抗猪瘟病毒单克隆抗体的研究——猪瘟病毒抗原的提纯

本文介绍了用 PEG 和蔗糖密度梯度区带离心纯化猪瘟病毒的方法和步骤。先用 PEG 沉淀浓缩猪瘟兔化弱毒感染的牛睾丸细胞培养液,再经蔗糖密度梯度区带离心,出现4条区带,其中病毒感染力最强的位于Ⅱ带,其次为Ⅰ带,蛋白质含量多为0.14～0.19毫克/毫升和0.21～0.12毫克/毫升。电镜检查可见带有膜囊的病毒粒子,SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳显示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ带均各出现一条明显蓝色条带外,在它前后侧还隐约可见一条浅带。用这些方法浓缩提纯兔化猪瘟弱毒效果较好,且较简便易行。     

甘蔗花叶病毒的提纯及抗血清制备

以ＳｃＭＶ－Ａ为材料,采用ＰＥＧ沉淀结合差速离心技术,经１０－４０％蔗糖密度梯度离心后再经浓缩后即为提纯病毒制剂。该提纯病毒具有典型的核蛋白吸收曲线,最大紫外吸收值在２５７ｎｍ处,最小紫外吸收值为２４０ｎｍ,Ａ２６０／２８０＝１．６８,病毒产量可达１．２５－１．３７ｍｇ／ｋｇ。将提纯病毒免疫家兔制备抗血清,所制备的抗血清经Ａ蛋白酶联免疫吸附法测定,其效价为１／１０２４,且可用于检测甘蔗花叶病毒。     

鸡传染性法氏囊病毒的分离、纯化与抗血清的制备

采用鸡胚尿囊液培养传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）。将培养病毒的鸡胚尿囊液经高速离心，聚乙二醇（ＰＥＧ）沉淀、蔗糖垫底超速离心、ＮａＢｒ密度梯度离心，可获得纯化的鸡传染性法氏囊病毒带。通过透射电子显微镜观察，表明ＩＢＤＶ颗粒呈六角形，直径约６０ｎｍ，无囊膜，其浮力密度为１．３０～１．３６ｇ／ｍｌ。实验所分离的病毒粒子的平均含量为１．７２ｍｇ／ｍｌ。用这种病毒免疫健康家兔制备抗ＩＢＤＶ的血清，获得了效价在１∶３２以上的抗血清，抗血清有较高的纯度和专一性     

鹅细小病毒LH株的纯化及其生物学特性

取鹅细小病毒(GPV) LH株毒液,通过氯仿去除杂蛋白,用氯化钠与聚乙二醇-6000相结合方法粗提后,经蔗糖密度梯度离心纯化.通过PCR方法对不同浓度蔗糖溶液进行检测,取纯化毒液进行蛋白电泳及电镜观察,并无菌接种12日龄鹅胚,对死亡胚尿囊液进行PCR鉴定.试验结果显示:浓缩纯化后的GPV主要分布在50％～65％蔗糖浓度区间,病毒的蛋白含量为216 μg/L;电镜观察结果表明,病毒粒子分为实心和空心2种,直径大小在20～22nm;经SDS-PAGE电泳可看到多个条带,主要蛋白大小与病毒蛋白VP1、VP2和VP3相对应.纯化后的病毒接种敏感鹅胚仍可致其100％死亡,死亡胚具有特征性的病变,尿囊液经PCR鉴定,呈GPV核酸阳性.本试验所用方法获得的纯化GPV病毒液的纯度高且保持了该病毒的毒力特性,是一种方便可行的纯化该病毒的方法.     

