猪瘟病毒低温诱变疫苗Thiverval株感染性克隆的构建及病毒拯救

采用高保真DNA聚合酶,分7个片段扩增猪瘟病毒(CSFV)Thiverval株全基因组序列,克隆至pMD18-T载体并测序.经适当的连接策略将各片段连接克隆至低拷贝载体质粒pAC/F101,同时对病毒基因组5'和3'末端进行修饰,构建出含有T7启动子、榔头状(HH)核酶基因、CSFV Thiverval全基因组、丁型肝炎病毒(HDV)核酶基因和T7终止子的重组质粒pAC/F101/T1-7.利用T7 RNA聚合酶将线性化重组质粒pAC/F101/T1-7体外转录成基因组RNA,再使用脂质体转染将体外转录RNA转染PK-15细胞.通过传代、RT-PCR、免疫过氧化物酶细胞单层试验鉴定,表明成功的从感染性克隆拯救出活病毒粒子.猪瘟病毒低温诱变疫苗"Thiverval"株感染性克隆的构建及病毒的成功拯救,为进一步研究CSFV疫苗株的致弱机制提供了重要工具.     

蓝舌病病毒反向遗传操作系统的建立

为建立蓝舌病病毒(BTV)的反向遗传操作系统,本研究构建了分别表达血清1型BTV SZ97/1株VP1、VP3、VP4、VP6、VP7、NS1和NS2蛋白的7个真核表达质粒,同时又构建了含有SZ97/1株BTV的全部10个基因节段的T7聚合酶体外转录重组质粒。并利用T7 RNA聚合酶对酶切线性化的10个体外转录质粒进行体外转录,制备BTV全部10个基因的体外转录RNA。将已构建的7个真核表达质粒和体外转录获得的RNA产物依次共转染BHK-21细胞,拯救出含有分子标记的BTV。本研究首次在我国建立了BTV的反向遗传操作系统,为我国深入开展该病毒致病机理、传播机制、基因组功能的研究以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

稳定表达T7RNA聚合酶PK-15细胞系的建立

为构建稳定表达T7 RNA聚合酶(RNAP)的猪肾细胞系(PK-15),本研究采用PCR方法,以E.coli BL21(DE3)细菌基因组为模板扩增T7 RNAP基因,将其克隆到逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒pLXSN-T7.采用脂质体将pLXSN-T7转染至PT67细胞中,经G418筛选培养获得重组逆转录病毒rMLV-T7,将其接种于PK-15细胞进行G418加压筛选和纯化;应用PCR、间接免疫荧光试验及T7启动子控制下的红色荧光蛋白的重组表达质粒(pET-RED)进行瞬时表达,检测T7 RNAP的表达及活性,结果表明筛选所得的细胞系PK/T7的不同代次均具有转录活性.本研究建立稳定表达T7 RNAP的细胞系PK/T7,为实现细胞内T7启动的转录和猪源RNA病毒等的反向遗传操作提供了有效的方法.     

稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞系的建立

为建立能稳定表达T7RNA聚合酶(T7RNAP)的BHK-21细胞系以研究RNA重组疫苗,本研究从BL21(DE3)大肠杆菌中扩增T7 RNAP基因,定向克隆于质粒pcDNA3.1(+)中,经双酶切及测序鉴定,获得阳性重组质粒pcDNA3.1-T7 RNAP。用该质粒转染BHK-21细胞,经G418筛选14d后获得阳性细胞株。RT-PCR和western blot检测结果表明,建立了稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞系,并且在不同代次的阳性细胞中能稳定表达目的基因和蛋白,该研究为RNA病毒感染性质粒在细胞内转录及病毒拯救技术平台的建立奠定了基础。     

环状RNA mmu-circ-Pax3.1表达载体的构建及初步验证

试验旨在探讨利用环状RNA表达载体在体外表达环状RNA mmu-circ-Pax3.1的可行性。利用反向PCR及测序证实mmu-circ-Pax3.1的存在,将其对应的线性序列克隆到环状RNA表达载体pc DNA3.1(+)CircRNA Mini Vector中,构建重组载体pc DNA3.1(+)CircRNA-mmu-Pax3.1,经PCR、酶切、测序等对重组质粒进行鉴定。利用脂质体2000转染试剂将重组质粒转染到293细胞中,在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况。最后利用RT-PCR检测正常细胞组、空载体组及试验组中环状RNA mmu-circ-Pax3.1的表达情况。结果表明,试验成功构建了环状RNA mmu-circ-Pax3.1表达载体,可在293细胞中高效转录mmu-circ-Pax3.1。试验利用基因工程技术构建的环状RNA mmu-circ-Pax3.1表达载体,通过脂质体法转染293细胞,使其高效转录,为深入研究mmu-circ-Pax3.1的功能奠定了基础。     

