禽网状内皮组织增生症病毒山东SD2101株的分离鉴定及全基因组序列和致病性分析

禽网状内皮组织增生症病毒（reticuloendotheliosis virus，REV）是一种常见的禽肿瘤性病毒，可诱发感染鸡群免疫抑制，给我国养禽业带来巨大经济损失。本试验运用DF-1细胞接种方法，在山东省某父母代白羽肉种鸡场鸡群中分离到1株REV，将其命名为SD2101株。为掌握SD2101株基因组遗传演化特征，设计合成6对引物，通过PCR扩增获得了SD2101株的前病毒全基因组序列，并与GenBank下载的参考毒株进行了序列比对和遗传进化分析。结果显示：SD2101株前病毒全基因组具有典型复制完整型逆转录病毒的基因组结构，与2011年分离自江苏省的鸡源REV野毒株HA1101同源性最高；遗传进化分析发现，SD2101株与大部分国内分离株处于同一进化支上。为了解SD2101株的致病性，将分离毒株接种于1日龄SPF鸡，通过体质量、免疫器官指数和灭活疫苗免疫应答等指标进行评价。结果显示，SD2101株对1日龄SPF鸡的生长和免疫功能具有明显的抑制作用。综上，与参考毒株相比，SD2101株基因组序列变异程度较小，具有一定致病作用，提示在生产中应加强对REV的关注和监测。本研究为REV的流行病学研究提供了信息资料。     

3株猪Ⅱ型圆环病毒的分离及基因组序列分析

为了解混合感染中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)毒株的遗传变异特性,本研究对2009年与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的病料中分离的3株PCV2通过PCR、免疫荧光等进行初步鉴定,并扩增病毒全基因组,用DNAStar对序列进行拼接和分析。结果表明:分离得到的HUN-09株(GQ449670)、HUB-09株(GQ449671)和SD-09株(GQ449669)3个PCV2毒株其全基因组长度均为1768bp,与国内外参考毒株核苷酸序列同源性为95%～99.7%,3个分离株之间的核苷酸序列同源性为97.6%～98.5%,与PCV1分离株核苷酸序列同源性为69%～70%。进化分析表明,本研究2009年分离的3株PCV2属于基因型PCV-2a。     

整合REV LTR的自然重组马立克氏病毒GX0101的全基因组序列分析

GX0101是一株整合禽网状内皮组织增生症病毒 (reticuloendotheliosis, REV) 长末端重复序列 (LTR) 的重组马立克氏病病毒 (Marek′s disease, MD)。本研究基于MDV GX0101的细菌人工染色体感染性克隆利用高通量测序技术完成了对其全基因组的序列分析。GX0101全基因组长178101bp, 其基因组的TRL、UL、IRL、IRS、US和TRS区分别长12758bp、113572bp、12741bp、12700bp、11695bp、13134bp。GX0101全基因组仅含有一个REV LTR重组片段,位于其基因组US区的sorf1中,sorf2基因前267bp碱基处。与rMd5不同,GX0101含有一个sorf2基因。通过与已发表的近10株MDV的比较, 发现GX0101与英国分离株C12/130的两个不同毒力的感染性克隆pC12/130-10和pC12/130-15同源性最高。GX0101的全基因组序列的比较分析,有助于进一步阐明MDV致病性、传播性相关的基因,也有助于揭示不同地域间MDV的遗传变异和演化关系。     

禽网状内皮组织增生症病毒的分离鉴定、全基因序列分析及致病性试验

本试验采集广东某鸡场疑似禽网状内皮组织增生症患病鸡病料并进行处理,经接种DF1细胞、聚合酶链式反应（PCR）及特异性间接免疫荧光试验（IFA）,分离鉴定出1株禽网状内皮组织增生症病毒（REV）,命名为 GD1210。依据已发表的REV前病毒全基因组序列设计并合成6对引物,采用分段扩增的方法完成了分离株的全基因组序列测定。结果显示,该分离株基因组序列全长8443 bp。将该分离株的基因序列与国内外各参考株相应序列进行同源性比对分析,与SNV株亲缘关系最近,核苷酸同源性最高。将该分离株感染1日龄SPF鸡以鉴定其致病性,结果显示该分离株使SPF鸡产生严重的免疫抑制作用。     