一种改进的对虾白斑综合征病毒提纯方法

对虾白斑综合征病毒(WSSV)的囊膜蛋白在提纯的过程中易脱落,用传统的密度梯度离心方法不易获得完整的病毒粒子,对传统的蔗糖密度梯度离心方法加以改进后,可以获得大量完整的病毒粒子.用患白斑综合征病毒病的中国对虾鳃制备WSSV粗提液,感染螯虾(Cambarus proclarkii),选取25%的蔗糖溶液用作病虾鳃的匀浆液,然后经蔗糖密度梯度离心,分取各带负染后电镜观察,大量完整的病毒位于46% ～52% 蔗糖梯度之间,病毒粒子末端带有很长的尾;而病毒裸露的核衣壳位于40%～46%蔗糖梯度之间;在57%～62%之间观察到较多完整病毒粒子和少量细菌.实验结果表明改进的病毒提纯方法较好,可得到大量完整的带嚢膜的病毒颗粒.     

苹果褪绿叶斑病毒的抗血清制备及其检测应用研究

用昆诺藜(Chenopodium quinoa)为诊断和分离寄主,从混合感染潜隐病毒的苹果花瓣中分离纯化出苹果褪绿叶斑病毒。经纯化的病毒,在繁殖寄主—昆诺藜上增殖扩大。采用聚乙二醇沉淀和差速离心技术,从感染病毒的昆诺藜中提纯出褪绿叶斑病毒作为抗原,免疫家兔,经心脏采血,制备出了该病毒的抗血清。用制备的抗血清进行了检测褪绿叶斑病毒的方法和对脱毒苗以及生产苹果树的带毒情况作了初步研究。A蛋白酶联免疫法适于检测苹果褪绿叶斑病毒。     

用蔗糖密度梯度离心法提纯禽脑脊髓炎病毒

用蔗糖密度梯度离心法进行了禽脑脊髓炎病毒的纯化。将禽脑脊髓炎病毒（ＡＥＶ）Ｌ２Ｚ株、Ｖan Ｒoekel株和１１４３株分别经卵黄囊接种６日龄ＳＰＦ鸡胚,接毒后,以４５００r/min离心及胰腺,用玻璃匀浆器制成１０％的组织悬液。组织悬液经３次反复冻融后,以４５００r/min离心１５min,取上清液。而后用氯仿处理,取水相,经冷冻真空浓缩,进行不连续蔗糖密度梯度离心。取出含ＡＥＶ的组分,用ＰＢＳ稀后超速离心除去蔗糖,得到     

香石竹斑驳病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

 香石竹斑驳病毒（Carnation mottle virus,CarMV）是侵染香石竹的主要病毒。本研究从已鉴定的CarMV毒源植物中提取总RNA, 克隆外壳蛋白（cp）基因后构建pET30a CP重组质粒,并转入BL21（DE3）pLysS进行原核表达。通过对诱导温度、初菌浓度、IPTG的浓度等表达条件进行优化,目的蛋白在37℃, IPTG 终浓度为10mmol/L的条件下,诱导表达6h后获得最高表达量。采用割胶的方法纯化cp蛋白,纯化后的目的蛋白免疫小鼠获得了特异性抗血清。经Western blot检测,结果表明所制备的抗血清与诱导表达的重组蛋白及接种CarMV的香石竹样品均发生特异性结合。利用所制备抗血清对昆明地区的48个香石竹样品进行抽检,结果表明香石竹样品的带毒率为79.2%。本研究为大规模抗血清生产、检测应用和深入研究该病毒cp基因与寄主的互作奠定基础。     

3种麦类土传花叶病毒的多抗制备及检测应用

采用PEG二次沉淀和蔗糖硫酸铯密度梯度离心,得到提纯的3种麦类土传花叶病毒(小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒)。透射电镜观察分别可见线状、直杆状病毒粒子,测定浓度分别达5.44、8.08、4.09 mg/m L。提纯病毒免疫新西兰大白兔制备抗血清,得到的3株抗血清经酶联免疫吸附法测定效价分别达1∶12 800、1∶25 600、1∶6 400。应用样品和多抗稀释的方阵试验,建立3种多抗的双抗夹心酶联免疫吸附法(TAS-ELISA),并对采自江苏省、安徽省、河南省、山东省的麦子病样进行检测,结果显示,阳性检出率较高,说明这3种病毒仍是我国麦子流行的主要病毒。     

