鸡囊胚细胞DMSO细管冷冻保存技术研究

旨在研究高效鸡囊胚细胞(Blastodermal cells,BCs)冷冻保存技术,为利用BCs保存禽类雌性遗传资源以及胚胎干细胞研究奠定基础。采用解冻后二乙酰荧光素(Fluorescein diacetate,FDA)染色以及培养24h后细胞贴壁率双重检测BCs活力方法,比较二甲基亚砜(DMSO)不同浓度、不同冷冻与解冻速率等对BCs的冷冻保存效果。结果表明:(1)DMSO不同浓度,20%组解冻后活力最高(0.58),与15%组差异不显著(P0.05),但与5%、10%和25%组差异极显著(P0.01);细胞复苏后贴壁率,20%组最高(30.5%),与15%组差异不显著(P0.05),与25%组差异显著(P0.05),与5%和10%组差异极显著(P0.01)。(2)冷冻速率,使用三步法冷冻,以-1℃·min-1的速率降温至-7℃,保持10min,继续降温分别至-15、-35、-55、-75℃后,投入液氮中保存,-75℃组解冻后活力最高(0.53),但与-35℃、-55℃组差异不显著(P0.05);贴壁率,各组间差异极显著(P0.01),其中-35℃组最高(36.6%)。(3)37℃水浴解冻,10s、1min、2min、3min解冻后,各组间活力差异不显著(P0.05),其中10s组最高(0.60),解冻后贴壁率,37℃水浴1min组结果最好(43.9%),与水浴2min组差异不显著(P0.05),但与水浴10s组差异显著(P0.05),与水浴3min组差异极显著(P0.01)。50℃水浴5s、20s、40s、1min解冻,5s组活力最高(0.70),与20s组差异显著(P0.05),与40s、1min组差异极显著(P0.01),解冻后贴壁率,各组间差异均极显著(P0.01),其中50℃水浴5s组最高(36.9%),50℃水浴1min组最低(5.6%)。综上表明,鸡BCs使用DMSO浓度为20%的冷冻保护剂进行细管冷冻,以-1℃·min-1的速率降温至-7℃保持10min,继续以此速率降温至-35℃后,投入液氮保存,37℃水浴1~2min解冻,BCs通过FDA染色与体外培养贴壁率双重检测均可获得较好效果。     

鸡囊胚细胞冷冻损伤的评价方法

采用滤纸环法分离鸡囊胚细胞(blastodermal cells,BCs),冷冻复苏后使用二乙酰荧光素(fluorescein diacetate,FDA)测定细胞活率,以及培养24h测定细胞贴壁率简称"贴壁率法",探究2种方法在不同冷冻程序优化试验中对细胞冷冻损伤的评价效果。结果显示,FDA染色法与贴壁率法在冷冻保护剂浓度优化、冷冻及解冻速率优化试验中对细胞冷冻损伤的评价结果差异不显著(P0.05),相关性很好,但也有一定差异;不同冷冻剂浓度优化试验中,5%DMSO冷冻保护液有细胞活率,但无贴壁现象;投入液氮温度对比试验中,-35℃以后,随着投入温度的降低,细胞活率略微升高,但贴壁率呈较明显的下降趋势。因此,2种方法均适合鸡BCs冷冻损伤评价,但贴壁率法能给出更多关于细胞状况的信息,评价结果更加真实可靠。     

不同冷冻程序对萨能奶山羊精液质量的影响

为了探究萨能奶山羊细管冻精最适冷冻程序,本试验设置5个不同的冷冻程序[在5～-10℃温区内,各组降温速率相同（6℃/min）,在-10～-140℃危险温区内设置5个不同梯度的降温速率（25℃/min,35℃/min,40℃/min,55℃/min,65℃/min）]用于程序化冷冻中。试验利用全自动细管精液程控冷冻仪编制冷冻程序,通过casa系统测定精液在不同冷冻程序下精子活力变化,同时利用特异性荧光探针（异硫氰酸镧-花生凝集素,FITC-PNA)检测解冻后精子顶体完整率,用低渗精子肿胀法（HOST)检测解冻后精子质膜完整率。结果表明,冷冻程序C组（5～-10℃,降温速率6℃/min;-10～-140℃,降温速率40℃/min）解冻后精子活力、质膜完整率和顶体完整率最高,分别达到60.75%、38.10%和71.01%,均显著高于其他组（P<0.05）。在危险温区内,降温速率为40℃/min可以较好地保证冷冻萨能奶山羊精子的活力和质膜功能,同时利用程序化冷冻程序C组可显著提高精子的受精能力,C组的降温速率可以提高冷冻萨能奶山羊解冻后精液质量。     

