猪博卡病毒1/2型NS1基因与3/4/5型VP1基因的双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测不同基因型猪博卡病毒(PBo V)的PCR方法,本研究参考Gen Bank中登录的5种基因型PBo V1、PBo V2、PBo V3、PBo V4及PBo V5,设计了2对引物,通过对扩增条件进行优化,建立了PBo V1/2和PBo V3/4/5的双重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法可以同时扩增PBo V样品327 bp(PBo V1/2)和209 bp(PBo V3/4/5)的特异性片段,而对猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒等其他病原核酸扩增均为阴性。敏感性试验显示,该PCR方法对PBo V1/2和PBo V3/4/5的最低检出量分别为100拷贝/μL和1 000拷贝/μL。重复性试验显示该双重PCR检测方法具有良好的可重复性。应用该方法和单项PCR对30份临床样品进行检测,结果显示,同时感染PBo V1/2和PBo V3/4/5的阳性率为10%,并且两种方法符合率为100%。本研究建立的方法适合对PBo V1/2和PBo V3/4/5的联合检测。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用

为了研究猪圆环病毒2型(PCV-2)的分子生物学检测方法,试验根据GenBank中PCV-2的序列设计1对特异性引物,用PCR方法扩增猪PCV-2基因保守区序列,并对PCR扩增程序进行优化,对PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性进行研究;并用该方法对来自红河州规模化猪场的178份临床发病猪的肺脏和淋巴结样品进行检测。结果表明:该法具有快速、敏感、特异等优点,可用于PCV-2的检测和流行病学调查等;178份临床病料中有83份阳性样品,阳性率为46.6%。     

猪博卡病毒PCR检测方法的建立及其初步流行病学调查

猪博卡病毒(PBoV)是一种新出现的病毒,可以导致仔猪急性腹泻。为建立该病毒的检测方法,本实验根据PBoV的NS1基因序列设计一对引物,建立了PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法能够从PBoV阳性样品中特异性的扩增出482 bp的片段,而对猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒、沙门氏菌、大肠杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌的核酸样品均无非特异性扩增反应。敏感性试验显示,该PCR方法对PBoV的最低检测量为213.6拷贝。此外,应用该方法对湖北、湖南、河南省的各大猪场进行了流行病学调查,在79个规模化猪场采集的248份病料样品中有172份样品为PBoV阳性。其中,对4个发生腹泻疫情的规模化猪场进行了分群抽样调查,结果显示PBoV在腹泻猪群中的阳性率达到73.95%,并显著高于非腹泻猪群(47.83%)。本研究调查结果显示PBoV在国内猪群中流行广泛而且感染率高。     

猪圆环病毒3型套式PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种准确、快速检测猪圆环病毒3型(PCV-3)的方法,试验根据GenBank中PCV-3基因序列设计合成了内、外两对引物,建立了套式PCR方法,并检验了该方法的特异性、敏感性、重复性,同时用该方法对124份临床疑似病料进行检测。结果表明:用建立的套式PCR方法检测PCV-2、PRV、PPV、PRRSV、CSFV、TGEV、PEDV,均为阴性,外引物PCR扩增的检测灵敏度为17 ng DNA,内引物PCR扩增的检测灵敏度为0. 17 ng DNA。用该方法检测124份临床病料样品,外引物共检测出阳性样品22份,内引物共检测出阳性样品28份,青海省部分地区PCV-3的感染率达22. 58%(28/124)。说明该套式PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性,可以用于临床病料中低含量PCV-3的快速检测。     

基因3型猪戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

对GenBank中基因3型猪戊型肝炎病毒(HEV)代表毒株基因进行序列分析,最终选定ORF3基因的部分序列为目的基因,运用生物信息学软件设计特异性引物和探针,扩增获得目的片段,并构建重组载体pUC-19-ORF3。梯度稀释重组质粒制备标准品,初步建立检测基因3型HEV的实时荧光定量PCR方法。对建立的检测方法进行特异性、敏感性和重复性验证。结果表明,标准品浓度在10~8~10~2 copies/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.996。特异性试验结果显示,其它几种常见猪病病原体(猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒)未见典型扩增曲线。敏感性试验证实本方法的最低检测下限为10~1 copies/μL。重复性试验表明该方法对3个标准品检测结果的批内和批间变异系数低于2%。用该方法抽检59份进境猪肉样品,同时用普通RT-PCR方法对这些样品进行符合性试验,结果均为阴性。本研究所建立的检测方法不仅适用于进境猪肉样品中基因3型HEV的监控检测,而且还可用于基因3型HEV的早期临床诊断及分子流行病学调查。     

