小鼠Oct-1基因CDS区克隆与生物信息学分析

为研究小鼠Oct-1基因的生物学特性,试验扩增小鼠黑色素细胞中Oct-1基因CDS区序列,并运用生物信息学软件分析小鼠Oct-1基因序列的特性、编码蛋白理化性质、亚细胞定位、靶基因及保守性结构域等,从而预测其是否调控黑色素的生成。结果表明,小鼠Oct-1基因大小为2 313 bp,编码蛋白质的分子式C₃₄₂₅H₅₆₀₆N₉₇₆O₁₁₆₃S₁₅,是一个不稳定可溶性蛋白质,二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主,亚细胞定位主要分布在细胞核,推测其可能在能量代谢和辅因子的生物合成过程中发挥信号转导和转录因子调控的作用;Oct-1基因在小鼠黑色素细胞中表达,其编码的蛋白含有一个保守的POU结构域和一个保守的同源域,参与调控13个黑色素形成相关基因转录表达,在黑色素生成关键基因MITF、TYR、TYRP1、TYRP2的启动子上存在Oct-1转录因子的作用位点,Oct-1蛋白质还可能与Brf2、Pou2af1、Tbp等蛋白相互作用调控毛色基因表达,故可以推测转录因子Oct-1在黑素细胞的黑色素生成中发挥着重要的作用,为研究毛色形成机制提理论依据。     

SOX5影响小鼠皮肤黑色素细胞MITF-M表达和黑色素生成

旨在探讨SOX5在小鼠皮肤毛色中的作用。本研究随机选取出生后12d的C57BL/6品系黑色、棕色、灰色小鼠各3只,采用实时荧光定量PCR、Western blotting和免疫组织化学方法对SOX5在黑色、棕色和灰色小鼠皮肤中的表达差异进行分析;并构建SOX5真核表达载体;运用体外转染的方法,转染小鼠黑色素细胞并检测与色素形成相关基因的表达水平,同时测定黑色素含量。结果表明:1)SOX5在不同毛色小鼠皮肤中均有表达,SOX5在黑色和灰色小鼠皮肤中mRNA和蛋白相对表达量高于棕色小鼠皮肤,均差异极显著(P0.01);且其主要表达部位为毛囊外根鞘。2)转染组与空载组相比,MITF-M、TYR、TYRP1、TYRP2、PMEL、OA1表达量均显著(P0.05)或极显著(P0.01)升高,黑色素含量也极显著增加(P0.01)。3)过表达MITF-M对SOX5存在负反馈作用。综上表明,SOX5通过调控MITF-M影响色素的生成进而参与毛色的形成。     

内皮素3对小鼠黑色素沉着相关基因表达的影响

试验旨在探究内皮素3(endothelin 3,EDN3)在不同毛囊时期小鼠皮肤中是否存在差异表达及其对黑色素细胞黑色素沉着相关基因表达的影响。通过RT-PCR技术对EDN3、EDNRB在不同毛囊时期小鼠皮肤的表达情况进行定量分析发现,EDN3和EDNRB在小鼠不同毛囊时期皮肤样品中均有表达,在毛囊生长初期和中期小鼠皮肤中EDN3 mRNA表达量是末期的2.18倍(P0.05)和1.15倍(P0.05),毛囊生长初期和中期EDNRB mRNA表达量是末期的16.8倍(P0.01)和9.9倍(P0.01)。为了进一步揭示EDN3在黑色素细胞色素沉着中的重要作用,通过细胞转染技术使小鼠黑色素细胞过表达EDN3并测定其黑色素含量及色素沉着相关基因的表达水平发现,与空载组相比,体外转染EDN3的黑色素细胞黑色素含量明显增加。此外,MITF mRNA显著降低(P0.05);TYR、TYRP2、EDNRB、c-Kit和EDN1 mRNA显著升高2.04倍(P0.05)、1.44倍(P0.05)、1.41倍(P0.05)、5.21倍(P0.01)和3.27倍(P0.01)。MITF蛋白水平显著降低(P0.05),TYR、TYRP2、EDNRB和c-Kit蛋白水平显著升高1.48倍(P0.01)、4.61倍(P0.01)、1.27倍(P0.05)和2.64倍(P0.01)。综上所述,EDN3在不同毛囊时期小鼠皮肤中均可有效表达,且表达量存在显著差异。黑色素细胞中过量表达EDN3,使色素沉着相关基因的表达量及黑色素含量增加。     

