山羊腺苷单磷酸脱氨酶1基因启动子区单核苷酸多态性研究

为筛选腺苷单磷酸脱氨酶1(adenosine monophosphate deaminase 1,AMPD1)基因启动子区单核苷酸多态性(SNP)及研究其对启动子功能元件的影响,试验选择小香羊、黔北麻羊、努比山羊构建不同DNA池,直接测序结合BLAST筛选SNP位点。结果表明,AMPD1基因启动子区存在5个SNPs位点,分别为:T-614A、G-326A、G-309A、T-287C和T-165C。生物信息学软件预测得到AMPD1基因核心启动子区和转录因子结合位点,SNPs位点导致9个转录因子结合位点消失,而产生7个新的转录因子结合位点。AMPD1基因RNA二级结构在突变后显著改变,但未检测到CpG岛区域。     

牛α-乳清蛋白基因5'调控区多态性研究

试验选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,设计1对引物分别扩增2个牛种α-乳清蛋白(alpha-lactalbumin, LALBA)基因5'调控区及第1外显子部分序列总长1126 bp。结果表明,LALBA基因5'调控区存在5个SNPs位点:T-114C、C-166T、A-225C、C-344T、T-778C,T-114C仅在务川黑牛表现多态性。生物信息学软件预测LALBA基因核心启动子区及转录因子结合位点,SNP位点导致11个转录因子结合位点消失,其中1个位于核心启动子区,产生5个新的转录因子结合位点。突变前后RNA二级结构发生明显改变,目标序列未发现CpG岛。     

牛STAT1基因启动子区多态性研究

 为筛选STAT1基因启动子区SNP及研究其对启动子功能元件的影响。选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,直接测序筛选SNP位点。结果表明：STAT1基因5&;apos;调控区及第1外显子存在3个SNPs位点,分别为：T-537G、T-508A、C+10T。生物信息学软件预测得到STAT1基因核心启动子区和转录因子结合位点,SNP位点导致1个转录因子结合位点消失,而产生10个新的转录因子结合位点。CpG岛范围未受到突变位点影响,但STAT1基因RNA二级结构在突变后显著改变。研究结果为进一步确定STAT1启动子功能奠定试验基础。     

3个品种猪MEF2D基因启动子多态及其生物信息学分析

研究以从江香猪、杜×长×大外三元杂交猪及贵州宗地花猪为研究对象,采用混合DNA池结合直接测序技术筛选猪MEF2D基因5'UTR及第1外显子区SNPs位点;同时利用生物信息学软件分析SNPs位点对核心启动子区、Cp G岛和转录因子结合位点的影响。结果表明:在猪MEF2D基因5'UTR区共筛查到4个SNPs位点,分别为A-511G、T-453A、T-242G和T-180A;生物信息学软件预测发现T-453A和T-242G位点附近有重要转录因子结合位点消失和新位点生成,据此推测猪MEF2D基因5'UTR区的T-453A和T-242G位点对调控启动子功能元件可能存在重要影响。     

牛αs2酪蛋白、k酪蛋白基因启动子区多态性研究

为研究牛CSN1S2、CSN3基因启动子多态性.选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,设计特异性引物分别扩增2个牛种CSN1S2、CSN3基因5’调控区及第1外显子部分序列.结果表明:CSN1S2基因5’调控区存在3个SNPs位点:A-253T、A-317G、A-407G,CSN3基因5,调控区发现4个SNPs:T-79G、G-415G、T-421C、T-658G,2个牛品种在不同位点的多态性有显著差异.生物信息学软件预测CSN1S2、CSN3基因核心启动子区及转录因子结合位点,CSN1S2基因A-253T、A-317G位于预测核心启动子区.SNP位点造成CSN3基因7个转录因子结合位点消失,而产生10个新的转录因子结合位点.对于CSN1S2、CSN3基因,突变前后RNA二级结构有明显改变,目标序列均未发现CpG岛.研究结果为进一步确定其启动子功能奠定试验基础.     

