表达扎伊尔型埃博拉病毒囊膜糖蛋白重组水泡性口炎病毒的构建

埃博拉病毒(EBOV)能够引起一种人畜共患急性出血性传染病,即埃博拉出血热.研制安全、有效的抗病毒疫苗具有重要意义.本研究利用水泡性口炎病毒(VSV)印第安纳株反向遗传操作系统,构建并拯救得到表达扎伊尔型埃博拉病毒(ZEBOV)囊膜糖蛋白GP的重组VSV (rVSV-ZEBOV-GP),通过westemblot和免疫荧光试验证明在重组病毒中ZEBOV GP蛋白获得正确表达;动物试验显示重组病毒对小鼠高度安全;中和试验结果表明重组病毒能诱导小鼠产生针对ZEBOV囊膜糖蛋白GP嵌合VSV假病毒粒的特异性中和抗体.本研究表明rVSV-ZEBOV-GP作为防控ZEBOV的储备性疫苗具有潜在的应用价值.     

莱斯顿型埃博拉病毒GP蛋白嵌合型水泡性口炎病毒的构建与免疫原性研究

莱斯顿型埃博拉病毒(REBOV)可以感染猪和非人类灵长类动物并引起动物发病和死亡,为制备安全、有效的REBOV重组病毒后备疫苗,本研究利用表达绿色荧光蛋白的水泡性口炎病毒(r VSV-EGFP)印第安纳弱毒疫苗株反向遗传操作系统,拯救出了REBOV GP蛋白嵌合型VSV(r VSV△G*GFP-REBOV-GP),并对其生物学特性进行分析,评估其作为REBOV活疫苗的安全性和有效性。激光共聚焦和western blot试验显示REBOV GP蛋白在嵌合病毒中获得正确表达;病毒生长动力学结果显示,r VSV△G*GFP-REBOV-GP与亲本株具有不同的生长特性;将r VSV△G*GFP-REBOV-GP接种小鼠,未引起小鼠发病,体重增长趋势与对照组一致,表明嵌合病毒具有良好的安全性;中和试验结果表明该嵌合病毒能够诱导小鼠产生针对REBOV GP的高滴度中和抗体。本研究制备的r VSV△G*GFP-REBOV-GP为进一步的动物免疫实验奠定了基础。     

表达马尔堡病毒囊膜糖蛋白GP重组新城疫病毒的构建及免疫原性评估

为研制安全、有效的抗马尔堡病毒(MARV)疫苗,本研究将人工合成的MARV GP基因利用新城疫病毒LaSota疫苗株反向遗传操作系统构建并拯救得到表达MARV糖蛋白GP的重组病毒(rLa-MARVGP),并以小鼠为动物模型对其安全性和免疫原性进行评价。Western blot和间接免疫荧光试验表明MARV GP能够正确表达,其分子量为130 ku;动物实验结果表明rLa-MARVGP对小鼠高度安全;rLa-MARVGP免疫小鼠能够诱导产生抗MARV GP囊膜嵌合水疱性口炎病毒假病毒的特异性中和抗体。本研究表明rLa-MARVGP作为防控MARV的储备性疫苗具有潜在的应用价值。     

表达猪流行性腹泻病毒纤突蛋白的重组水泡性口炎病毒构建和鉴定

为表达猪流行性腹泻病病毒(porcine epidemic diarrhea,PEDV)纤突蛋白,利用Mega7基于PEDV纤突蛋白氨基酸序列进行遗传进化分析,选择新发流行毒株纤突蛋白基因,以重组水泡性口炎病毒(rVSV_MT)为载体,在rVSV_MT基因组G和L间插入目的基因,通过反向遗传学技术拯救VSV_MT-S△19重组病毒,Western blot和RT-PCR鉴定重组病毒是否成功表达PEDV纤突蛋白,采用一步生长曲线鉴定VSV_MT-S△19在Vero细胞中的生长特性,并与弗氏佐剂混合后肌肉注射小鼠探究其在动物体内的免疫效果。遗传进化分析发现,插入rVSV_MT的纤突蛋白基因序列PEDV/CHN/SH-2012-5属于PEDV新发流行毒株GⅡ型; RT-PCR分析重组病毒表达纤突蛋白基因无突变; Western blot鉴定显示出PEDV纤突蛋白和VSV病毒特征条带;一步生长曲线表明重组病毒VSV_MT-S△19体外复制滴度可达108TCID50/m L,与VSV_MT-GFP无显著性差异(P> 0. 05);小鼠动物试验结果表明,重组病毒成功激发PEDV中和抗体产生,与对照PBS接种组差异显著(P<0. 05)。研究表明,利用重组水泡性口炎病毒(rVSV_MT)为载体表达GⅡ型PEDV纤突蛋白能有效激发机体产生高水平中和抗体,为PEDV亚单位疫苗的研制提供了理论和实践依据。     