miR-186-5p与α-MSH互作对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响

黑色素合成受多种基因和miRNAs的调控,为了研究miR-186-5p与α-MSH协同作用对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响。本研究在绵羊黑素细胞中转染miR-186-5p表达载体,同时添加α-MSH,通过实时荧光PCR (quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测MITF、TYR、TYRP1和TYRP2 4种可能与之相关的基因表达情况;利用免疫组化检测MITF蛋白在黑素细胞中的表达和亚细胞定位;通过分光光度法测定黑色素含量变化;利用划痕试验测定细胞迁移情况,试验分为miR-186-5p转染组、miR-186-5p+α-MSH互作组和对照组,每组3个重复。结果显示,miR-186-5p能够抑制绵羊黑素细胞中MITF、TYR、TYRP1和TYRP2的表达,并最终抑制黑色素的生成。而添加α-MSH能缓解miR-186-5p对MITF、TYR、TYRP1和TYRP2表达的抑制作用,进而在一定程度上恢复黑色素的含量。另外,miR-186-5p还能抑制细胞分裂,并阻碍细胞的迁移,而α-MSH无法抵消miR-186-5p产生的这种负面影响。上述结果表明,在绵羊黑素细胞中,miR-186-5p和α-MSH均参与调控黑色素合成途径,其中,miR-186-5p主要起负调控作用,而α-MSH主要参与相关位点的正调控,并能部分恢复miR-186-5p导致的黑色素含量下降。值得注意的是,miR-186-5p还参与调控细胞的增殖和迁移,而α-MSH不参与相关调控。     

黑色素细胞中过量表达lpa-miR-nov-66对TYRP2的影响

本研究旨在探讨lpa-miR-nov-66对黑色素生成相关基因TYRP2的影响。采用细胞转染技术,在羊驼黑色素细胞中过表达lpa-miR-nov-66,运用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术和免疫印迹法(western blotting)技术分别检测转染lpa-miR-nov-66后黑色素细胞内TYRP2在mRNA和蛋白水平的表达差异。RT-PCR结果显示:TYRP2的部分片段扩增,扩增片段长度为151 bp。qRT-PCR和免疫印迹(western blotting)结果显示:与对照组相比,实验组TYRP2在mRNA表达水平显著降低,降低0.44倍;蛋白表达水平也显著降低,降低0.78倍。结果表明,lpa-miR-nov-66可以影响TYRP2的表达,可能参与了动物毛色的形成过程。     

黑色素细胞相关调控因子研究进展

黑色素细胞是皮肤组织中的一种特殊细胞,黑色素细胞能够产生黑色素并且传递给周围的角质细胞。黑色素传递并停留在这些角质细胞中,能够防止光线辐射对染色体产生损伤,对细胞产生一定的保护作用。黑色素的合成受到许多复杂的调控因子的调控,小眼畸形转录因子在调控黑色素的合成及黑色素细胞的迁移和生存起着非常重要的作用。在小鼠中,干细胞因子或者是它的感受器c-Kit的突变会导致黑色素细胞异常表型。黑色素细胞通过福斯匹林和α黑色素细胞刺激素与黑素皮质素受体结合刺激黑色素的生成;刺鼠信号蛋白会抑制酪氨酸蛋白酶的活性,进而减少黑色素的产量。WNT信号对于神经嵴细胞分化为黑色素细胞有影响,影响黑色素细胞的数量进而影响黑色素的产量。促肝细胞生长素是酪氨酸激酶的感受器,能够促进和保持黑色素细胞产生黑色素的活性。控制合成内皮缩血管肽的受体及配体EDN3的基因的突变会导致黑色素细胞的缺失。     