贵州地方山羊BMPR-ⅠB基因启动子区多态性及生物信息学分析

为探究骨形态发生蛋白受体ⅠB(bone morphogenetic protein receptorⅠB,BMPR-ⅠB)基因启动子区多态性及其与繁殖性状的相关性,本试验以贵州3个地方山羊品种(黔北麻羊、贵州黑山羊及贵州白山羊)为研究对象,通过构建混合DNA池PCR产物直接测序技术筛选SNPs位点,并采用多种生物信息学软件预测SNPs位点对核心启动子区、CpG岛和转录因子结合位点的影响。结果显示,BMPR-ⅠB基因启动子区存在4个SNPs位点:g.29893005 TC、g.29893016 CT、g.29893729 CG和g.29894370 CT。生物信息学软件预测得到BMPR-ⅠB基因核心启动子区和CpG岛,SNPs位点导致转录因子结合位点发生改变,g.29893005 TC和g.29893016 CT突变使原来的转录因子结合位点Sp1消失;g.29893729 CG突变使原来转录因子结合位点AP-1消失,从而产生新的转录因子结合位点USF;g.29894370 CT突变产生新的转录因子结合位点C/EBPalp,使原来的转录因子结合位点Sp1改变为C/EBPalp和Sp1。由此推测,SNPs位点对调控启动子功能元件可能存在重要影响。     

兴义鸭MEF2C基因启动子区序列克隆与分析

为研究MEF2C基因启动子区SNPs对屠宰性状的影响,本实验运用直接测序法筛选兴义鸭MEF2C基因启动子区的SNP位点,并分析其与屠宰性状的相关性。结果表明:在兴义鸭MEF2C基因启动子上存在8个SNPs位点,分别为T-190A、A-232G、A-285G、A-617T、G-1420A、A-1437C、T-1504G、A-1524G;生物信息学分析发现T-190A、A-232G、G-1420A突变位点周围HOXA4、GCN4、Pit-1a、IRF-1等重要转录因子结合位点消失,继而生成Oct-1、ICSBP 2个新的转录因子结合位点;关联分析结果表明,T-190A不同基因型个体的兴义鸭活重存在显著差异,G-1420A不同基因型个体的兴义鸭腿肌率具有显著差异。由此推断,T-190A、G-1420A位点可能对调控兴义鸭MEF2C基因启动子区功能元件有重要影响,且2个多态性位点可能为影响兴义鸭屠宰性状的重要功能性SNP。本研究结果将为进一步确定MEF2C基因功能提供试验基础。     

贵州地方山羊BMPR-ⅠB基因启动子区多态性及生物信息学分析

为探究骨形态发生蛋白受体ⅠB（bone morphogenetic protein receptor ⅠB，BMPR-ⅠB）基因启动子区多态性及其与繁殖性状的相关性，本试验以贵州3个地方山羊品种（黔北麻羊、贵州黑山羊及贵州白山羊）为研究对象，通过构建混合DNA池PCR产物直接测序技术筛选SNPs位点，并采用多种生物信息学软件预测SNPs位点对核心启动子区、CpG岛和转录因子结合位点的影响。结果显示，BMPR-ⅠB基因启动子区存在4个SNPs位点：g.29893005 T > C、g.29893016 C > T、g.29893729 C > G和g.29894370 C > T。生物信息学软件预测得到BMPR-ⅠB基因核心启动子区和CpG岛，SNPs位点导致转录因子结合位点发生改变，g.29893005 T > C和g.29893016 C > T突变使原来的转录因子结合位点Sp1消失；g.29893729 C > G突变使原来转录因子结合位点AP-1消失，从而产生新的转录因子结合位点USF；g.29894370 C > T突变产生新的转录因子结合位点C/EBPalp，使原来的转录因子结合位点Sp1改变为C/EBPalp和Sp1。由此推测，SNPs位点对调控启动子功能元件可能存在重要影响。     