酵母双杂交筛选与牛病毒性腹泻病毒NS4B互作的宿主蛋白

为探究NS4B蛋白在牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)感染和复制过程中的作用，利用酵母双杂交(yeast two hybrid, Y2H)技术筛选与BVDV NS4B蛋白互作的宿主细胞蛋白质。以构建的BVDV NS4B重组质粒pGBKT7-NS4B作为诱饵质粒，采用酵母双杂交技术，与牛肾细胞MDBK-cDNA文库进行杂交。将获得的阳性克隆菌落经质粒抽提、测序分析和免疫共沉淀试验，确定可与NS4B互作的宿主细胞蛋白。结果表明，成功构建了诱饵质粒pGBKT7-NS4B,该质粒可在酵母菌中表达NS4B蛋白。采用酵母双杂交技术从牛肾细胞基因组文库获得14个阳性克隆，阳性克隆经测序、互补试验、免疫共沉淀验证后明确可与BVDV NS4B蛋白互作的宿主蛋白为SYNGR2和RABACI。上述研究为进一步研究BVDV NS4B蛋白在BVDV感染和复制中的作用机制奠定了理论基础。     

USP18分子通过Ⅰ型干扰素通路影响猪瘟病毒复制的研究

猪瘟病毒(CSFV)感染无特定病原(SPF)猪后,分离猪外周血单个核细胞进行转录组分析,数据显示病毒感染后泛素特异性蛋白酶18(USP18)基因的转录水平明显上升。为研究USP18分子对CSFV复制的影响及其作用机制,本研究通过构建过表达USP18的细胞系及应用特异性小干扰RNA下调表达USP18的方法,采用荧光定量PCR验证USP18对CSFV增殖的影响,结果显示USP18分子能够促进CSFV的复制;通过检测IFN-β、NF-κB及ISRE的启动子活性及I型干扰素(IFN-I)信号通路的下游分子m RNA的转录水平,采用荧光定量PCR和双荧光酶报答试验分析USP18对IFN-I信号通路的影响,结果显示USP18分子抑制IFN-I信号通路。以上结果表明CSFV通过诱导USP18分子的上调表达,抑制了IFN-I途径,从而逃避天然免疫防御,进而促进自身的复制。本研究为明确CSFV与宿主之间的相互作用及CSFV致病机制提供参考依据和奠定基础。     

新城疫病毒classⅠ和classⅡ微型基因组的构建及其复制效率差异性的比较

为研究新城疫病毒(NDV)微型基因组的复制效率,本实验分别以NDV 9a5b(ClassⅠ)病毒株和La Sota(ClassⅡ)病毒株基因组骨架为平台,插入绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因替代病毒的整个编码区,只保留与病毒复制、转录和病毒包装相关的调控区域Leader和Trailer,构建获得的微型基因组DNA片段反向插入反向遗传载体TVT(0.0)中,从而构建了两株病毒的微型基因组质粒。同时,将相应病毒株的NP、P和L 3个基因分别克隆至pCI-neo载体中,构建3个辅助质粒的真核表达系统。通过将微型基因组和辅助质粒共转染BSR T7/5T7-5细胞,表明在相同转染条件下,无论使用哪一种辅助质粒,ClassⅡ型微型基因组的报告基因的表达效率均高于ClassⅠ型微型基因组。实验结果显示ClassⅠNDV转录复制系统的运行效率明显低于ClassⅡNDV。     

逆转录病毒载体介导的T7RNA聚合酶在猪源细胞PK15及SK6中的稳定表达

本研究旨在利用逆转录病毒载体系统将T7RNA聚合酶基因导入猪源细胞,并对该基因的遗传稳定性进行分析。作者克隆并构建含T7RNA聚合酶基因的逆转录病毒重组载体pBABEpuro/T7。将pBABEpuro/T7与水泡性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获重组病毒并用该病毒在Polybrene的介导下分别感染PK15和SK6细胞,用嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。对此阳性细胞进行传代,并对不同代次细胞中的T7RNA聚合酶基因进行扩增,确定其遗传稳定性。用直接荧光法和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测细胞中T7RNA聚合酶基因的表达及其活性。结果表明T7RNA聚合酶能够被稳定地整合进靶细胞基因组内,细胞系内的T7RNA聚合酶具有较好的转录活性,其活性传代不减弱。免疫荧光检测发现所表达的T7RNAP蛋白具有良好的反应原性。本研究表明T7RNA聚合酶基因稳定整合进猪源细胞,该基因的稳定整合为建立高效体内病毒拯救系统提供了良好的工具。     

稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的BHK细胞系的构建

猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。     

猪瘟病毒衣壳蛋白与宿主细胞核仁素蛋白相互作用

为鉴定猪瘟病毒(CSFV)衣壳蛋白(C)与宿主细胞核仁素(NCL)蛋白的相互作用,本研究将重组质粒p EGFP-CSFV-C转染至猪睾丸细胞(ST)中,采用GST pull-down和免疫共沉淀方法沉淀ST细胞中的NCL蛋白,通过共聚焦显微镜分析C蛋白和NCL蛋白的共定位情况。结果表明,CSFV C蛋白与NCL蛋白在核仁中存在共定位现象,并且在体外和转染细胞中均存在相互作用。NCL蛋白被抑制后,CSFV的复制能力下降。本研究为进一步分析C蛋白核转运机制以及在CSFV复制过程中的功能提供了实验依据。     

稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163的HEK293细胞系的建立

为构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)受体CD163的HEK293细胞系,本研究采用RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞(PAM)总RNA中扩增CD163基因并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒pc DNA-CD163。将该重组质粒转染HEK293细胞,并利用G418筛选、纯化,获得了稳定表达CD163受体蛋白的HEK293CD163细胞系。RT-PCR、流式细胞术及western blot检测结果表明,该细胞系在传代至15代后,CD163在HEK293细胞中仍然能够稳定表达。在该细胞系中接种PRRSV后进行间接免疫荧光及噬斑试验检测表明,病毒能够通过CD163感染HEK293CD163细胞并在其中增殖。该细胞系的建立为进一步研究PRRSV的侵入细胞和致病机制提供了病毒在体外增殖的易感细胞系。     

“拯救”NA－1株鹅源副黏病毒微型基因组的构建

根据GenBank上已发表的NA-1株GPMV全序列设计并合成2对特异性引物,克隆得到GPMV的Leader及Tralier序列,与T7启动子、丁肝病毒核酶序列及T7终止子重叠PCR连接后,将连接产物克隆至改造的pVAXl载体中,并用增强型绿色荧光蛋白基因代替GPMV的整个编码区,只保留与病毒复制、转录和病毒包装相关的调控序列,酶切、测序及荧光鉴定后,与pCI-NP、pCI-P及pCI-L等3个辅助质粒共转染可表达T7RNA聚合酶的VT7细胞系,结果绿色荧光蛋白得到表达,表明成功构建了"拯救"病毒的微型基因组.     

I类新城疫病毒NDV08-004株微型基因组的构建及其功能鉴定

目的本研究旨在构建Ⅰ类新城疫病毒NDV08-004的微型基因组和辅助质粒,为构建病毒拯救体系奠定基础。方法根据Ⅰ类新城疫病毒NDV08-004的全基因组序列,采用SOE方法将增强绿色荧光蛋白基因(eGFP)插入NDV08-004的3’-Leader和5’-Trailer区域之间后反向插入转录载体pOLTV5中,构建了NDV08-004的微型基因组pLGT-03。将pLGT-03转染辅助病毒NDV08-004感染的表达T7RNA聚合酶BSRT7/5细胞进行功能鉴定。采用RT-PCR将NDV08-004的NP、P和L蛋白基因亚克隆入表达载体pCI-neo中,分别构建了三个辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L。通过构建的微型基因组pLGT-03和三个辅助质粒按照一定的比例共转染BSRT7/5细胞来验证辅助质粒的功能。结果微型基因组pLGT-03转染辅助病毒感染的BSRT7/5细胞后可见明显荧光,表明微型基因组构建成功。微型基因组和辅助质粒共转染可见荧光表达,表明三个辅助质粒均具有相应的功能。结论表明微型基因组和辅助质粒均具有相应的功能,为建立NDV08-004的反向遗传操作平台奠定了基础。     