内皮素3对小鼠黑色素沉着相关基因表达的影响

试验旨在探究内皮素3（endothelin 3，EDN3）在不同毛囊时期小鼠皮肤中是否存在差异表达及其对黑色素细胞黑色素沉着相关基因表达的影响。通过RT-PCR技术对EDN3、EDNRB在不同毛囊时期小鼠皮肤的表达情况进行定量分析发现，EDN3和EDNRB在小鼠不同毛囊时期皮肤样品中均有表达，在毛囊生长初期和中期小鼠皮肤中EDN3 mRNA表达量是末期的2.18倍（P < 0.05）和1.15倍（P > 0.05），毛囊生长初期和中期EDNRB mRNA表达量是末期的16.8倍（P < 0.01）和9.9倍（P < 0.01）。为了进一步揭示EDN3在黑色素细胞色素沉着中的重要作用，通过细胞转染技术使小鼠黑色素细胞过表达EDN3并测定其黑色素含量及色素沉着相关基因的表达水平发现，与空载组相比，体外转染EDN3的黑色素细胞黑色素含量明显增加。此外，MITF mRNA显著降低（P < 0.05）；TYR、TYRP2、EDNRB、c-Kit和EDN1 mRNA显著升高2.04倍（P < 0.05）、1.44倍（P < 0.05）、1.41倍（P < 0.05）、5.21倍（P < 0.01）和3.27倍（P < 0.01）。MITF蛋白水平显著降低（P < 0.05），TYR、TYRP2、EDNRB和c-Kit蛋白水平显著升高1.48倍（P < 0.01）、4.61倍（P < 0.01）、1.27倍（P < 0.05）和2.64倍（P < 0.01）。综上所述，EDN3在不同毛囊时期小鼠皮肤中均可有效表达，且表达量存在显著差异。黑色素细胞中过量表达EDN3，使色素沉着相关基因的表达量及黑色素含量增加。     

家畜毛色形成分子基础及应用研究进展

动物毛色是一种容易被识别的表型,也可作为筛查某些疾病的有效手段。毛色主要由黑色素细胞产生的真黑色素和棕黑色素的分布、比例和产生速率所决定。许多基因对黑色素的产生和分布起着重要调控作用,各基因间的不同基因型形成多种基本毛色、淡化毛色和花斑。此外,miRNA靶向结合毛色主效基因mRNA,诱导抑制/增强其转录翻译过程,从而调控毛色基因的表达,影响黑色素合成。文章简述了家畜调控毛色的主效基因黑色素皮质素受体1(MC1R)、野灰位点信号蛋白(ASIP)、原癌基因(KIT)、酪氨酸酶关联蛋白(TYRP)、小眼畸形相关转录因子(MITF)和内皮素受体B(EDNRB)的DNA序列多态性(不同基因型)与毛色性状、疾病之间的关系;介绍了毛色形成相关miRNA挖掘鉴定、miRNA调控毛色相关基因研究进展与毛色基因研究应用价值,旨在为今后研究家畜毛色机理提供理论依据。     