大白猪MYOD1、AKT3基因启动子区多态性及生物信息学分析

为探究MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性及其可能存在的影响基因表达的分子调控机制,试验采用PCR直接测序的方法对大白猪MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性进行检测,同时利用生物信息学分析方法预测了大白猪MYOD1和AKT3基因的核心启动子区、CpG岛和转录因子结合域。结果显示,MYOD1基因共预测到5个核心启动子区、1个CpG岛区域和10个转录因子结合域,且第5个核心启动子区位于CpG岛区域内;AKT3基因共预测到6个核心启动子区,未发现CpG岛的存在。通过直接测序的方法检测到MYOD1基因在G-361T处存在1个SNP突变,但在本试验群体中只发现1种基因型,同时该突变位点位于第1个核心启动子区内;AKT3基因在启动子区T-1709C处存在1个SNP突变,包括TT、TC和CC 3种基因型,其中TT基因型为优势基因型,T为优势等位基因。遗传多态性分析提示,该突变位点多态信息含量(PIC)介于0.25～0.5之间,表现为中度多态。本研究初步探究了大白猪MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性并预测了启动子区可能的调控因子和调控元件,为进一步研究MYOD1、AKT3基因对肌肉生长发育的调控机制及将突变位点作为遗传标记用于分子选育提供指导和依据。     

贵州黑山羊细胞因子诱导的SH2包含蛋白基因5′调控区SNP研究

本试验为改善贵州本地优良品种贵州黑山羊生长性能,寻找生长相关基因细胞因子诱导的SH2（Src-homology 2）包含蛋白(cytokine inducible SH2-containing protein, CISH)启动子区多态性位点,并研究其对启动子功能元件的影响。将贵州本地优良品种贵州黑山羊构建DNA池,直接测序筛选SNP位点,生物信息学软件预测核心启动子区域、转录因子、CpG岛。结果发现,CISH基因5′调控区存在1个SNP位点为G-95C,得到CISH基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近转录因子新位点产生和原来结合位点消失,但并不改变CpG岛大小。CISH基因5′调控区存在1个对启动子功能元件有较大影响的SNP位点,研究结果为进一步确定CISH基因启动子功能奠定基础。     

猪IGF-1R基因启动子区单核苷酸多态性检测分析

本试验对猪混合基因池中胰岛素样生长因子-1受体基因(IGF-1R)启动子区进行克隆并测序,筛查不同猪种间的突变位点并对其转录因子结合位点进行预测。采用AS-PCR方法,对巴马香猪、西藏小型猪、军牧1号白猪、东北野猪和大白猪5个品种猪的IGF-1R启动子区进行了单核苷酸多态性分析。结果表明该基因启动子区上存在2个SNPs位点(G-1 440C,C-1 165T),但均未引起转录因子结合位点的变化。在G-1 440C位点,5个猪种出现3种基因型,分别为GG,GC,CC,其中巴马香猪的等位基因频率G%=C%,其余4个猪种优势等位基因为G;在C-1 165T处,存在CC,CT,TT 3种基因型,西藏小型猪的优势等位基因为T,其余4个猪种优势等位基因为C。2个突变位点的基因型分布差异极显著(P<0.01)。     

鸡NLRC5基因启动子多态性分析

为了研究NLRC5基因启动子区的SNP及其对启动子功能元件的影响,采用目标捕获测序和PCR产物直接测序的方法对27个鸡品种和2种细胞的NLRC5基因启动子区进行SNP检测,总共检测到37个SNP位点,其中斗鸡未发现SNP存在,SNP9存在于除斗鸡以外的其他鸡种和细胞。生物信息学软件预测得到NLRC5基因启动子区转录因子结合位点和CpG岛,SNP位点对转录因子结合位点和CpG岛大小均有影响,表明NLRC5启动子区SNP可能通过不同方式影响基因表达调控。     