猪瘟病毒N~(pro)蛋白及细胞内环境改变对其IRES活性的影响

位于猪瘟病毒(CSFV)基因组5'端非翻译区(UTR)的内部核糖体进入位点(IRES)在调控CSFV基因组的翻译中发挥重要的作用,为探索CSFV自身蛋白以及细胞内环境改变对IRES活性的影响,本研究构建了包含CSFV IRES在内的荧光素酶报告基因质粒,采用编码CSFV非结构蛋白N~(pro)和NS5A蛋白表达重组质粒转染细胞,或通过葡萄糖剥夺、氨基酸剥夺、氧化应激、血清饥饿等条件分别处理细胞,结果显示N~(pro)蛋白比之前报道的NS5A蛋白具有更显著的IRES抑制效果,并且抑制程度呈浓度依赖性;氨基酸剥夺、氧化应激及血清饥饿时可以显著降低CSFV IRES的活性,而葡萄糖剥夺对其活性无显著影响。本研究明确了CSFV非结构蛋白N~(pro)以及细胞内环境的改变可以调控IRES的活性,为进一步阐明CSFV复制增殖的分子机制提供新的实验依据。     

非典型性猪瘟病毒云南株/石门株嵌合病毒的构建和拯救

为研究猪瘟病毒(CSFV)云南株(YN株)突变位点在致非典型性猪瘟中的作用,本研究在CSFV石门株全长感染性克隆的基础上,利用分子克隆技术,将CSFV YN株的1 510位～1 532位、2 471位～2 658位、3 152位～3 176位和11 785位～11 816位突变位点基因序列替换CSFV石门株的相应基因序列,构建出嵌合的CSFV感染性克隆质粒pAC-SM-YN。全基因测序鉴定后,体外转录得到病毒RNA,经脂质体转染PK-15细胞方法拯救出了嵌合病毒vSM-YN。经直接荧光染色、对突变位点RT-PCR以及ELISA检测表明拯救嵌合病毒vSM-YN传代稳定。本研究为研究CSFV结构蛋白、病毒致病机理、新型疫苗,尤其是非典型猪瘟的致病机理奠定了基础。     

稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系的构建及鉴定

设计1对特异性引物扩增痘苗病毒VTF7-3株的T7RNA聚合酶基因并连接真核表达载体,利用Lipo-fectamineTM2000将重组质粒转染BHK-21细胞,G418筛选2周后,转入验证质粒pT7-HN,经Western-blot和间接免疫荧光鉴定后证实获得了1株能稳定表达T7RNA聚合酶的VT7细胞系。构建的VT7细胞系传30代还能够稳定的表达T7RNA聚合酶,为下一步建立有效的鹅源副黏病毒病毒反向遗传操作平台奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒Nsp12与宿主RNF7蛋白相互作用的研究

猪流行性腹泻病毒(PEDV)编码的Nsp12蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性,在PEDV复制过程中发挥重要作用.为了研究与Nsp12蛋白相互作用的宿主细胞蛋白对PEDV复制的影响,本研究利用酵母双杂交技术将诱饵质粒pGBKT7-Nsp12与猪小肠绒毛上皮细胞(IECs)cDNA酵母表达文库进行杂交筛选,...     

鸡传染性支气管炎病毒H120疫苗株全长cDNA感染性克隆的构建

根据鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法对其基因组分10个片段进行扩增,并克隆至pMD19-T载体中进行测序。经BsaⅠ限制性内切酶酶切后,采用优化的连接策略将各DNA片段进行连接,获取H120株的基因组全长cDNA,其5′端具有完整的T7RNA聚合酶启动子的核心序列,3′端具有polyA尾巴结构。通过T7RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA,转染BHK-21细胞并进行病毒拯救。采用RT-PCR、测序及鸡胚传代对拯救出的病毒株进行鉴定。结果表明成功地从H120株的基因组全长cDNA拯救出病毒H120-R株,为进一步开展该病毒的分子致病机理研究、新型疫苗的研制等奠定了基础。     

猫杯状病毒2280株反向遗传系统的构建

为构建猫杯状病毒(FCV)2280株感染性克隆,本研究在FCV 2280株基因组5'末端和3'末端分别引入T7 RNA聚合酶启动子和丁型肝炎核酶(Hdv Rz)序列;并将FCV基因组中唯一的XbaⅠ限制性酶切位点序列进行同义突变作为遗传标记;将基因组分为3段分别进行RT-PCR扩增,通过酶切依次克隆于pOK-12载体中,构建FCV基因组全长cDNA重组质粒。以其为模板经体外转录制备其全长基因组RNA,并在5'末端加帽,转染CRFK细胞,24 h后出现典型的细胞病变。提取出现细胞病变的病毒液的总RNA制备cDNA模板,PCR扩增FCV遗传标记片段并进行XbaⅠ酶切鉴定分析,表明拯救的病毒为FCV重组病毒。而且拯救的病毒生长动力学与亲本病毒无明显差异。本实验为进一步研究FCV的生物学特性和致病机制奠定了基础。