不同浓度防冻剂和投液氮温度对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响

比较了3种不同浓度的甘油（1.4,1.0,0.7mol/L）和投液氮温度（-25℃、-30℃和-35℃）对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响。结果发现,最终投液氮温度为-25℃时,胚胎冻后存活率以1.4mol/L甘油组为最高,同1.0mol/L甘油组相比,差异显著（78.5%vs 64.5%,P〈0.05）;与0.7mol/L甘油组相比,差异极显著（78.5%vs53.5%,P〈0.01）。以1.0mol/L的甘油冷冻,-30℃投液氮的效果优于-25℃的,它们之间冻后胚胎的孵化率差异显著（77.1%vs 64.5%,P〈0.05）。用0.7mol/L甘油冷冻,投液氮温度以-30℃的为最好,冻后胚胎的孵化率（73.3%）极显著（P〈0.01）高于-25℃的（53.5%）。用1.4mol/L甘油冷冻,以-25℃投液氮为最好,冻后胚胎的孵化率（78.5%）显著（P〈0.05）高于-35℃的（65.7%）。结果表明,不同的甘油浓度和投液氮温度对牛体外受精胚胎的冷冻效果有显著的影响。     

不同抗氧化剂对鸡胚盘细胞冷冻效果的影响

为探究不同抗氧化剂对鸡胚盘细胞(blastodermal cells,BCs)冷冻保存效果,试验在冷冻液中分别添加不同浓度的N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和番茄红素(lycopene,LP)3种抗氧化剂,用胚胎程序冷冻仪冻存BCs,解冻后测定细胞活率(简称"活率"),并于培养24h后测定细胞贴壁率(简称"贴壁率")。结果表明:在活率上,除了0.05mol/L NAC组(76.7%)与800U/mL CAT组(77.3%)极显著低于对照组外(P0.01),其余各组与对照组差异均不显著(P0.05);在贴壁率上,除了800U/mL CAT组(34.2%)极显著低于对照组(P0.01)外,其余试验组均极显著高于对照组(P0.01),其中NAC、CAT与LP的最佳浓度,分别为0.01mol/L(48.3%)、200U/mL(45.4%)与0.05g/L(39.8%)。因此,在冷冻液中添加适量的NAC、CAT或LP,可以提高BCs冷冻保存活率(差异不显著),极显著提高解冻BCs培养24h后的贴壁率。     

冷冻温度对鹿细管精液降温速率和精子复苏率的影响

试验旨在探讨冷冻温度对鹿细管精液降温速率和精子复苏率的影响.采用3×6试验设计,分为6组,每组同时冷冻3只鹿精液;利用简易冷冻装置,通过调节液氮面与冷冻面之间距离的方法控制精液冷冻温度,测定不同冷冻温度对精液降温速率和精子复苏率变化.结果显示,A组降温速率为57.6℃/min,显著高于其他各组(P<0.05);C组液氮...     

影响胚胎冷冻效果的因素分析

多数哺乳动物胚胎保存的基本方法为先将胚胎放入防冻液中平衡一段时间:装管后,以0.3～0.5℃/min的速度降至植冰温度,平衡一段时间,然后以0.3℃/min的降温速率降温至-35℃,平衡10 min后投入液氮中保存.     

冷冻速率和解冻温度对猪精液冷冻效果的影响

为优化冷冻和解冻方法,提高冷冻效果,本试验比较了不同冷冻速率(-100 ℃ 10 min、-120 ℃ 10 min、-140 ℃ 10 min)和不同解冻温度(37 ℃ 30 s、45 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s)对猪精液冷冻效果的影响。结果表明,采用-120 ℃熏蒸10 min,解冻后精子活力为0.36,质膜完整率和顶体完整率也优于其他2组,且差异显著(P<0.05)。采用37 ℃ 30 s方法解冻,精子活力、质膜完整率显著高于其他3组,顶体完整率也高于其他3组,但差异不显著(P>0.05),其畸形率最低和60 ℃ 30 s组差异明显(P<0.05),但与45 ℃ 30 s组和52 ℃ 30 s组差异不显著(P>0.05)。因此,采用-120 ℃平衡10 min冷冻,37 ℃ 30 s水浴解冻方法更为适合0.25 mL细管猪冻精解冻。     