大白猪MYOD1、AKT3基因启动子区多态性及生物信息学分析

为探究MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性及其可能存在的影响基因表达的分子调控机制，试验采用PCR直接测序的方法对大白猪MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性进行检测，同时利用生物信息学分析方法预测了大白猪MYOD1和AKT3基因的核心启动子区、CpG岛和转录因子结合域。结果显示，MYOD1基因共预测到5个核心启动子区、1个CpG岛区域和10个转录因子结合域，且第5个核心启动子区位于CpG岛区域内；AKT3基因共预测到6个核心启动子区，未发现CpG岛的存在。通过直接测序的方法检测到MYOD1基因在G-361T处存在1个SNP突变，但在本试验群体中只发现1种基因型，同时该突变位点位于第1个核心启动子区内；AKT3基因在启动子区T-1709C处存在1个SNP突变，包括TT、TC和CC 3种基因型，其中TT基因型为优势基因型，T为优势等位基因。遗传多态性分析提示，该突变位点多态信息含量（PIC）介于0.25~0.5之间，表现为中度多态。本研究初步探究了大白猪MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性并预测了启动子区可能的调控因子和调控元件，为进一步研究MYOD1、AKT3基因对肌肉生长发育的调控机制及将突变位点作为遗传标记用于分子选育提供指导和依据。     

山羊DCT基因启动子区甲基化水平、SNP与毛色特征关系研究

旨在探究DCT基因启动子区甲基化水平和SNP突变对山羊毛色的影响,为探索DCT基因调控山羊毛色变化的机理提供理论依据。本研究以山羊为试验动物,对DCT基因启动子区进行CpG岛预测,设计引物对预测的2个CpG岛富集区域进行亚硫酸氢盐甲基化测序,使用甲基化水平分析软件BISMA统计甲基化位点,比较唐山奶山羊(白色)和南江黄羊(黑色品系)两种不同毛色山羊群体DCT基因启动子区甲基化水平差异。克隆DCT基因核心启动子区,筛选不同毛色山羊群体的SNPs,使用JASPAR和Nsite预测SNPs位点突变前后转录因子的改变,并检测比较突变前后DCT基因启动子活性变化。结果,成功克隆了山羊DCT基因启动子区甲基化序列及核心启动子区(g.-1045～-318)。在g.-348～-150区域和g.+222～+502区域分别发现6个和23个甲基化位点,其中g.+312、g.+352和g.+400位点与g.+389和g.+404位点白色山羊甲基化水平分别显著和极显著高于黑色山羊(P<0.05和P<0.01),并且g.+222～+502区域白色山羊甲基化平均水平极显著高于黑色山羊(P<0.01)。在DCT基因核心启动子区的g.-804T> G、g.-705C> T和g.-679G> A,3个SNPs位点的基因型构成在白色山羊和3个有色山羊群体中存在差异,g.-804T> G突变导致该区域的SOX10转录因子结合位点缺失,DCT基因启动子活性显著下降(P<0.05)。结果显示,白色山羊DCT基因g.+222～+502区域的高甲基化水平,g.-804、g.-714和g.-679 3个位点的突变,尤其是g.-804T> G造成SOX10转录因子结合位点的缺失,突变的G型DCT基因启动子活性显著降低。因此,DCT基因启动子区SNP突变和高甲基化水平可能抑制了基因的表达从而形成山羊白色被毛。     

猪肌分化因子1基因启动子区多态性及生物信息学研究

为揭示猪肌分化因子(myogenic differentiation 1,MyoD1)基因启动子区多态性,本试验分别以野猪×从江香猪二元杂交猪、杜×长×大外三元杂交猪及贵州宗地花猪为研究对象,采用DNA池和直接测序技术,筛选MyoD1基因5'UTR及部分第1外显子区SNP位点,利用生物信息学软件预测SNP位点对核心启动子区、CpG岛和转录因子结合位点的影响。结果表明,在MyoD1基因5'UTR及部分第1外显子区筛查到3个SNPs位点,分别为A-39G、T+150C和C+227G;生物信息学软件预测发现,A-39G位点附近出现重要转录因子结合位点消失和新位点生成;CpGIslandsearcher软件分析得到多态位点突变前后CpG岛大小及GC含量发生改变,据此推测猪MyoD1基因5'UTR区域的A-39G位点对调控启动子功能元件有重要影响。     