鸡痘病毒分离株及疫苗株整合网状内皮组织增生病病毒的基因分析

为了解山东地区鸡痘病毒(FPV)野毒流行株整合禽网状内皮组织增生病病毒(REV)前病毒的情况,同时比较FPV分离株和弱毒疫苗株整合REV前病毒序列的差异,本研究对山东不同地区的14个FPV分离株和国内外不同厂家的5个FPV疫苗株进行了REV前病毒整合区基因PCR扩增、核苷酸序列测定及基因分析.结果表明14个FPV分离株均整合了几乎全长的REV前病毒序列,这些序列与美国分离的FPV整合株AF246698的整合序列同源性最高,与REV标准株同源性较低;疫苗株均仅整合部分或完整的REV-LTR序列,但国产与进口疫苗株的整合序列不同,国产疫苗整合的LTR片段相对较小.研究表明所分离的山东FPV分离株均整合全长REV序列,疫苗株仅整合REV-LTR序列.然而FPV整合病毒株的致病特性、整合疫苗的安全性及对整合FPV野毒的免疫保护作用有待于进一步研究.     

国外禽痘病毒疫苗自然重组株整合序列的研究

本文根据禽痘病毒（FPV）基因组中禽网状内皮组织增生症病毒（REV）常见整合区域的序列设计合成一对引物，对国外一株FPV疫苗进行了PCR扩增，结果扩增出一条1478bp的片段，经过测序和序列分析表明该片段为REV和FPV的整合序列，FPV序列中整合了大小为193bp的REV长末端重复序列，进一步比较显示该序列与国外REV毒株APC566、713和SNV的同源性分别为：99．6％、98.0％和87．3％，与我国REV分离株HA9901的同源性只有83．6％。同时该REV整合序列与国外已经测定的FPV毒株AJ581527、AY255633、AF198100、AF006064和AF246698比较时发现，这些毒株中含有的REV序列不仅完全一致，而且REV序列的插入位点也完全相同。这说明国外FPV疫苗中不仅含有REV整合序列，而且已经存在多年了。     

龙胜凤鸡中一株A亚群禽白血病病毒的基因组分析及其对SPF鸡的致病性研究

为了解中国地方品系鸡中禽白血病病毒(ALV)的基因组序列特征及其致病性,本研究通过DF-1细胞接种、间接免疫荧光和PCR等方法,从某龙胜凤鸡保种鸡群的种蛋中分离到一株A亚群ALV(ALV-A),命名为SDAU14A1株,并对其全基因组进行测序。将该序列与不同参考病毒株进行序列对比,结果显示SDAU14A1分离株与日本矮脚鸡分离株Tym S_90全基因组同源性最高,其U3区同源性达到100%,而与其它中国地方品系鸡分离株同源性较低。人工感染试验显示该病毒分离株感染SPF鸡后不仅引起感染鸡的生长迟缓和免疫抑制,还能够诱发淋巴细胞肿瘤,特别是具有较强的水平传播能力。本研究有助于了解我国地方品系鸡群中ALV-A的分子演变及其致病性,为我国地方品系中ALV净化提供参考依据。     