水泡性口炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

将水泡性口炎病毒（VSV）经差速离心和蔗糖密度梯度离心法进行纯化后,以纯化的VSV作为免疫原免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选能稳定分泌抗VSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对制备出的抗VSV单抗的特异性、抗体亚类等生物学特性进行鉴定。结果显示,试验成功筛选出2株能稳定分泌抗VSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1A2、4C3。ELISA鉴定结果表明,2株单抗均能特异性地与VSV结合,而与口蹄疫病毒（FMDV）、猪水泡病病毒（SVDV）均不发生交叉反应;诱生小鼠腹水产生的抗体效价可达1∶25 600～1∶51 200。杂交瘤细胞染色体核型鉴定结果显示,杂交瘤细胞染色体数为95～105,均高于2个亲本细胞的染色体数目,说明这2株细胞是两者的杂交产物。抗体亚类鉴定结果显示,所获得2株单抗1A2、4C3均为IgG1。Western blot分析结果表明,1A2可识别VSV G蛋白。2株抗VSV单克隆抗体的成功制备将为VSV快速检测方法的建立以及检测试剂的研制等奠定基础。     

水泡性口炎病毒N蛋白的原核表达和鉴定

根据GenBank已公布的水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)N基因序列,设计上、下游引物,以VSV-NJ核酸为模板进行RT-PCR扩增,扩增产物克隆至pET52 3C/LIC载体中,成功构建了pET52-VSV N表达载体。将pET52-VSV N重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行融合表达,经SDS-PAGE电泳分析,可见VSV N蛋白成功得到了表达,融合蛋白的分子量约为50KD,Western blot分析表明所表达的重组蛋白可与VSV阳性羊血清发生特异性反应,表达的VSV N蛋白可以作为建立VSV抗体检测方法的抗原。     

我科学家首次发现埃博拉病毒囊膜糖蛋白合成机制

正近日,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所基础免疫团队郑永辉研究员和王斌博士在国际上首次阐明了埃博拉病毒囊膜糖蛋白的合成机制,为抗埃博拉病毒药物的研发提供了新的理论依据。相关研究成果于2月14日在国际著名学术期刊《生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry)》上在线发表。埃博拉病毒于20世纪70年代     

水泡性口炎病毒糖蛋白主要抗原决定区片段基因的原核表达和纯化

参照GenBank中水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)G蛋白基因的核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增约为810bp的G基因片段,并将其克隆到pGEX-4T-1表达载体上,将经PCR、酶切鉴定以及测序分析正确的阳性重组质粒命名为PGEX-G810,之后将其转化至表达菌株E.coli BL21(DE3),经IPTG进行诱导表达;表达产物经SDS-PAGE、Western blotting等方法进行检测。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在,相对分子质量约为60 000;包涵体经变性、复性、Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化后,分离得到复性的融合蛋白。纯化的融合蛋白能与VSV阳性血清发生特异性免疫反应,证明表达的目的蛋白具有良好的抗原性。     

表达水泡性口炎病毒双血清型G蛋白重组腺病毒的构建及对小鼠的免疫原性分析

旨在以人5型复制缺陷型腺病毒为表达载体,构建表达水泡性口炎病毒(VSV)双血清型G蛋白的重组腺病毒。利用融合PCR技术扩增VSV-IN-G-NJ-G基因并将其克隆至腺病毒穿梭载体pacAd-CMV K-NpA中。通过PacⅠ酶线性化后,与同样经PacⅠ酶线性化的骨架载体pacAd5 9.2-100共转染AAV-293细胞,获得重组腺病毒rAd-VSV-IN-G-NJ-G。该重组腺病毒于AAV-293细胞连续传代至20代效价稳定。经间接免疫荧光和Western blot检测,G蛋白获得正确表达。将重组腺病毒接种小鼠,利用间接ELISA及病毒中和试验检测其体液免疫水平,结果显示可诱导产生VSV特异性抗体,其中和抗体水平在1∶32;利用淋巴细胞增殖试验检测细胞免疫水平,结果表明可以引起接种小鼠强烈的淋巴细胞增殖。构建的重组腺病毒免疫小鼠后可以引起一定的体液免疫和细胞免疫反应,为表达VSV糖蛋白重组腺病毒疫苗的深入研究奠定了基础。     

