015株gB和gE基因进行全基因扩增,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示,PRV FS-2015株的gB、gE基因与国内外PRV参考毒株的核苷酸同源性分别为97.0%~100.0%和97.5%~99.7%,氨基酸同源性分别为96.4%~100.0%和95.3%~99.7%。氨基酸变异位点分析表明,FS-2015株的gB和gE基因均有位点突变和缺失。遗传进化分析表明,FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ-YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系较近;与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha和Yangsan株属于不同分支,同源性较低,亲缘关系较远。从PRV FS-2015毒株与国内外经典毒株和当前国内流行的变异毒株的分析结果可知,PRV FS-2015毒株发生了一定的变异,属于当前国内流行变异毒株。本研究结果为广东省伪狂犬病分子流行病学调查、伪狂犬病的防控和疫苗株挑选工作提供参考数据。     

伪狂犬病病毒FS-2015株gE和gB基因序列分析

为了解猪伪狂犬病病毒(porcine pesudorabies virus,PRV)gB和gE基因变异及遗传演化情况,本研究针对PRV FS-2015野毒株,应用"蚀斑法"对组织病料中病毒进行三轮纯化,应用全长扩增引物对FS-2015株gB和gE基因进行全基因扩增,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示,PRV FS-2015株的gB、gE基因与国内外PRV参考毒株的核苷酸同源性分别为97.0%～100.0%和97.5%～99.7%,氨基酸同源性分别为96.4%～100.0%和95.3%～99.7%。氨基酸变异位点分析表明,FS-2015株的gB和gE基因均有位点突变和缺失。遗传进化分析表明,FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ-YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系较近;与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha和Yangsan株属于不同分支,同源性较低,亲缘关系较远。从PRV FS-2015毒株与国内外经典毒株和当前国内流行的变异毒株的分析结果可知,PRV FS-2015毒株发生了一定的变异,属于当前国内流行变异毒株。本研究结果为广东省伪狂犬病分子流行病学调查、伪狂犬病的防控和疫苗株挑选工作提供参考数据。     

伪狂犬病病毒FJSW的分离鉴定及gG基因序列分析

从福建省某规模化猪场的患猪中分离到一株疑似猪伪狂犬病病毒,命名为FJSW株,对其进行PCR鉴定、gG基因测序等鉴定,并与GenBank上发表的国内外毒株进行序列分析和遗传进化分析.结果 显示,病毒经Vero细胞培养可产生典型细胞病变.该毒株gG基因核苷酸序列与国内分离毒株的同源性为99.7％～100.0％,与国外分离毒...     

猪伪狂犬病病毒JSSQ2013株的分离鉴定及重要功能基因序列分析

为了解江苏省猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)野毒株的特点,本研究从2013年采自江苏省宿迁市的疑似PRV感染病料中分离纯化了一株PRV病毒,对其进行了PCR和间接免疫荧光法(IFA)鉴定,并进一步在Vero细胞上测定该分离株的病毒滴度TCID50和一步生长曲线,扩增其gB、gC、gD和gE基因进行序列比对及分子遗传进化分析,并将该分离株分别接种新西兰白兔和15日龄仔猪研究其致病性。结果显示,该病毒为一株PRV,命名为PRV JSSQ2013株,纯化后的病毒滴度为10^7.8 TCID50/ml;生长曲线测定显示在感染20h后病毒滴度即达到最高,为10^8.6 TCID50/ml。与我国近几年分离的PRV变异株序列相比,PRV JSSQ2013株的gB、gC、gD和gE基因核苷酸序列同源性分别为99.5~99.6%、99.5~99.6%、99.5~99.6%和98.7~99.7%,氨基酸序列同源性分别为98.9~99.0%、99.5~99.7%、99.0~99.2%和98.1~99.3%,均高于其与经典毒株(Ea、Fa和SC株)和欧美毒株(Becker、Kaplan、Bartha、Kolchis和NIA3)的同源性;基于gB、gC、gD和gE基因的遗传进化树分析均显示PRV JSSQ2013株与国内近几年分离的PRV变异株属同一分支。该病毒接种新西兰白兔后均出现典型的PR症状,如厌食、兴奋、啃咬或用爪挠接种部位等典型症状,且在48h内全部死亡;接种仔猪后第1天开始出现典型的PR症状,第5天全部死亡。以上结果证实,从江苏省宿迁市采集的疑似PRV感染病料中分离到一株强毒力的PRV变异株。本研究为了解江苏PRV分子流行特征、丰富我国PRV分子流行病学资料及新型疫苗的研制奠定了基础。     

伪狂犬病病毒YN株的分离鉴定

本试验从患伪狂犬病牛的脑组织中分得一株病毒,通过对其理化学特性、生物学特性和电镜形态学特性鉴定,认定该每株为疱疾病毒科的伪狂犬病病毒,井暂定名为PrV—YN毒株。     

猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析

2011年以来我国多个省份的规模化猪场发生了新生仔猪出现神经症状和死亡的现象,为确定其是否为猪伪狂犬病病毒(PRV)感染所引发,我们利用PCR方法从死亡的新生仔猪脑组织中扩增PRV的gE基因,发现被检猪场均存在PRV野毒感染。gE基因序列分析表明,从5个省14个猪场的病料中扩增的gE基因高度同源,与以往发表的相关序列比对显示,这些分离株均属于一个相对独立的分支。病料接种Vero细胞能够产生典型的细胞病变,将命名为PRV HeN1分离株接种小鼠能够引起瘙痒、死亡等伪狂犬病症状,并且对小鼠的LD50(102.37TCID50)显著低于经典强毒PRV双城株(103.83TCID50)。此外,中和试验结果显示,PRV Bartha k61活疫苗免疫猪仅能诱导对HeN1分离株低水平的中和抗体,而HeN1分离株能够诱导较高水平的中和抗体,并具有更强的交叉中和能力。根据本实验结果推测,近期各猪场流行的PRV可能存在一定的抗原变异。     

猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析

我国多个省份的大规模养猪场都出现过新生仔猪神经疾病和死亡的案例,为了确定是否猪伪狂犬病病毒的感染所致,本次研究选取我国多个省份的13个PR免疫猪场送检的156份病毒样品,采用PCR方法对死亡仔猪脑组织中扩增PRV的g E基因,进行PRV病毒的分离鉴定和血清中和实验及g E基因序列分析。将疑似PR病毒发病猪的脑部组织进行匀浆,提取其DNA进行PRV检测,发现各个猪场都存在病毒感染。结论:依据本次实验结果进行推测,当下各个猪场流行的PRV病毒可能存在一定的抗原变异。     

猪伪狂犬病病毒福建新分离株gB基因的变异研究

为探究2013年~2014年福建省新流行的猪伪狂犬病病毒(PRV)gB基因的遗传进化情况,根据Gen Bank已公布的PRV gB基因序列设计了2对特异性扩增引物,对4株新分离的PRV的gB基因进行克隆、测序及拼接,与国内外已发表的14个毒株进行同源性比对分析,并构建遗传进化树。结果表明:福建省新流行毒株gB基因序列全长2 742 bp,编码913个氨基酸,与其它参考毒株的核苷酸序列的同源性为98.3%~99.2%;在aa75~aa77处存在连续的3个氨基酸缺失;遗传进化树表明,4株新流行毒株与国外分离毒株同属一分群,分属两个分支,而与国内分离毒株亲缘关系较远。本研究为丰富福建省猪群PRV的分子流行病学和掌握PRV的分子遗传进化规律奠定基础。