羊催乳素的纯化、理化鉴定及抗血清的制备

本试验对绵羊垂体前叶催乳素进行了提纯和生物学、生物化学及免疫学方面的鉴定.516g 羊全垂体经硫酸铵、乙醇等的逐级提取,最后经 DEAE-纤维素柱层析得到催乳素纯品450mg.用鸽嗉囊局部皮内微量注射法测得其生物学活性为27国际单位(27IU/mg)。PAG 电泳表明有三条带。SDS 电泳测得其分子量为23000。IEFP 电泳表明平均等电点为5.85。用 Dansyl-Cl 法测定其 N-末端氨基酸,只显出苏氨酸一点。表明提纯的催乳素是高纯的。用该催乳素免疫家兔,九周后用琼脂双扩散法测抗血清,其效价最高达1:32,说明该纯化品具有很强的免疫原件.     

大白菜芜菁花叶病毒简化提纯程序的研究

大白菜芜菁花叶病毒(TuMV)沈阳分离物,是本研究组分离和纯化的毒原。在无虫温室中以人工接种于大白菜(小白口)叶片,适期收获,称重,冰冻过夜。次日加适量0.02M磷酸缓冲液,pH7.2匀浆。并进行差速离心;低速离心3000rpm,30分钟去寄主细胞器,取上清液搅拌加4％聚乙二醇(PEG—MW6000)及3％NaCl(W/V),搅拌沉淀病毒粒体,进行一系列低速及超速离心。超速离心后的沉淀物用0.01M磷酸缓冲盐液(含0.015M尿素)悬浮,得到纯化的TuMV制品。经电子显微镜检查,提纯物中含有大量单个非集聚的TuMV粒体。粒体平均长度为720nm,结构保持良好,粒体断裂现象很少。提纯物经指示植物接种测定,具侵染性。这一简化提纯法可以免去蔗糖密度梯度离心等过程,取得较为相似的效果。     

侵染马铃薯的烟草坏死病毒的鉴定、提纯及抗血清制备

自马铃著植株上分离得到了烟草坏死病毒(TNV)。在测试的13科53种植物中,能侵染8科34种,但人工接种仅在接种叶上引起局部侵染,未发现其系统侵染寄主。该病毒的钝化温度为78～80℃,稀释限点10~(-5)～10~(-6),体外保毒期27～28天。提纯病毒经紫外吸收测定,最高吸收峰为260 nm,最低吸收峰为245 nm,提纯得毒率为7.8 mg/kg接种叶。病毒粒体球状,直径约28 nm。经免疫琼脂双扩散测定,该病毒与TNV标准抗血清产生明显的反应沉淀线。人工接种该病毒不能侵染马铃薯植株的地上部分。块茎病斑为ABC病的C型症状。感病植株所结块茎仅部分带毒。受侵染块茎下一年可产生病苗。     

大豆花叶病毒抗血清制备和应用方法研究

用差速离心法提纯6个大豆花叶病毒株,提纯液用紫外分光光度计扫描,以260mm的OD值计算病毒汁液浓度.影响提纯病毒浓度的因素有:(1)不同毒株同一提纯方法得率差异很大;(2)采病叶的时间:症状最明显时采叶提纯得率最高;(3)PEG处理时间以3.5小时较好. 将提纯病毒免疫兔子(以6号兔为例),共注射8.34mg,心脏采血,取得抗血清,通过微量凝聚、微量沉淀反应及琼脂扩散试验,在方法上进行了研究.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒抗血清制备及应用

用葫芦[Lagenaria siceraria（Molina）Stand．]作为黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）的繁殖寄主,通过差速离心和PEG二次沉淀法进行病毒提纯,用提纯病毒液免疫新西兰兔制备CGMMV抗血清。制备的CGMMV抗血清经间接ELISA法测定效价为1：5120;利用制备的抗血清检测田间样品,证明其可以用于CGMMV的血清学及免疫捕获RT—PCR检测。研究结果对今后开展葫芦科作物CGMMV检测,及时发现疫情以便采取防控措施,避免病毒扩散为害,确保葫芦科作物的安全生产具有重要意义。     