不同冷冻保护液和解冻温度对猪精液冷冻效果的影响

在BF5稀释液中分别添加不同水平的牛血清白蛋白(BSA)(0.5,1,1.5 g/L)、二甲基乙酰胺(DMA)(0.5%,1%,1.5%)、甲基-β-环糊精载胆固醇(CLC)(1,2.5,5 g/L),对成年健康猪精液进行冷冻保存,于不同温度(37,50,70℃)解冻后分别检测冷冻后精子的活率、活力、质膜完整性、项体完整率、线粒体活性.结果显示,0.5 g/L BSA组冷冻后精子活力、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性均高于其他组,但差异不显著(P0.05).1% DMA组冷冻后精子活率和活力显著优于1.5%DMA组(P＜0.05),同时也高于对照组(3%甘油)冻后精子活率和活力,但差异不显著.不同质量浓度CLC组冷冻后精子的活率、活力、质膜完整性和线粒体活性与对照组相比差异不显著.50℃和70℃解冻组精子的活率和线粒体活性显著高于37℃解冻组的精子;50℃解冻组精子的活力和质膜完整率显著高于其他2组.因此,在猪精液冷冻稀释液中,用DMA可以代替甘油作为渗透性保护剂,且以1%DMA,50℃解冻最佳.     

冷冻温度对牛精子复苏率及降温速率变化规律的研究

[目的]为了探讨温度变化对牛精子复苏率的影响,找到降温度变化规律。[方法]利用电脑程控冷冻仪、自动数字测温仪,测定精液在不同温度冷冻精子复苏率变化。[结果]表明,精液在-98℃冷冻精子复苏率最高;在-86- -118℃冷冻精子复苏率较高,精液相变适宜降温速率为35℃/min。[结论]控制精液发生相变阶段的降温速率是冻精制作成败的关键。     

F1代和ICR小鼠体外、体内受精后8-细胞胚胎玻璃化冷冻的比较

探讨了F1代(♀ICR×♂BALB/C6J)和ICR小鼠体外受精及体内受精两种不同来源获得的8-细胞胚胎玻璃化冷冻效果。不同来源的小鼠胚胎在预热到37℃1MDMSO溶液中处理后,转移到冷冻管中5min然后加入DAP213,并在0℃平衡5min后冷冻。体外受精及体内受精两种方法获得的F1代小鼠8-细胞胚胎解冻后的存活率分别为92.5%和93.33%;ICR代小鼠8-细胞胚胎解冻后的存活率分别为65.83%和67.50%。同一品系体外受精与体内受精来源的8-细胞胚胎冷冻复苏后胚胎存活率差异不显著(P>0.05),但不同品系体外受精及体内受精来源的8-细胞胚胎复苏率差异均显著(P<0.05),表明8-细胞胚胎冷冻复苏率的高低与胚胎获得的方法无关,但与品系的不同有关。     

绵羊精液平衡过程中降温速率对精子品质的影响

本试验研究了河南大尾寒羊精液冷冻颗粒制作过程中,100、150、200和250 mL 4种不同体积水浴平衡降温速率对冻精精子品质的影响。结果表明：①4种水浴平衡处理的降温时间在2.2～3.9 h,以100 mL水浴降温速率最大,250 mL水浴降温速率最小,200和250 mL水浴处理降温速率较为接近。②精液冷冻水浴平衡降温速率前30 min,降温速率应控制在0.73～0.74 ℃/min之间;30～90 min降温速率应控制在0.11～0.12 ℃/min之间。③水浴平衡时的降温时间3 h较为适宜,250 mL水浴平衡降温的处理对精子造成的冷打击最小,制作的冻精解冻后的精子品质最高。④精子活率：250 和200 mL处理间差异不显著(P＞0.05);250、200 mL处理与150、100 mL处理间差异显著(P＜0.05)。⑤畸形率：250 mL水浴平衡条件下最低,100 mL水浴平衡条件下最高。250与200 mL处理间精子畸形率差异不显著(P＞0.05);250与150、100 mL处理间精子畸形率差异显著(P＜0.05)。⑥顶体完整率：250和200 mL较高,两处理间差异不显著(P＞0.05);250和200 mL处理与150及100 mL处理间精子顶体完整率差异显著(P＜0.05)。     