家畜毛色形成分子基础及应用研究进展

动物毛色是一种容易被识别的表型,也可作为筛查某些疾病的有效手段。毛色主要由黑色素细胞产生的真黑色素和棕黑色素的分布、比例和产生速率所决定。许多基因对黑色素的产生和分布起着重要调控作用,各基因间的不同基因型形成多种基本毛色、淡化毛色和花斑。此外,miRNA靶向结合毛色主效基因mRNA,诱导抑制/增强其转录翻译过程,从而调控毛色基因的表达,影响黑色素合成。文章简述了家畜调控毛色的主效基因黑色素皮质素受体1（MC1R）、野灰位点信号蛋白（ASIP）、原癌基因（KIT）、酪氨酸酶关联蛋白（TYRP）、小眼畸形相关转录因子（MITF）和内皮素受体B（EDNRB）的DNA序列多态性（不同基因型）与毛色性状、疾病之间的关系;介绍了毛色形成相关miRNA挖掘鉴定、miRNA调控毛色相关基因研究进展与毛色基因研究应用价值,旨在为今后研究家畜毛色机理提供理论依据。     

TYR基因及其与动物毛色关系的研究进展

毛色是毛皮动物重要的品种特征之一,是一种易于观察的表型性状。黑色素对动物毛色的形成起至关重要的作用。在动物体内酪氨酸在酪氨酸酶(TYR)的催化作用下,经由DOPA、多巴醌、吲哚醌等形式最后生成黑色素。动物毛色的形成主要与黑色素细胞中合成的两种色素(真黑色素、褐黑色素)比例有关。黑色素细胞中色素的合成受多个基因和信号通路调控。动物毛色之所以具有多样性,也是由于这些基因调控所致。在众多的调控基因中,其中目前研究较多的主要有黑素皮质素受体1(MC1R)、剌鼠信号蛋白基因(ASIP)、TYR家族(TYR、TYRP1、TYRP2)等,各基因间相互作用形成不同的毛色。文章简要介绍黑色素形成的机理及概况,重点对TYR基因结构和功能及其在多种动物毛色方面的研究现状进行综述,以便为动物毛色选育提供理论依据。     

Wnt3a在小鼠黑色素细胞中的表达研究

Wnt3a 在小鼠黑色素细胞的早期分化、迁移及黑色素合成过程中发挥重要作用。本研究通过免疫荧光技术检测体外培养的小鼠黑色素细胞中的 Wnt3a 蛋白的表达,为深入研究其在黑色素生成中的作用奠定基础。     

AGRP基因在山羊组织表达及其对黑色素生成的作用机制

为了阐明AGRP基因在山羊皮肤表达模式以及对黑色素生成的作用机制。本研究通过qRT-PCR法检测AGRP基因在3只酉州乌羊不同组织和3只板角山羊皮肤组织表达情况。同时,通过体外试验分析不同浓度外源性AGRP蛋白对黑色素细胞影响,利用EdU法检测细胞活力、环磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)试剂盒检测cAMP活性、并检测其对真黑色素含量和黑素生成相关基因黑素皮质素1型受体(melanocortin 1 receptor,MC1R)、酪蛋白酶(tyrosinase,TYR)、酪蛋白酶相关蛋白酶1(tyrosinase related protein 1,TYRP1)、多巴色素互变异构酶(dopachrome tautomerase,DCT) mRNA表达的影响。结果表明,AGRP基因在酉州乌羊组织均有表达,其中在垂体中表达最高,与其他组织相比差异显著(P<0.05);板角山羊与酉州乌羊皮肤中AGRP表达量差异极显著(P<0.05)。添加不同浓度AGRP蛋白对黑色素生成和黑色素细胞增殖影响不显著(P>0.05);随着AGRP浓...     

小鼠黑色素细胞沉默及过表达色素上皮衍生因子对黑色素合成的影响

旨在研究色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)与黑色素合成调控因子之间的互作关系，探索PEDF对黑色素细胞活力和黑色素合成的调控作用，为研究动物毛色形成机制提供基础。本研究将PEDF siRNA及PEDF过表达载体分别转染小鼠黑色素细胞，对黑色素细胞活力、黑色素含量进行检测，采用qRT-PCR、Western blotting及细胞免疫荧光对PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表达和定位进行检测。黑色素细胞PEDF沉默后，黑色素细胞的细胞活力增强，黑色素含量增加，Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的mRNA和蛋白表达量升高；黑色素细胞PEDF过表达后，黑色素细胞活力减弱，黑色素含量减少，Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的mRNA和蛋白表达量降低。细胞免疫荧光结果显示：PEDF、Wnt1、MITF、β-catenin表达于黑色素细胞的细胞质；Wnt3α表达于黑色素细胞的细胞质和细胞膜。本研究证实：PEDF使黑色素细胞活力减弱，可通过下调促黑色素生成相关的因子Wnt1、W...     