兔瘟病毒结构蛋白的研究

本文用氯仿处理,PEG沉淀;超离,Sepharose 4B柱层析及蔗糖密度梯度离心等方法纯化了兔瘟病毒(RPeV)。电镜下观察到RPeV为无囊膜,大小为32～34nm。纯化了的RPeV通过SDS-聚丙烯酰胺连续梯度凝胶电泳进行多肽分析。发现RPeV多肽只有1条63～64kd主要结构蛋白组成。用SPF兔肝粉吸收后的抗RPeV抗体作免疫转印。证明这条多肽是RPeV所特有的。     

应用等密度梯度离心法提纯传染性支气管炎病毒

采用分段取样,测ＯＤ２６０,及电镜观察等方法,对用等密度梯度离心法提纯的传染性支气管炎病毒粒子在蔗糖溶液中的病毒富集带和纤突丢失程度进行了分析和总结,提出度离心后３０－５０％区带蔗糖溶液２为较理想的取样位置。     

侵染马铃薯的一个Tospovirus混合分离物的鉴定、纯化及多抗血清制备

在昆明地区栽培的马铃薯病株上分离鉴定出含有番茄斑萎病毒属(Tospovirus)番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)和花生环斑病毒(Groundnut ringspot virus,GRSV).利用蔗糖垫及差速离心法提纯了该混合分离物,提纯病毒免疫家兔5次,得到 TSWV和GRSV的混合抗血清,所制备的抗血清经间接ELISA测定效价为12560.     

分泌抗小麦土传花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用经差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化的小麦土传花叶病毒腹腔免疫Balb/c小鼠,共免疫3次,每次免疫的病毒量为100ug,最后一次免疫3天后,取脾制备脾细胞悬浮液,按5∶1的比例与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0混合,用50%PEG融合,融合后的细胞加HAT培养液     

鸭瘟病毒提纯方法比较

将鸭瘟病毒CHv株经鸭胚和鸭胚成纤维细胞(DEF)进行培养增殖后,收集病毒液,分别采用沉淀法、层析法、差速离心法和蔗糖不连续密度梯度离心法进行了鸭瘟病毒的提纯研究,结果表明,DEF增殖与蔗糖不连续密度梯度超速离心法是鸭瘟病毒较好的增殖和提纯方法,病毒粒子主要存在于400～500g·L-1蔗糖层上;经20g·L-1磷钨酸负染后电镜观察发现,提纯病毒具典型疱疹病毒特征,大小较一致,为170～190nm,由核芯、衣壳和囊膜3部分组成结构较完整的病毒粒子;采用Bradford法测定,纯化病毒液中病毒含量为0.71mg·mL-1.     

中华鳖虹彩病毒的纯化及分析

为制备高纯度的中华鳖虹彩病毒,分析其免疫相关抗原,采用3种方法纯化中华鳖虹彩病毒粒子并对其结构蛋白进行了初步分析.结果表明:差速离心法回收的样品中病毒纯度差、密度低,在电镜下不易观察到病毒粒子;病毒培养物经冻融、磁力搅拌、超声处理后,进行差速离心可提高病毒的回收率,但超声处理易造成病毒结构破坏;病毒培养物经离心浓缩、匀浆、磁力搅拌处理,再通过差速和蔗糖密度梯度二步离心纯化后,在蔗糖密度为30%～40%、40%～50%和50%～60%之间分层的样品中均可观察到病毒粒子,其中,蔗糖密度为50%～60%之间回收的病毒粒子纯度最高,且结构完好.SDSPAGE分析表明,纯化病毒至少含20条蛋白条带,分子量为50kDa的核衣壳蛋白是中华鳖虹彩病毒的高丰度蛋白.Western-blot分析结果证实大多数蛋白条带能被鼠抗中华鳖虹彩病毒高免血清特异性地识别.