表达西尼罗病毒囊膜糖蛋白PrM/E重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究

西尼罗病毒(WNV)是一种可以导致人与动物死亡的人兽共患病的虫媒病毒。为构建表达WNV Pr M/E蛋白的重组新城疫病毒(NDV)La Sota疫苗株并对其免疫原性进行评价,本研究利用反向遗传学操作技术将人工合成的WNV pr M/E基因插入至NDV基因组P和M基因之间,构建重组病毒r La-WNV-Pr M/E。以重组病毒分别感染BHK-21细胞和免疫小鼠,利用RT-PCR、间接免疫荧光、ELISA和流式细胞术(FACS)检测Pr M/E蛋白的表达情况及免疫效果。结果显示,WNV-Pr M/E蛋白在BHK-21细胞中获得正确表达,免疫小鼠可以诱导其产生高水平的抗Pr M/E蛋白特异性Ig G,并且诱导产生WNV E蛋白表位特异性CD4+和CD8+T细胞免疫反应。以上结果表明本研究构建的r La-WNV-Pr M/E可以作为一种具有前瞻性和储备性且安全有效的西尼罗热防控候选疫苗,对我国应对该病的潜在威胁具有十分重要的意义。     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组鸡痘病毒的构建和鉴定

将 RVG基因插入到鸡痘病毒表达载体 p UTA- 2 Sm a 位点获得重组转移载体 p U TA- RVG,利用脂质体转染已感染中国鸡痘病毒疫苗株 2 82 E4株 2～ 3h的鸡胚成纤维 (CEF)细胞 ,收获病毒后 ,用 Brd U法进行加压筛选重组病毒 ,PCR检测到重组病毒 RVG基因 ,Western blot检测出 RVG,从而证实已成功构建了表达 RVG的重组鸡痘病毒     

猪瘟病毒囊膜糖蛋白的研究进展

猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CFSV;或称Hog cholera Virus,HCV),属黄病毒科瘟病毒属[1].感染猪可引起高热、皮肤变色,大量内出血及神经系统症状等,死亡率很高.     

水疱性口炎病毒糖蛋白基因的克隆和表达

对一株实验室保存多年的水疱性口炎病毒(VSV)的囊膜糖蛋白(VSV_G)基因进行了克隆和测序,并且构建了重组VSV_G真核系统表达载体。结果表明克隆的VSV_G基因全长1536个核苷酸(nt),其编码的G蛋白长为511个氨基酸(aa),氨基酸序列与20个Indiana血清型VSV毒株的同源性在95.4%左右(94.1%～98.0%)。种系发生树分析表明此病毒株属于水疱病毒属的VSV_Indiana血清型。经免疫荧光检测证明构建的重组VSV_G表达质粒pCIVG5和pCRVG6转染23T细胞后能够有效地转录和表达,这为进一步开发利用VSV_G奠定了基础。     

基质蛋白第221、226位氨基酸位点发生突变的重组水泡性口炎病毒构建和致病性研究

重组水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)是一种具有良好应用前景的病毒载体,可用于制备疫苗和治疗肿瘤,但该载体可导致实验动物产生神经毒性,因此其使用仍存在安全性问题。为减低乃至去除野生型VSV的致病性,对该病毒基质蛋白M的第221、226位氨基酸进行了定点突变,制备了新型重组VSV,并围绕新型重组病毒的致病性展开了体外和体内试验。在体外试验中,221、226双位点突变重组VSV病毒(VSVM221,226)的复制能力相比野生型VSV(VSVXN2)降低可达20倍,且激发IFN-β达(871±1.3)pg/m L。在体内试验中,接种VSVM221,226小鼠体重下降仅约(8.9±0.2)%和(12.3±0.4)%,而接种VSVXN2小鼠体重下降高达(32.6±0.5)%和(30±2)%,且有死亡现象发生。试验结果表明,相比VSVXN2以及221、226单位点突变VSV,VSVM221,226的致病性显著降低,其致弱效应可能是由于病毒感染有效激活宿主细胞产生Ⅰ型干扰素所致。VSVM221,226有希望成为一个安全、有效的疫苗载体。     