几种冷冻条件对牛体外受精卵发育率的影响

试验比较了乙二醇 (EG)、丙二醇 (PG)、二甲基亚砜 (DMSO)、甘油 (G)和不同的投液氮温度 (- 33℃或 - 4 0℃ )对牛体外受精卵冷冻后发育率的影响。结果 :投液氮温度无论是 - 33℃或 - 4 0℃ ,均以 1.5 mol/ L EG的冷冻效果为最好 ,与 1.5 mol/ L PG相比 ,受精卵的发育率差异显著 (39.7% vs19.2 % ;4 7.8% vs2 4 .7% ,P <0 .0 5 ) ;同 1.5mol/ L DMSO和 1.5 mol/ L G相比 ,受精卵的发育率差异极显著 (39.7% vs 16 .1% or 13.3% ;4 7.8% vs 19.2 % or17.3% ,P <0 .0 1)。 - 4 0℃投液氮 ,受精卵冷冻后的发育率略高于 - 33℃ ,但差异不显著 (P >0 .0 5 )。以 2 5 % EG 2 5 % PG作为细胞外玻璃化溶液对牛体外受精卵进行冷冻 ,冷冻后受精卵的发育率达 5 8.9% ,高于用 1.5 mol/ L EG冷冻在 - 4 0℃投液氮这一处理 (47.8% ) ,但无统计学上差异 (P >0 .0 5 )。然而 ,试验组冷冻后受精卵的发育率均极显著低于对照组 (80 .6 8% ,P <0 .0 1)。结果表明 ,投液氮温度以 - 4 0℃为较好 ,防冻剂以 EG的冷冻效果为最佳。玻璃化冷冻法完全可以应用于冷冻牛体外受精卵     

河南省荷斯坦牛冷冻胚胎移植效果分析

本研究对河南省鼎元种牛育种有限公司2012~2013年荷斯坦牛冷冻胚胎移植效果进行了统计分析。结果表明,不同牧场对冷冻胚胎移植妊娠率影响显著(P0.05),牧场E单个活犊需胚胎数最低(1.8枚/头),在1~6月份和11~12月份中,月份对冷冻胚胎移植效果影响不显著(P0.05)。1~2月份进行胚胎移植时妊娠率最高(61.5%),单个活犊需胚胎数最低(2.0枚/头),3~4月份胚胎移植效果最差。移植部位对冷冻胚胎移植效果影响不显著(P0.05),但右侧移植效果略高于左侧。对13~23月龄受体牛进行移植,受体牛年龄对冷冻胚胎移植妊娠率、流产率和单个活犊需胚胎数影响差异不显著(P0.05),但13~18月龄受体牛的胚胎移植流产率高于19~23月龄。     

山羊胚胎简易冷冻试验

用RPE冷冻器冷冻20枚山羊桑椹胚和囊胚。冷冻液为1M甘油杜氏磷酸盐缓冲液(PBS)。胚胎装于0.25ml塑料细管内,0℃时置入冷冻器。以1℃/分降温,-6.5～-7℃诱发结晶,再以0.5℃/分(0.3～0.8℃/分)降温至-30℃,然后投入液氮保存5～12天。35℃水浴解冻。20枚胚胎冻后形态正常率为65％(13/20)。将13枝形态基本正常的胚胎移植给5只受体羊,结果4只受体羊妊娠,产羔7只,冻胚存活率为35％(7/20)。除1只冻胚羔产下后90分钟死亡外,另6只冻胚羔生长发育正常。     

白藜芦醇对山羊冷冻精子质膜、DNA完整性和温度耐受性的影响

试验旨在研究白藜芦醇对山羊冷冻精子质膜、DNA完整性和温度耐受性的影响。采用假阴道法采集8只云上黑山羊精液,用含不同浓度(0、0.1、1、10和20μmol//L)白藜芦醇的Optidyl稀释液稀释后进行细管分装,对照组不添加白藜芦醇。在5℃平衡4 h后,将细管于液氮蒸气中预冻10 min,最后在液氮中保存30 d。37℃水浴解冻后,采用低渗耐受性试验检测质膜完整性和温度耐受性,精子染色质扩散法检测DNA碎片率等指标。结果显示,10μmol/L白藜芦醇冷冻组精子弯尾率显著高于其他各处理组(P0.05),而其他各冷冻组之间无显著性差异(P0.05);10μmol/L白藜芦醇冷冻组精子DNA碎片率极显著高于鲜精组(P0.01),极显著低于未添加白藜芦醇冷冻组(P0.01)。温度耐受性试验结果表明,不同浓度白藜芦醇冷冻组精子37℃水浴1 h后的精子弯尾率以10μmol/L冷冻组最高,与其他各冷冻组间差异极显著(P0.01);精子弯尾率随着孵育时间的延长而呈逐步下降的趋势,当孵育4 h时,10μmol/L白藜芦醇冷冻组精子弯尾率与对照组无显著差异(P0.05)。透射电镜结果表明,10μmol/L白藜芦醇组精子质膜完整率显著高于不添加白藜芦醇对照组(P0.05)。上述结果表明,在冷冻稀释液中添加白藜芦醇可显著改善山羊冻精质膜状态、DNA完整率和温度耐受性,其最佳作用浓度为10μmol/L,但白藜芦醇是否能改善山羊冻精的人工授精效果还有待进一步研究。     