猪圆环病毒2型纳米PCR检测方法的建立及初步应用

建立一种高效、快捷、灵敏的猪圆环病毒2型(PCV-2)的检测方法,本研究根据PCV-2 ORF2基因的保守核苷酸区域设计一对特异性引物,建立了一种用于检测PCV-2的纳米PCR方法,对其反应条件进行优化,并用重组质粒PET28a-ORF2,以及PCV-2(DNA)、猪流行性腹泻病毒(cDNA)、猪瘟病毒(cDNA)和猪细小病毒(cDNA)分别作为模板,检测了该方法的灵敏性及特异性,同时对采集的临床样品进行检测。结果表明,该纳米PCR方法可以扩增出大小为636 bp的特异性片段;最佳的退火温度为54℃,胶体金浓度为0.5 nmol/L,最低可以检出1.0×10~2拷贝/μL,其灵敏度比普通PCR检测方法高10倍以上;对采集的新疆某大型种猪场的78临床份病料进行检测,其阳性检出数量比常规PCR的检出数量高4份样品,表明PCV-2纳米PCR方法具有较高的特异性和灵敏性。本研究建立的纳米PCR方法可用于PCV-2病原学的早期检测和分子流行病学调查;同时对于低病毒的临床样品的检测也提供了一种有效的技术手段。     

猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒3/4/5型双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪博卡病毒(PBoV)3/4/5型的双重PCR方法,本研究根据Gen Bank中登录的PEDV ORF1基因序列和PBoV不同基因型VP1序列,设计2对特异性引物,通过对PCR扩增条件的优化,建立了能够同时检测PEDV和PBoV3/4/5型双重PCR方法,特异性检测结果显示该方法对猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、猪链球菌核酸扩增均为阴性;敏感性检测结果显示,对PEDV和PBoV3/4/5型重组质粒标准品的最低检出量分别为837拷贝/μL和1 000拷贝/μL;临床样品的检测结果显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出PEDV和PBoV3/4/5型混合感染及单独感染。本研究建立的双重PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效检测PEDV和PBoV提供了技术帮助。     

RT-PCR检测猪瘟病毒方法的建立与应用

建立RT PCR检测猪瘟病毒的方法。根据已发表的猪瘟病毒E2基因 (囊膜糖蛋白gP55基因 )序列 ,设计合成了一对特异性引物 ,扩增片段的大小为 50 7bp ,用RT PCR技术对石门系标准株和 1 0株分离株进行检测。结果这对引物对标准株和 1 0株分离株均能扩增出与预期大小相符 50 7bpRT PCR产物 ,而对其他 6种猪病病原核酸的扩增结果为阴性。该RT PCR可检出 1 0 0pg的猪瘟病毒RNA模板 ,对人工感染猪不同组织样品进行检测 ,结果对白细胞抽提的核酸样品检出率最高为 1 0 0 % (2 4 / 2 4 ) ,其次为扁桃体、脾、肾 ,检出率为 83 3 % (2 0 / 2 4 ) ,再者为淋巴结 ,检出率为66 7% (1 6/ 2 4 )。对送检的 1 9份疑似猪瘟的病死猪病料组织进行RT PCR检测 ,结果有 1 6份样品为猪瘟病毒阳性。兔体交叉反应试验结果RT PCR阳性的 1 6份病料中 ,有 1 4份样品被判为含有猪瘟病毒 ,其他病料兔体交叉反应试验结果全为阴性     

猪圆环病毒2型和3型双重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速且同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和3型(PCV3)的方法,本研究根据GenBank中PCV2和PCV3的全基因组序列,设计了两对特异性引物,通过对扩增条件的优化,建立了能够同时检测PCV2和PCV3的双重PCR方法。该方法可以同时扩增PCV2的266 bp和PCV3的594 bp特异性片段,而对猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的基因组扩增结果均为阴性。对PCV2和PCV3的最低检出量均为100拷贝/μL。对广西境内100份健康屠宰猪淋巴结样品检测结果显示,单一PCR与双重PCR检测符合率为100%。结果表明,本研究建立了一种简便快捷、反应灵敏、稳定可靠且特异性强的双重PCR技术,为临床样品中PCV2和PCV3的快速检测提供了有效的技术支持。     