血清型特异性水泡性口炎病毒同步检测和鉴别方法的建立

为准确地鉴别诊断新泽西型水泡性口炎病毒（VSV-NJ）和印第安纳型水泡性口炎病毒（VSV-IND）,本研究建立了可以同时检测和鉴别诊断VSV-NJ和VSV-IND的双重荧光RT-PCR方法,并对方法性能进行了测试和初步应用。结果显示,建立的双重荧光RT-PCR特异性为100%,最低检测限1~10个拷贝/μL,扩增效率E值均在99%左右,R2值分别为0.999和0.998。VSV-NJ和VSV-IND单荧光RT-PCR与双重荧光RT-PCR的相关性系数分别为0.999 7和0.999 4,与单荧光RT-PCR相比,该引物和探针的双重体系混合对特异性和敏感性均未产生明显干扰。用已知VSV-NJ及VSV-IND阳性核酸验证,发现符合率为100%,对50份临床样品的检测均为阴性,与单荧光RT-PCR结果一致。本研究建立的双重荧光RT-PCR方法实现了VSV-NJ和VSV-IND的同步检测和鉴别,为水泡性口炎的防控提供了技术储备。     

水泡性口炎病毒N蛋白原核表达及免疫原性分析

本研究旨在克隆和表达水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV）特异性抗原N蛋白,进而纯化并分析其免疫原性。根据GenBank中已发表的VSV基因组N基因序列,分别合成VSV两种不同血清型的N基因,经序列对比分析后,设计合成1对特异性引物,PCR扩增获得约1 300 bp的N基因片段,将目的片段亚克隆至pCold Ⅰ原核表达载体中,经IPTG诱导表达后,采用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化重组N蛋白。SDS-PAGE分析表明,N基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白大小约为50 ku;Western blotting检测结果表明,该重组蛋白与VSV多克隆抗体发生特异性反应。本试验成功构建了VSV-IND和VSV-NJ的原核表达载体,实现了N蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,纯化后的重组蛋白具有良好的免疫原性。     

整合埃博拉病毒囊膜蛋白的伪病毒的构建

埃博拉病毒(EBOV)是一种能够引起人类和灵长类动物的烈性出血热的病原体,致死率高达90%。对该病毒活病毒的操作仅能够在生物安全4级实验室进行,高级别的生物安全要求限制了病毒的研究。为建立一个能够表达EBOV囊膜蛋白(GP)的伪病毒,本研究利用表达GP基因的重组质粒,与囊膜蛋白缺失、表达绿色荧光蛋白(GFP)的人免疫缺陷病病毒1型(HIV-1)基因组的重组质粒共转染人胚胎肾细胞(293T),以包装整合含有囊膜蛋白的伪型EBOV。结果表明,EBOV GP蛋白能够正确组装至HIV-1病毒表面;利用组装的伪型病毒粒子感染293T、人宫颈癌细胞(Hela)、人骨肉瘤细胞(Ghost)和非洲绿猴肾细胞(Vero)几种细胞系,结果显示在不同细胞系中均可检测到GFP蛋白的表达,表明组装的伪型病毒可以模拟野生型病毒感染相关细胞。本研究构建的伪型EBOV作为活病毒的替代工具,为研究EBOV的感染机制及中和抗体的筛选提供了一个良好的平台。     

水泡性口炎病毒诱导BHK-21细胞的凋亡

采用HE、Giemsa染色、透射电镜以及DNA琼脂糖凝胶电泳等研究了水泡性口炎病毒（VSV）诱导BHK-21细胞凋亡的过程。结果显示：VSV感染BHK-21细胞后,光镜下可见细胞圆缩,细胞器固缩、核仁消失、染色质凝聚和核碎裂、凋亡小体出现;电镜下观察到染色质聚集形成典型的新月形,胞浆中充满大量空泡,细胞核因染色质凝聚也发生了空泡化;1％的琼脂糖凝胶电泳出现180-200bp整倍数的DNA梯形条带。结果表明,VSV诱导BHK-21细胞凋亡是其致细胞病变的主要表现形式之一。     

Matrix蛋白和G蛋白双位点突变型水泡性口炎病毒的构建及生物学活性观察

重组水泡性口炎病毒(Vesiclar stomatitis virs,VSV)是一种具有良好应用前景的病毒载体,可应用于制备疫苗和治疗肿瘤,但该载体仍存在安全性问题,高剂量注射实验动物可导致产生神经毒性.为减低乃至去除野生型VSV的致病性,作者针对VSV毒力因子,构建了Matrix蛋白和G蛋白双位点突变型重组VSV,该病毒敲除了原来Matrix蛋白的第51位精氨酸和G蛋白C末端的28个氨基酸.相比野生型VSV,新病毒的致病性显著降低.试验也证实这个致弱的病毒是由于2种不同弱化机理共同作用所致,即Ⅰ型干扰素作用和复制能力减低.新型VSV病毒载体有希望成为一个更安全、有效的疫苗载体.