鹅细小病毒HN株的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究鹅细小病毒(GPV)基因遗传变异特征,采集海南某养鹅场疑似鹅细小病毒感染的病料,将其处理后接种番鸭胚成功分离到一株病毒,经PCR鉴定为鹅细小病毒,命名为HN株,并获得了其全基因组序列,将该序列与GenBank数据库中登录的16条鹅和番鸭细小病毒基因序列进行了比对分析。结果显示,该株病毒基因组全长为5 106bp,由ITR、NS、VP构成,其中ITR为444bp,NS1为1 844bp,VP1为2 199bp;HN株与SHFX1201株的NS1基因和VP1同源性最高,分别达到99.8%和99.7%,与番鸭细小病毒株FM的NS1基因同源性最低,为82.7%;与90-0215株VP1同源性最低,为80.1%。HN株的遗传进化树可以看出,GPV可以分成明显的2个基因亚群,HN株与鹅细小病毒匈牙利株(B)、欧洲疫苗株(VG32/1)和台湾株(82-0321V、82-0321、06-0329)均处在第I亚群,且与安徽分离株Y株以及SHFX1201株同源性最接近,番鸭源匈牙利株FM单独处于第Ⅱ亚群。本研究丰富了GPV的数据资料,为研究GPV分类地位以及遗传进化关系提供了依据,同时也为研究GPV流行趋势和疫苗的开发奠定了基础。     

寿光鸡中禽网状内皮组织增生病毒的分离鉴定及其env基因序列分析

某寿光鸡群发生肿瘤病例,从瘦小的鸡中随机抽取10只鸡接种鸡胚成纤维细胞进行针对禽白血病毒（ALV）、禽网状内皮组织增生病毒（REV）和鸡马立克氏病毒（MDV）等三种肿瘤病毒的分离和鉴定,结果显示ALV和REV均为阴性,但分离到3株REV（SD1301、SD1302和SD1303）。对3株REV的env基因进行了扩增、克隆和序列分析,结果显示3株REV之间的env基因核酸同源性为100％,与国内参考毒株比较显示,3株REV分离自中国黑龙江的HLJR0901缘关系最近。本研究显示了地方品系鸡中REV感染的存在,表明要加强对我国地方品系中REV的检测和净化。     

猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767bp,10株为1 768bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株(10084F4、R14040及R14086)的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。     

禽痘病毒活疫苗中网状内皮组织增生病病毒的分离鉴定及其序列比较

为了从怀疑污染禽网状内皮组织增生病病毒（Reficuloendotheliosisvirus,REV）的禽痘病毒（Fcwlpoxvirus,FPV）活疫苗中分离病毒,将市场上购买的某些厂家的禽痘弱毒疫苗接种7日龄SPF雏鸡。在5d后采其抗凝血浆接种鸡胚成纤维细胞（chickenembryofibroblast,CEF）,在连续传2代后,用REV特异性单抗做间接免疫荧光试验,确认REV感染,命名为JS0809。提取感染细胞的DNA,采用PCR扩增env基因。测序分析表明,该毒株的env基因开放阅读框同大部分REV-毒株一致,为176lbp。JS0809的囊膜蛋白基因（envelopeproteingene,env）与国内已发表株的同源性高达96．0％-99．％。相对而言,它与早年分离到的毒株的同源性只有96％-97．3％,但与近几年的分离珠的同源性则均高达99．5％-99．8％。它与整合进FPV野毒株中的全基因组REV的env基因同源性很高为99．8％,而与整合进FPV疫苗株中全基因组REV的env基因同源性较低仅为97．3％。本研究证实了在我国生产的某些FPV疫苗中存在REV污染,所污染的REV的env基因更接近最近的流行野毒,这是国内第一次报道从禽痘弱毒疫苗中分离~qREV活毒。     

地方品种鸡ALV-J的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究扬州地方品种苏禽绿壳蛋鸡中禽白血病病毒(ALV)的来源及其变异趋势,本研究从扬州某规模化种鸡场病鸡中分离到多株病毒,并测定了1株ALV-J(JS18YZ09)的全基因组序列,对该全基因组序列进行比对分析,结果显示,分离株全基因组序列与2009年江苏地区蛋鸡分离株JS09GY3同源性最高,为93.7%,但其5'LTR和3'UTR区变异较大。其env基因则与2013年广东肉鸡分离株GD13GZ同源性最高。JS18YZ09株5'LTR序列含有多至6个潜在转录因子结合位点C/EBPalp,同时U3区有11 bp的缺失,在其3'UTR的rTM区存在175 bp的缺失。综合5'LTR,env和3'UTR区序列特征,推测引起本次地方品种苏禽绿壳蛋种鸡禽白血病的ALV-J很可能来源于江苏地区蛋鸡分离株JS09GY3,但其可能已经与广东地区株GD13GZ株发生了重组,且有新的变异趋势。本实验对苏禽绿壳蛋鸡ALV分子流行病学的分析研究丰富了ALV的生物信息数据库。     