乌蒙凤鸡FGF23基因多态位点筛查与生物信息学分析

研究旨在挖掘成纤维生长因子23(fibroblast growth factors,FGF23)基因的单核苷酸多态(SNP)位点,为进一步研究该基因遗传变异奠定基础。试验以乌蒙凤鸡为研究对象,采用PCR产物直接测序法对FGF23基因进行SNP位点筛查,并进行遗传特性、连锁不平衡、单倍型、双倍型和生物信息学分析。结果显示,仅在乌蒙凤鸡FGF23基因启动子区域检测到3个中度多态的SNPs位点,分别为:g.73424341 CA、g.73424417 AG和g.73424701 TA,每个SNP位点均产生3种基因型。χ~2检验结果发现,仅g.73424417 AG突变位点的基因型分布极显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P0.01)。连锁不平衡、单倍型和双倍型分析结果显示,3个SNPs位点中仅g.73424417 AG和g.73424701 TA位点间存在强连锁不平衡,共发现4种单倍型和8种双倍型,双倍型H1H2频率最高,其次为H3H4,频率最低的为H2H2。生物信息学分析发现,FGF23基因的核心启动子区域很可能在-400～-300 bp处,本研究发现的3个SNPs位点不在核心启动子区;突变前g.73423055～g.73425055区域总转录因子数为293个,突变后为300个。g.73424341 CA位点突变前后转录因子不变,均为ICSBP;g.73424417 AG位点突变使转录因子由GR转变为C/EBPalp;g.73424701 TA位点突变前后均没有转录因子。推测SNP位点对调控启动子功能元件可能存在重要影响。     

牛Ankrd2基因启动子遗传多态性及启动效率分析

采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术,检测462头中国西门塔尔牛Ankrd2基因启动子区域的单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点,分析了SNP位点与牛肉质和胴体性状的关联性,利用生物信息学网站和软件对启动子序列进行预测分析;另一方面,采用点突变构建含有SNP位点不同基因型的双荧光素酶报告基因载体,分别瞬时转染293T细胞和牛胎儿成纤维细胞,测定荧光素酶的相对活性并进行统计学分析。结果显示:牛Ankrd2基因启动子区域(-2101～+436 bp)中存在1个SNP位点:g.-171G>T,该位点在检测的牛群体中仅存在2种基因型:GG和GT,其中G为优势基因,且该位点对牛肺和气管重影响达到显著水平(P<0.05),当G突变为T时,启动子序列减少2个ZF5转录因子结合位点,增加了1个FACB转录因子结合位点,pGL4-Ankrd2-TT启动子启动效率极显著低于野生型载体pGL4-Ankrd2-GG(P<0.01)。结果表明,在中国西门塔尔牛群体Ankrd2基因启动子区存在g.-171G>T,位点与牛胴体性状存在相关性,且该位点可能通过改变转录因子结合位点,从而影响基因的启动子转录活性。     

