雪花莲凝集素基因(GNA)植物表达载体的构建及其对烟草的遗传转化

将雪花莲凝集素基因(GNA)取代GUS基因正向插入到Ti质粒载体pBI121的35S启动子之下,构建成植物表达载体pBI121/GNA,并将其导入农杆菌LBA4404中.通过该农杆菌介导转化烟草红花大金元,得到卡那霉素抗性植株159株,PCR检测表明其中102株为阳性.对8株PCR阳性植株进行了抗蚜虫生物活性检测,抑制蚜虫密度为25%～90%.     

雪莲PEBP基因原核表达载体的构建及表达

根据雪莲PEBP基因序列设计特异性引物,利用实验室构建的Teasy-PEBP质粒为模板,扩增PEBP基因,与表达载体pET-30a(+)连接转化BL21(DE3), PCR和酶切鉴定筛选阳性克隆,测序分析.经IPTG诱导后SDS-PAGE检测,结果表明:PEBP得到大量表达,表达量占菌体总蛋白的26.8;,融合蛋白的相对分子量大约是28KD,与理论值相符,为进一步研究该蛋白的理化性质奠定了基础.     

水稻OsWRKY17基因定位表达载体的构建(英文)

[目的]研究水稻OsWRKY17基因的生理生化特性,确定OsWRKY17蛋白在植物中的定位。[方法]根据GenBank数据库中OsWRKY17全序列设计引物,进行OsWRKY17的RT-PCR扩增,克隆了OsWRKY17基因,将该片段与带绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒载体pBinGFP重组,将构建正确的表达载体pBinGFP-OsWRKY17通过农杆菌介导的花蕾浸泡法转化到拟南芥中。[结果]经菌落PCR与酶切鉴定表明成功构建了Os-WRKY17基因与GFP融合的植物表达载体pBin-GFP/OsWRKY17,并成功将OsWRKY17基因整合到拟南芥的基因组中,获得了抗性植株。[结论]OsWRKY17基因表达载体的构建为研究该基因的生理生化特性奠定了基础。     

大蒜叶凝集素基因ASAL的克隆与表达载体的构建

大蒜叶凝集素基因(Allium sativum leaf agglutinin,ASAL)是一种高活性的凝集素基因,且具显著的抗虫性。克隆大蒜ASAL基因将为其在转基因作物中抗虫特性研究奠定基础。本文以GenBank公布的ASAL基因序列设计特异引物,采用RT-PCR法从当地大蒜品种二水早和新都软叶的幼苗中克隆ASAL基因。结果表明,克隆的两个ASAL基因与已知基因的碱基序列相似性分别为98.7%和98.9%,氨基酸序列相似性为98.3%。将其亚克隆至表达载体中,经菌落PCR和酶切鉴定,成功构建了重组质粒。将该载体导入农杆菌EHA5a进行保存。     

水稻线粒体基因atp6超表达载体的构建及遗传转化(英文)

[目的]克隆水稻线粒体基因atp6,构建转基因表达载体,获得35S∷Rf1b5′∷atp6转基因水稻植株。[方法]设计目的基因的特异引物,采用TRIzol法提取水稻叶片总RNA,借助Toyobo反转录试剂盒反转录为cDNA,通过PCR扩增得到atp6全序列;将atp6连接到含线粒体信号肽(Rf1b5′)的pCAMBIA1302双元表达载体上,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行水稻的遗传转化[结果]利用目的基因atp6成功构建了35S∷Rf1b5′∷atp6植物表达载体,并获得了转atp6基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中超表达atp6对水稻生长的影响奠定基础。     

转雪花莲凝集素(GNA)基因抗蚜大豆后代材料的田间试验

本试验对稳定的转基因大豆品系在控制条件下进行了2年的大田试验。试验结果表明,转基因品系的农艺性状与受体对照无明显差异,抗蚜性明显优于受体对照。     

水稻OsAPX基因的克隆及过表达载体的构建

通过RT-PCR法从粳稻日本晴中克隆到ascorbate peroxidase(APX)基因,该基因的cDNA长为768bp,包含完整的CDS序列。将克隆到的片段连接到植物表达载体pBI121的相应位置,构建1个APX基因的过表达载体pBI121-APX。利用农杆菌EHA105介导该植物表达载体在籼稻"多系1号"和"航1号"中的遗传转化,以期成功获得转基因植株,为后期研究APX基因在水稻耐储藏方面所发挥的功能打下基础。     

水稻OsRbohB基因原位杂交载体的构建 及其在花药中的表达分析

为研究水稻呼吸爆发氧化酶基因OsRbohB在花药中特定的表达模式,构建了原位杂交探针载体Pbsk-OsRbohB,通过体外转录获得DIG标记的原位杂交探针,以不同发育时期的水稻花药为材料进行原位杂交试验.结果发现,OsRbohB基因主要在水稻花药发育第8～10期的绒毡层和小孢子中表达,在第9期达到高峰,第10期开始下降.推测OsRbohB主要参与水稻花药早期的发育,该研究为进一步研究OsRbohB基因在水稻活性氧产生中的作用提供参考.     