犬瘟热病毒NT株分离鉴定、全基因测序与分析

为分析我国犬瘟热病毒的流行性特点及阐明该毒株的基因特征与遗传进化情况。本研究用表达SLAM受体的犬源Vero细胞系对犬瘟热病毒分离培养,并从南通、安徽两地收集的疑似犬瘟热病料(肺,脾)中分离出一株犬瘟热病毒,运用RT-PCR、病毒的半数感染量(TCID₅₀)等方法对分离株进行鉴定,从而确定分离株为犬瘟热毒株,命名为CDV-NT-1。利用RT-PCR方法分段扩增此分离株的全基因组cDNA,用DNAStar软件比较CDV-NT-1分离株与GenBank上其他典型CDV毒株的同源性,并用Mega7.0软件进行系统进化分析。结果显示：CDV-NT-1株全基因组序列长度为15 544 bp;CDV-NT-1与野毒株的同源性在97.6%～98.5%,而与疫苗株Snyder Hill、Phoca、Onderstepoort的同源性只有92.1%,CDV-NT-1与Asia-I位于同一分支,与疫苗株处于不同的分支,属于Asia-1型。本研究结果为CDV的研究奠定了基础。     

进口白羽肉种鸡J亚群禽白血病病毒的全基因组序列分析

为研究引起我国部分地区进口白羽肉种鸡发生禽白血病疫情的病毒来源及其变异趋势,本研究对从进口白羽肉种鸡分离的8株J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的全基因组序列进行测序分析。8株ALV-Jgp85氨基酸遗传演化分析显示,其与ALV-J肉鸡分离株(包括ALV-J原型病毒株HPRS-103、美国肉鸡ALV-J分离株、国内肉鸡分离株)及蛋鸡分离株氨基酸序列同源性均低于92.5%,而与国内2014年父母代白羽肉种鸡ALV-J分离株GD14J2同源性较高,为93.5%~95.1%,处于同一分支。8株ALV-J的3'非编码区(3'UTR)在rTM区缺失203bp,DR-1区缺失7bp,E元件位置缺失125bp,仅保留了22个碱基,这一缺失特征与GD14J2一致。8株ALV-J的3'LTRU3区序列与ALV-J肉鸡分离株及蛋鸡分离株的相应基因序列同源性均低于91.5%,而与GD14J2病毒株的同源性较高,为94.3%~96.3%。序列分析发现U3区存在连续11bp缺失和164位碱基突变(C/T),该突变形成2个新的转录调控元件AIBREP1、AIBREP2。综合gp85、3'UTR和U3区序列特征,推测引起本次进口白羽肉种鸡禽白血病的ALV-J与国内2014年父母代白羽肉种鸡ALV-J分离株GD14J2为同一来源。但本次分离到的ALV-J病毒株也有新的变异趋势,这些变异是否与ALV-J致病性相关,还需进一步研究。本研究为ALV-J有效防控和净化提供数据支持。     