乌蒙凤鸡FGF23基因多态位点筛查与生物信息学分析

研究旨在挖掘成纤维生长因子23（fibroblast growth factors,FGF23）基因的单核苷酸多态（SNP）位点,为进一步研究该基因遗传变异奠定基础。试验以乌蒙凤鸡为研究对象,采用PCR产物直接测序法对FGF23基因进行SNP位点筛查,并进行遗传特性、连锁不平衡、单倍型、双倍型和生物信息学分析。结果显示,仅在乌蒙凤鸡FGF23基因启动子区域检测到3个中度多态的SNPs位点,分别为：g.73424341 C>A、g.73424417 A>G和g.73424701 T>A,每个SNP位点均产生3种基因型。χ²检验结果发现,仅g.73424417 A>G突变位点的基因型分布极显著偏离Hardy-Weinberg平衡（P<0.01）。连锁不平衡、单倍型和双倍型分析结果显示,3个SNPs位点中仅g.73424417 A>G和g.73424701 T>A位点间存在强连锁不平衡,共发现4种单倍型和8种双倍型,双倍型H1H2频率最高,其次为H3H4,频率最低的为H2H2。生物信息学分析发现,FGF23基因的核心启动子区域很可能在-400~-300 bp处,本研究发现的3个SNPs位点不在核心启动子区;突变前g.73423055~g.73425055区域总转录因子数为293个,突变后为300个。g.73424341 C>A位点突变前后转录因子不变,均为ICSBP;g.73424417 A>G位点突变使转录因子由GR转变为C/EBPalp;g.73424701 T>A位点突变前后均没有转录因子。推测SNP位点对调控启动子功能元件可能存在重要影响。     

猪SEPW1基因的转录调控分析

本研究旨在对猪SEPW1基因的潜在启动子区进行克隆及转录活性分析，获得其核心启动子区域，并进一步分析转录因子SP1对SEPW1基因转录活性的影响，为探索SEPW1基因在猪肉质性状方面的功能奠定基础。利用实时荧光定量PCR检测SEPW1基因在大白猪各组织中的表达量，构建空间表达谱；通过PCR技术克隆得到6个逐级缺失的SEPW1基因启动子片段，构建6个双荧光素酶报告载体，通过检测各载体的双荧光素酶活性获得SEPW1基因的核心启动子区域；对核心启动子区进行生物信息学分析，发现潜在的SP1转录因子结合位点；通过过表达、抑制表达、定点突变及凝胶迁移试验（EMSA）确认SP1转录因子结合位点的存在及其对SEPW1基因转录活性的影响。结果显示，SEPW1基因在所检测的4月龄大白猪12个组织中均有表达，其中在腓肠肌及心脏中的表达量较高。双荧光素酶活性显示，猪SEPW1基因5'侧翼区-443~-231 bp为其核心启动子区，且-378~-306 bp存在1个潜在的SP1结合位点。过表达和抑制表达SP1基因结果显示，转录因子SP1能够促进SEPW1基因的转录；定点突变及EMSA试验确认，转录因子SP1可直接与SEPW1基因启动子区的SP1结合位点（-348~-339 bp）相结合。综合以上结果表明，转录因子SP1可直接靶向SEPW1基因的启动子区并促进SEPW1基因的转录。     

猪SEPW1基因的转录调控分析

本研究旨在对猪SEPW1基因的潜在启动子区进行克隆及转录活性分析,获得其核心启动子区域,并进一步分析转录因子SP1对SEPW1基因转录活性的影响,为探索SEPW1基因在猪肉质性状方面的功能奠定基础。利用实时荧光定量PCR检测SEPW1基因在大白猪各组织中的表达量,构建空间表达谱;通过PCR技术克隆得到6个逐级缺失的SEPW1基因启动子片段,构建6个双荧光素酶报告载体,通过检测各载体的双荧光素酶活性获得SEPW1基因的核心启动子区域;对核心启动子区进行生物信息学分析,发现潜在的SP1转录因子结合位点;通过过表达、抑制表达、定点突变及凝胶迁移试验(EMSA)确认SP1转录因子结合位点的存在及其对SEPW1基因转录活性的影响。结果显示,SEPW1基因在所检测的4月龄大白猪12个组织中均有表达,其中在腓肠肌及心脏中的表达量较高。双荧光素酶活性显示,猪SEPW1基因5′侧翼区-443～-231 bp为其核心启动子区,且-378～-306 bp存在1个潜在的SP1结合位点。过表达和抑制表达SP1基因结果显示,转录因子SP1能够促进SEPW1基因的转录;定点突变及EMSA试验确认,转录因子SP1可直接与SEPW1基因启动子区的SP1结合位点(-348～-339 bp)相结合。综合以上结果表明,转录因子SP1可直接靶向SEPW1基因的启动子区并促进SEPW1基因的转录。