基于猪伪狂犬病毒gE基因的PCR法快速诊断猪伪狂犬病的研究

为了建立一种快速检测猪伪狂犬病毒(PRV)的方法,试验采用PCR法,并以NCBI公布的PRV Min-A株(登录号为AY170318.1)的gE基因序列为参考序列设计1对特异性引物,进行PRV基因的扩增,并对该检测方法的特异性、敏感性、重复性进行验证。结果表明:该PCR检测方法扩增的目的基因长348 bp;应用此方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)进行PCR扩增均未有条带出现;该方法能够检测到的最低DNA模板量为10 pg;重复性良好;应用此法对43份临床样品进行检测,检出率为65.12%(28/43)。说明该PCR检测方法可用于PRV的分离鉴定、临床病料检测和分子流行病学调查等。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用

根据GenBark中登录的猪圆环病毒2型基因序列,应用PrimerPremier5.0设计筛选一对扩增ORF2基因引物,建立从猪病料中直接检测PCV2感染的PCR方法。扩增PCV2阳性样品出现一条447bp的特异性DNA条带,扩增产物测序结果证实为PCV2ORF2基因序列。应用本方法扩增猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等常见猪病原均未出现特异性条带,表明方法特异;敏感性试验结果表明,样品DNA模板检测浓度可达到9.8×10-4ng/μL;重复性和稳定性试验结果表明,用本试验建立的PCR方法进行PCV2检测,结果稳定可靠。经病猪临床检测应用,在66份病猪样本中,PCV2感染阳性率为27.27%,且多与PRRSV、PRV、HCV、PPV等一种或多种病毒混合感染,混合感染比例达72.22%。     

非典型性瘟病毒SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测猪非典型性瘟病毒(APPV)的方法,本实验建立了APPV SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法特异性试验结果显示,除APPV外,猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒等常见猪病病原检测均为阴性,表明其特异性良好;该方法最低检测限为2.8×10~3拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验的组内、组间变异系数均小于1%。利用该方法对临床56份来自四川各地的临床病料样品进行检测,检出5份阳性样品,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。本研究建立的APPV荧光定量RT-PCR检测方法为APPV临床检出以及后期并发症的研究奠定了基础。     

10种猪常见病毒基因芯片检测方法的建立及初步应用

旨在建立一种可同步检测猪10种常见疫病病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)、猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)、猪巨细胞病毒(porcine cytomegalovirus,PCMV)和口蹄疫病毒(food-and-mouth disease virus,FMDV)的基因芯片检测技术,为临床病料的初步诊断及流行病学调查提供一个新的可靠方法。对10种病毒基因的序列进行分析,设计引物对靶基因进行PCR扩增,将纯化后的靶基因点制成芯片,通过Cy3标记特异性引物扩增病毒得到具有荧光标记的探针,然后与芯片进行杂交,扫描分析结果,建立其基因芯片检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和稳定性进行检测。应用建立的基因芯片检测方法和普通PCR/RT-PCR方法对1 006份样品进行符合检测。试验结果表明,基因芯片检测10种病毒特异性好、灵敏度高,最低检测限度可达10~(5 )copies·μL~(-1),检测中,基因芯片与普通PCR/RT-PCR对1 006份临床样品的检测符合率为96.79%以上。初步研究表明,该基因芯片技术可同时同步检测10种猪疫病病毒,可应用于临床病料的初步诊断。     

猪轮状病毒、猪札幌病毒和猪星状病毒三重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种同时检测猪轮状病毒(PRoV)、猪札幌病毒(PoSaV)和猪星状病毒(PAstV)的三重PCR方法,本研究参考PRoV的VP6基因、PoSaV的RdRp基因以及PAstV的ORF1基因序列分别设计特异性引物,通过特异性、敏感性、重复性试验优化反应条件,建立了快速鉴别PRoV、PoSaV和PAstV的三重PCR方法。试验表明,该方法能特异性扩增PRoV、PoSaV、PAstV的目的片段,对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)等常见猪病病毒的检测结果均为阴性,特异性良好;PRoV、PoSaV和PAstV的检测限量分别为1.38×10~2、8.33×10~2和4.40×10~3拷贝数/μL,具有较好的敏感性。利用三重PCR和单重PCR方法同时对80份规模化猪场的临床腹泻样品进行检测,结果表明,3种病毒的样品阳性率均为5.00%,2种方法的检测结果相一致。本研究成功建立了同时PRoV、PoSaV和PAstV的三重PCR检测方法,可用于三种病原感染的临床鉴别诊断。     