不同亚群禽白血病病毒5'LTR序列及启动子活性分析

对不同亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV) 5'LTR序列及其启动子活性进行了比较分析,以探讨LTR对ALV复制和致病力的影响。通过PCR分别扩增克隆了中国分离株GD08(ALV-A)、CD08(ALV-B)、HN06(血管瘤病变型ALV-J)和NX0101(骨髓瘤病变型ALV-J)毒株基因组5'LTR片段。与国内外不同亚群ALV分离株5'LTR核苷酸序列比较发现,NX0101株和HN06株与ALV-J国内外分离株的同源性最高,达90.8％~97.5％;GD08株与ALV-A国内分离株SDAU09C1的同源性最高,为94.6％;CD08株与GD08株和ALV-J各株的同源性高达90％以上。LTR中的R区具有较高的保守性,但CD08株U3区缺失11 bp,GD08株U5区与其它毒株的U5区差异较大。将LTR片段插入到pCAT-Basic载体的CAT报告基因前,通过转染DF-1细胞和测定CAT表达量来评价LTR的启动子活性。HN06株和NX0101株之间,以及GD08株和CD08株之间LTR启动子活性有差异,但差异不显著;而ALV-J毒株与GD08株和CD08株之间的LTR启动子活性差异显著。     

猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2,PCV2）的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767 bp,10株为1 768 bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株（10084F4、R14040及R14086）的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。     

鸡传染性法氏囊病病毒流行株VP1部分序列及VP2高变区序列分析

为了对鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的13个地方分离株与3个商品疫苗株的VP1-b基因(756 bp～1 522 bp)进行同源性和遗传进化分析,本研究对其进行RT-PCR扩增和序列测定.结果表明,获得的VP1-b基因长度均为767 bp; 13个分离株VP1-b节段核苷酸和氨基酸同源性分别为90.7 ％～100％和72.9％～100％,其中10株超强毒分离株与经典株、弱毒株、疫苗株的同源性较高,核苷酸和氨基酸同源性分别为95.7％～100％和94.5％～100％,所有12个超强毒分离株与超强毒参考病毒株的同源性均较低,核苷酸同源性仅为68.2％～79.2％;在遗传进化分析中,所有病毒株被分为3个分支,与相应病毒株的基于IBDV-VP2高变区(vVP2)序列的遗传进化树比较并结合同源性分析结果表明,除了弱毒株HUN0804之外,其它12个分离株可能均为重组病毒.据此推测,基因重组可能是目前IBDV流行的新趋势.     

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠区基因的克隆与序列分析

通过克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)分离株VP1-V3非重叠区基因,并对其进行序列分析,为鹅细小病毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断奠定理论基础.进行鹅胚病毒增殖,收集尿囊液,提取基因组,参考发表的B株序列,设计合成一对引物,经PCR扩增,克隆VP1-VP3基因,筛选阳性克隆,对其进行序列测定及同源性分析.结果表明,克隆的基因片段为901 bp,VP1-VP3基因共594 bp,编码198个氨基酸;弱毒株之间亲缘关系很近,核苷酸同源性99.5％～100％,氨基酸同源性98.5％～100％;强毒株与B株亲缘关系较近,核苷酸同源性96.6％,氨基酸同源性97.5％;弱毒株与强毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性92％～93％,氨基酸同源性96％～97.5％;弱毒株与B株亲缘关系最远,核苷酸同源性92.5％～93％,氨基酸同源性93.9％～95.5％.说明强毒株与弱毒株之间核苷酸序列存在差异.     

猪圆环病毒2b亚型的分离鉴定及基因组序列分析

为分离鉴定流行于重庆某猪场的猪圆环病毒2型,本研究从断奶仔猪多系统衰竭综合征猪的淋巴结病料中进行病毒学检测,病毒利用PK-15细胞增殖,其基因组序列经克隆、测序、拼接获得,并完成对全序列的生物信息学分析鉴定。结果获得了1株猪圆环病毒2型(命名PCV-2CQ1),该毒株的全序列大小为1 767bp,同源性分析发现该病毒与国内公布的PCV-2毒株同源性超过了90%,尤其与广西分离株同源性达100%;系统进化分析本分离病毒与浙江株(EU257511)、黑龙江株(HM038032)聚类到一起,形成一个进化分支,同属于PCV-2b型;对编码的衣壳蛋白分析发现,PCV-2CQ1Cap氨基酸发生了较大变异,与强毒株同源性较高,考虑到本病毒源自PMWS病猪,推测该毒株属于强毒株。