酪氨酸酶转运对黑色素生成影响研究进展

哺乳动物毛色的形成依赖于黑色素细胞中黑色素数量及分布比例,酪氨酸酶类(TYR/TYRP1)的转运及其活性是黑色素合成的关键。衔接蛋白(AP-1/3)和溶酶体相关细胞器生物合成复合物(BLOC-1,2,3)将TYR/TYRP1从早期核内体转运至黑素小体,若TYR/TYRP1无法转运至黑素小体中,黑色素合成则会受到抑制。ATP7A将铜离子转移到TYR/TYRP1,从而激活TYR/TYRP1活性,ATP7A的减少同样会使黑色素细胞中黑色素合成量减少。关注这些复合物在转运TYR/TYRP1的作用及影响其活性的因素,可以从不同的角度解析黑色素合成机理,以此为基础探索哺乳动物毛色的淡化机制,以期为阐明人类黑色素合成障碍的相关疾病提供理论依据。     

北极狐TYRP1基因启动子活性及转录调控区域分析

通过分析调控北极狐毛色基因TYRP1启动子核心区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为狐狸毛皮品质分子育种和彩色毛皮新材料的创制提供思路。通过基因组测序技术获得了北极狐TYRP1基因启动子序列,并利用生物信息学方法对北极狐TYRP1基因核心启动子区域和转录因子结合位点进行预测;以北极狐基因组DNA为模板,PCR扩增北极狐TYRP1基因不同长度的启动子缺失片段克隆至pGL3-Basic载体,将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞,利用双荧光素酶基因检测仪进行活性验证。结果表明,成功构建了9个含有不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶活性检测发现北极狐TYRP1基因-699/+35区域为核心启动子区域,-699/-93区域存在着TYRP1基因正调控元件。生物信息学预测分析发现该区域存在4个转录因子结合位点;利用重叠延伸PCR技术成功构建了4个突变载体,经双荧光素酶活性检测发现4个突变载体活性均显著下降(P0.05),表明这4个转录因子是北极狐TYRP1基因转录调控的正调控元件。本研究确定了北极狐TYRP1基因启动子核心区域-699/+35,Sp1(-656/-646)、CREB(-598/-589)、Sp1(-539/-530)和Sp1(-163/-154)为北极狐TYRP1基因转录的正调控元件。     

miR-186-5p对绵羊黑色素细胞迁移增殖的影响

旨在研究miR-186-5p对绵羊黑色素细胞迁移增殖的影响。本研究通过荧光定量PCR检测不同毛色绵羊皮肤中miR-186-5p的表达差异;运用细胞转染使miR-186-5p在绵羊黑色素细胞中过表达,然后通过荧光定量PCR检测miR-186-5p的表达,通过分光光度计测定转染细胞中黑色素含量,运用划痕试验判定黑色素细胞的增殖迁移能力。结果显示,miR-186-5p在绵羊不同毛色皮肤中均有表达,但白色皮肤表达高于黑色皮肤且差异显著(P0.05);在过表达miR-186-5p的绵羊黑色素细胞中,miR-186-5p的表达显著升高(P0.01);黑色素含量显著减少(P0.05);黑色素细胞的增殖和迁移能力有所降低。综上表明,miR-186-5p与绵羊皮肤黑色素的生成有关,绵羊黑色素细胞中过表达miR-186-5p降低了黑色素的生成,同时也抑制了绵羊黑色素细胞的迁移和增殖。