水稻osvdac基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

[目的]构建水稻osvdac3和osvdac5基因RNA干涉表达载体,获得转干涉载体的转基因水稻植株。[方法]采用TRIzol法提取水稻幼苗总RNA,以反转录的cDNA为模板,扩增得到osvdac3和osvdac5的分别靠近5’端和3’端约500～600bp的特异序列,用Gateway重组克隆技术构建RNA干涉表达载体,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行遗传转化。[结果]成功构建水稻2个osvdac3和2个os-vdac5基因RNA干涉表达载体,并获得转osvdac3干涉载体的阳性植株。[结论]干涉osvdac3和osvdac5的植株为研究其功能提供材料。     

水稻OsWRKY17基因定位表达载体的构建

[目的]研究水稻OsWRKY17基因的生理生化特性,确定OsWRKY17蛋白在植物中的定位。[方法]根据GenBank数据库中Os-WRKY17全序列设计引物,进行OsWRKY17的RT-PCR扩增,克隆了该基因,将该片段与带绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒载体pBinG-FP重组,将构建正确的表达载体pBinGFP-OsWRKY17通过农杆菌介导的花蕾浸泡法转化到拟南芥中。[结果]经菌落PCR与酶切鉴定表明成功构建了OsWRKY17基因与GFP融合的植物表达载体pBinGFP-OsWRKY17,并成功将OsWRKY17基因整合到拟南芥的基因组中,获得了抗性植株。[结论]OsWRKY17基因表达载体的构建为研究该基因的生理生化特性奠定了基础。     

半夏凝集素基因在水稻中的转化及筛选

为了获得转基因抗虫水稻,将半夏凝集素基因pta导入水稻,并进行鉴定和筛选。在抗虫基因pta的5'端加2×35S启动子,两端分别添加HindⅢ和Spe I酶切位点,并进行人工合成。将pta与植物表达载体p1301连接,经双酶切和测序鉴定。结果表明:重组表达载体p1301-pta构建成功;载体p1301-pta转化农杆菌LBA4404后用浸染法将pta基因导入水稻恢复系辐恢838中,对转化再生植株进行GUS染色以及GUS和pta基因的PCR鉴定后,共得到16株转基因阳性植株。     

水稻肌醇加氧酶基因的表达分析及植物表达载体的构建

为研究水稻肌醇加氧酶基因在植物水分胁迫分子应答中的作用,采用RT-PCR技术克隆了水稻肌醇加氧酶基因的cDNA编码区,命名为OsMIOX。该基因由927个碱基组成,编码308个氨基酸,与拟南芥肌醇加氧酶的氨基酸序列相比,同源性为78%。将克隆的OsMIOX基因连接pCAMBIA-1301载体,成功构建了35 s启动子驱动的植物超表达载体。实时定量PCR分析结果表明,水分胁迫下OsMIOX基因在旱稻IRAT109中上调表达,在旱稻(IRAT109和毫格劳)中的表达量显著高于水稻(越富和日本晴)。这说明水稻和旱稻的水分胁迫分子反应机制的确存在差异,而这种差异很可能就是水、旱稻抗旱性不同的原因之一。     

木聚糖酶基因(XynB)肠道特异表达载体的构建及鉴定

将黑曲霉属XynB基因和猪RELMβ基因核心启动子区克隆到pcDNA3.1(-)中,构建携带绿色荧光和Myc双标记的肠道特异表达载体pcDNA3.1-RELMβ-XynB-Myc-GFP。利用脂质体介导将载体转染人结肠癌细胞(HT29)和人肝癌细胞(Bel7402),荧光显微镜检测发现,该载体可在HT29细胞特异表达绿色荧光蛋白;对转染该表达载体的HT29细胞进行RT-PCR检测和WB分析,结果表明,XynB基因在HT29细胞中正常转录,并且在细胞内检测到目的蛋白表达。     

水稻OsVDAC5真核表达载体的构建及在酵母中的表达研究

[目的]构建水稻OsVDAC5的真核表达载体,对其进行真核表达研究。[方法]将Osvdac5基因与酵母表达载体pPIC3.5K连接,通过电转化的方法插入到毕氏酵母GS115中,筛选阳性重组菌株,通过0.5%的甲醇诱导使外源的水稻Osvdac5基因表达,并利用West-ern Blot鉴定表达蛋白的特异性。[结果]成功构建了Osvdac5::pPIC3.5K酵母表达载体,将其整合到酵母GS115基因组后,对其进行诱导表达,产物经Western Blot检测,证实了表达蛋白为OsVDAC5。[结论]该研究结果为进一步研究OsVDAC5蛋白的功能奠定了基础。     