不同冷冻保护剂和投入液氮时温度对冷冻兔胚胎存活的影响

将384个 8～16细胞期的兔胚胎分成四个不同的试验组。用PBS+50％兔血清作为保存液,1.5M的DMSO或甘油作冷冻保护剂,以1℃/分的速度从13～17℃降到-40或-78℃投入液氮。用DMSO和甘油作冷冻保护剂,-40℃投入液氮的两组胚胎解冻后,经体外培养发育成胚泡的比率(分别为35.7％和32.8％)较-78℃投入液氮的两组(分别为22.9％和7.0％)为高。将-40℃投入液氮的两组胚胎解冻后,分别移植给5只受体母兔,受体妊娠率在DMSO组为80.0％,甘油组为60.0％;妊娠20天胎儿存活率分别为>44.9％和>34.0％;仔兔出生率分别为2.04％和22.6％。     

猪冷冻（—20℃）胚胎在我国移植成功

实验Ⅰ将129枚猪胚胎,用于冷冻-解冻-体外培养研究。以含有1.5M甘油的PBS液为冷冻液,以1℃/分的速率从35℃降至-7℃,在-7℃自动诱发给冰,然后以0.3℃/分的速率降至-35℃,再以0.1℃/分的速率降至-36℃,立即投入液氮(-196℃);胚胎解冻在37℃水浴中进行、分步脱出甘油后以改进的mBMOC-Ⅱ为培养液进行体外培养。结果,囊胚、扩张囊胚、刚孵出囊胚和孵化出后期囊胚、解冻后体外培养存活率分别为0％(0 /2)、64％(16/25)、0％(0/9)。在液氮中(-196℃)保存80～103天,扩张囊胚、刚孵出囊胚和孵出后期囊胚解冻后,体外培养存活率分别为41.6％(5/12)、63.7％(7/11)和0％(0/70)。结果表明,在液氮温度(-196℃)保存下,刚孵出囊胚有较高的耐冻性和存活能力。实验Ⅱ进行猪冷冻胚胎解冻后体内发育能力研究。96枚扩张囊胚和刚孵出囊胚,分批冷冻和保存在-20℃、-35℃和-196℃。解冻后移植3头受体,其中2头返情,1头妊娠并于1990年7月31日产仔2头,公母各1头,初生重均为1.35kg,妊娠期为116夭。该结果为我国首例猪冷冻(-20℃)胚胎移植成功,并为今后开展猪胚胎超低温(-196℃)冷冻保存技术研究奠定了基础。     

影响胚胎冷冻效果因素分析

大多数哺乳动物胚胎保存的基本方法为：先将胚胎放人防冻液中平衡一段时间：装管后,以1 min0．3～0．5℃的速度降至植冰温度,平衡一段时间,植冰后再平衡一段时间,然后以1 min 0．3℃的降温速率降温至-35℃,平衡10min后投入液氮中保存。     

液氮蒸汽熏蒸时间对犬精子冷冻效果的影响

本试验研究了0.5 m L细管冷冻保存犬精液过程中液氮熏蒸时间对精子冷冻效果的影响。试验分为5组,将精液细管置于液氮液面上方2 cm处,分别熏蒸0 min(直接投入液氮)、1 min、2 min、4 min、8 min。解冻后通过活率、活力、畸形率及顶体完整率对精子进行评估。结果:液氮蒸汽熏蒸0 min和1 min组精子活率和活力显著低于其它各组(P0.05)。与直接投入液氮相比,在液氮蒸汽中预冷冻超过2 min能够提高精子顶体完整率(P0.05)。本试验表明在使用0.5 m L细管冷冻犬精子时,液氮熏蒸时间在4~8 min较为适宜。