4种猪源病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立同时检测非洲猪瘟病毒(ASFV)、尼帕病毒(Ni V)、猪水疱病病毒(SVDV)以及口蹄疫病毒(FMDV)等4种猪源病毒的多重PCR检测方法,根据相关文献和Gen Bank中登录的参考病毒株序列,针对保守区域设计特异性引物,在单一PCR基础上对多重PCR条件进行优化。通过各项反应条件优化,确定ASFV、Ni V、FMDV、SVDV引物体积比为2:1:1:1,退火温度为57℃以及35个循环时,扩增效果最好。敏感性试验显示,ASFV、Ni V、FMDV和SVDV的最低检测限分别为390.0、46.0、20.9以及37.0 copies/μL。特异性试验显示,建立的多重PCR方法不与猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)发生非特异性反应。利用本研究建立的多重PCR方法对48份临床样品进行检测,得到的检测结果与单一PCR一致。结果表明,建立的多重PCR方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点。本方法的建立为ASFV、Ni V、FMDV和SVDV4种猪病的快速检测、临床诊断和流行病学调查提供了新技术手段。     

羊传染性脓疱病毒PCR检测方法的建立与应用

根据羊传染性脓疱病毒GeneBank基因序列,设计合成一对引物。通过对PCR反应条件的优化,敏感性及特异性试验,成功建立了用于检测羊传染性脓疱病毒DNA的PCR检测方法。该方法成功扩增出390 bp的目的基因片段,敏感性试验证明可以检测出320×10~(-2)ng/L的DNA。特异性试验羊痘病毒、山羊关节炎脑炎病毒均未扩增出相应片段。重复性试验对3份羊传染性脓疱病毒阳性病料进行检测,结果均为阳性。临床应用对临床送检的16份疑似羊传染性脓疱病毒感染病料用上述建立优化的PCR方法进行检测,结果显示,9份为阳性,阳性样品的PCR扩增产物克隆后进行序列分析显示均为羊传染性脓疱病毒。证明该方法具有良好的敏感性和特异性,可以用于临床诊断。     

猪伪狂犬病病毒、轮状病毒、传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒多重PCR的构建及应用

本试验的目的在于建立可同时检测猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪轮状病毒(RV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的多重PCR检测方法。试验设计并合成了4对特异性引物,对样品中的PRV,RV,TGEV和PEDV进行了多重PCR扩增。结果显示,该方法可同时扩增出PRV(497 bp),RV(1 356 bp),TGEV(238 bp)和PEDV (610 bp)的特异性目的片段,而对PPV,PCV,PRRSV和HCV的PCR扩增结果均为阴性。利用建立的多重PCR检测方法和单项PCR对60份临床病料进行检测。结果显示,两者的总符合率为95.0%。表明建立的多重PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于上述4种病毒的早期鉴别诊断及大规模的流行病学调查。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用

根据Genbank中PCV2全基因组序列设计了扩增片段大小为262bp的引物P1/P2,建立了检测猪圆环病毒2型PCR方法。引物对P1/P2从PCV2阳性病毒感染基因组中扩增出特异性条带的最低DNA含量为10-9ng/mL(约100个PCV2病毒)。用该方法对陕西和甘肃的103份临床发病猪的肺脏和淋巴结样品进行检测,结果有68份样品检测出阳性,阳性率为66%。     

绵羊痘病毒和山羊痘病毒双重PCR检测方法的建立及应用

为建立鉴别绵羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(GTPV)的检测方法,本研究针对这2种病毒的基因组序列,分别设计2对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度等的优化,建立了快速鉴别检测SPPV和GTPV的双重PCR方法。该方法分别扩增出SPPV长度为177 bp和GTPV长度为222 bp的目的片段。特异性试验结果显示,该方法对牛疙瘩皮肤病病毒、犬细小病毒、大肠杆菌O157、沙门氏菌、健康羊组织和牛组织均无扩增。敏感性试验显示,该方法最低可检测1.725×107copies/μL的SPPV和1.71×106copies/μL的GTPV。应用该方法对50份临床病料样品进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致,均检出5份感染GTPV的病料和2份感染SPPV的病料,表明该方法可以用于临床病料样品的检测。     

猪伪狂犬病毒PCR检测方法的建立及应用

根据猪伪狂犬病毒（PRV）gE基因序列保守区段,设计一对特异性引物,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬病毒野毒株与基因缺失疫苗株的PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了验证。结果显示,该PCR方法可扩增出388 bp的目的片段;对模板的最低检测量为1.1 pg;与猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪支原体、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒无交叉反应,具有高特异性。采用建立的PCR方法对2014年以来全国不同地区81个猪场421份疑似病料进行检测,发现PRV猪场平均阳性率为35.80%,样品平均阳性率为 25.42%。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于PRV的临床诊断和流行病学调查。