水稻线粒体nad1基因超表达载体的构建和遗传转化(英文)

[目的]克隆线粒体相关基因nad1,获得转nad1的转基因水稻植株。[方法]采用TRIzol法提取水稻幼苗总RNA,以反转录的cDNA为模板,扩增得到nad1;将nad1接到线粒体信号肽Rf1b的5 (Rf1b5 ),装载到pCAMBIA1305.1双元表达载体,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行遗传转化。[结果]克隆的目的基因nad1大小为978 bp,成功构建了携带线粒体信号肽的nad1植物表达载体,并获得了转nad1基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中过表达nad1对水稻生长的影响奠定了基础。     

蚓激酶基因乳腺表达载体构建及在牛乳腺中的瞬时表达

在稀有密码子的改造基础上,人工合成了849 bp的蚓激酶F-Ⅲ-1全长cDNA序列,并以其为目的基因,构建了以山羊β-酪蛋白启动子为上游调控序列的乳腺组织特异性表达载体pBLK和pLN-bCP-LK。2种质粒分别以200,500,1 000,2 000μg的剂量梯度注入泌乳期黑白花奶牛乳腺,以纤维蛋白平板溶圈法(FAPA)检测该基因表达后奶样的纤溶活性。结果表明:注射后3~78 h,奶样有明显纤溶活性,其中6~16 h活性最高。500μg pBLK质粒与其他3个剂量溶圈直径之间差异显著(P<0.05),而其他3个剂量之间差异不显著;pLN-bCP-LK质粒的各剂量溶圈直径之间差异均不显著,且2种质粒的同剂量溶圈直径之间差异也不显著。以上结果表明,改造后的蚓激酶基因可以在泌乳期黑白花奶牛乳腺中实现瞬时表达,以500μg的注射剂量表达效果最佳。     

尾穗苋凝集素（ACA）基因植物表达载体的构建

尾穗苋凝集素（Amaranthus caudatusagglutin in,ACA）是一种存在于尾穗苋种子中的贮藏蛋白,属苋菜凝集素家族,对同翅目害虫如蚜虫、褐飞虱、叶蝉等有明显的致死作用。植物表达载体pCAMB IA2300-35S-OCS带有35S启动子及终止序列、卡那霉素（Kan）抗性基因NPTⅡ。载体pGEMT-ACA含有ACA基因,通过PCR扩增出ACA基因。把植物表达载体pCAMB IA2300-35S-OCS和扩增后的ACA基因用KpnⅠ和SalⅠ双酶切后经连接酶连接,得到植物表达载体pCAMB IA2300-ACA。将该载体分别导入农杆菌GV3101和LBA4404进行保存。     

猪Ghrelin基因真核表达载体构建(英文)

[目的]为研究转生长相关基因对猪的作用。[方法]采用RT-PCR方法,从13/17罗伯逊易位杂合子猪小肠组织中提取总RNA,将其纯化后作为PCR扩增模板,参考GenBank公布的猪Ghrelin的mRNA序列设计合成具有Nhe I和Hind III双酶切位点引物,扩增获得Ghrelin基因cD-NA全长序列。将准确的Ghrelin基因片段克隆于 pMD19-T simple Vector后进行序列分析,获得猪Ghrelin基因cDNA全长基因片段。经Nhe I和Hind III双酶切,将 Ghrelin基因cDNA片段连接到真核表达载体pEGFP-N1,获得真核表达载体的重组质粒pEGFP-Ghrelin。重组质粒转染猪成纤维细胞,观察标记基因荧光蛋白的表达。[结果]13/17罗伯逊易位杂合子猪的Ghrelin基因与已发表的序列相同,并成功获得具备猪Ghrelin基因全长cDNA序列的真核表达载体pEGFP-Ghrelin。[结论]构建的真核表达载体可以用于转基因猪的进一步试验,同时也为研究Ghrelin的调节机制奠定基础。     

水稻 OsPIN1b 基因 GFP 融合表达 载体构建及转化水稻的研究

水稻生长素输出载体OsPIN1a可能参与调控水稻根负向光性反应。为了进一步研究其他OsPIN基因与水稻根负向光性的关系,以GenBank数据库报道的OsPIN1b核苷酸序列为基础,设计特异引物以RTPCR从水稻cDNA中扩增得到OsPIN1b基因。测序结果表明获得完整的OsPIN1b基因ORF序列;生物信息学分析表明,OsPIN1b基因序列全长1 665 bp,与已报道的序列相吻合,其GC含量为64.08%,编码554个氨基酸。进一步构建了该基因的GFP融合表达载体pCAMBIA-1301-OsPIN1b∷GFP并转化水稻中花11,分子检测和GUS染色表明外源片段已经成功整合到水稻基因组,为研究OsPIN1b在水稻根负向光性中的作用奠定基础。