花生中促丝裂原蛋白活化激酶6a(AhMAPK6a)的克隆与表达分析

促丝裂原蛋白活化激酶(MAPK)是一类保守的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,是一类植物对逆境胁迫反应途径中的关键家族基因。本研究利用已经构建的花生种子全长cDNA文库,以拟南芥MAPK序列为模板,结合大规模EST测序和RACE克隆等方法,从花生中克隆得到了一个MAPK基因,命名为AhMAPK6a,并在GenBank上注册,注册号为KP329549。其cDNA序列全长1492bp,开放阅读框(ORF)含有1191bp,编码一条含有397个氨基酸的蛋白序列。不同物种中MAPK基因的氨基酸序列比对发现,该基因含有典型的Ser/Thr保守基序,与拟南芥、大豆、本生烟的同源性分别为86%、94%和90%。不同组织部位的荧光定量(qPCR)分析表明,该基因在叶片中的表达量最高,其次在根中,在茎、花、子叶和下胚轴中的表达量极低,表明该基因可能在花生的根和叶的生长发育中发挥较大作用。在脱落酸(ABA)和聚乙二醇(PEG)胁迫下,表达量发生明显变化,可以推测该基因在干旱胁迫反应中发挥重要作用。     

花生胚胎发育晚期丰富蛋白基因AhLEAL的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

低温、高盐和干旱等非生物胁迫严重影响花生的生长和产量,而花生中有关非生物胁迫的研究及抗性基因的挖掘较少。胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant,LEA)是一类亲水性蛋白,其功能主要是参与调控植物应答脱水相关的非生物胁迫包括耐盐、抗旱和抗冻等。本研究以花生品种花育33号为试验材料,根据cDNA文库中已知的胚胎发育晚期丰富蛋白基因全长序列设计引物,通过RT-PCR克隆到该基因。该基因全长为555bp,开放阅读框为291bp,编码97个氨基酸。核苷酸序列比对表明,该基因与花生中已注册基因AhARG2(XM_016113504)同源性为100%,与AhLEA6-1(HM543588)同源性为99%。蛋白序列比对分析表明,该基因编码的蛋白与Genbank上已经注册的沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)、牧豆树(Prosopis juliflora)和柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)等植物中的胚胎发育晚期丰富蛋白同源性达到近65%。我们将该基因命名为AhLEAL(Arachis hypogaea Late Embryogenesis Abundant Like)。预测该基因编码的蛋白可能定位于细胞液、线粒体、内质网和叶绿体中。荧光定量PCR结果显示,AhLEAL在花生叶片和根中的表达受低温和高盐胁迫的强烈诱导,在根中受干旱胁迫的强烈诱导,说明该基因可能参与了花生对三种非生物胁迫的适应性调控;此外,AhLEAL在花生叶片和根中的表达也明显受ABA的诱导,说明该基因对花生逆境胁迫的调控可能是以依赖ABA的方式进行的。     

小麦转录因子TaDREB6基因的克隆及鉴定

为了克隆小麦干旱应答基因,构建了干旱诱导的小麦cDNA文库,并从文库中分离了一个DREB类转录因子基因TaDREB6.序列分析表明,TaDREB6具有一个837bp的开放阅读框和242bp的3非编码区,推测的氨基酸序列中含有一个高度保守的AP2/EREBP结构域.采用该基因特异引物PCR技术对一套中国春缺体-四体材料进行扩增,将TaDREB6定位于3A染色体上.这是首次将一个小麦DREB基因定位在特定的染色体上.RT-PCR分析表明,TaDREB6基因受干旱胁迫诱导表达;亚细胞定位结果表明,TaDREB6-hGFP融合蛋白定位于细胞核中.上述结果说明,小麦TaDREB6基因编码的蛋白可能在细胞核内对干旱胁迫应答反应起调控作用.     

花生AhMAPK14基因的克隆及表达分析研究

环境胁迫严重影响花生的产量和品质.筛选并研究花生中胁迫响应相关基因,对深入解析花生响应胁迫的分子机理具有重要意义.本研究从花生果腐病转录组文库中筛选并克隆得到花生基因AhMAPK14,对其进行了生物信息学分析及亚细胞定位,并利用qRT-PCR技术分析了其组织表达特异性及在不同处理下的表达模式.结果表明,AhMAPK14...     

橡胶树HbWRKY3的克隆及其响应逆境胁迫的表达分析

通过RACE技术扩增获得橡胶树HbWRKY3基因,并对该基因及其所编码氨基酸序列进行生物信息学分析和响应逆境胁迫的表达分析,结果表明：该基因含有2个WRKYGQK结构域和2个C2H2锌指结构,属于WRKY基因家族第Ⅰ类;由4个外显子和3个内含子组成,DNA序列全长3 780 bp;开放阅读框长度为2 211 bp,编码由737个氨基酸组成的多肽。该基因定位于细胞核中,在橡胶树叶片、树皮、花、胶乳等不同组织中都有表达,以花中的表达水平最高。盐、PEG、茉莉酸、水杨酸等非生物胁迫均可诱导HbWRKY3的表达,但干旱、ABA、乙烯和低温胁迫的诱导较为明显。     

甜瓜自毒作用相关MYB转录因子的克隆和表达分析

根据甜瓜自毒作用相关MYB转录因子核心区序列设计引物,采用RACE技术获得MYB c DNA全长。生物信息学分析表明,该转录因子全长1 164 bp,包括174 bp的5′非翻译区,105 bp的3′非翻译区,885 bp的开放阅读框,编码294个氨基酸,属于MYB类转录因子中R2R3-MYB类型,与黄瓜R2R3-MYB类转录因子的氨基酸序列的同源性达97.28%。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在植株浸提液胁迫处理2 d时表达量最高,推测该转录因子可能参与了甜瓜自毒相关基因初期的诱导表达,使植株对自毒胁迫做出主动的系统性应答反应。     

大豆RNA依赖的RNA聚合酶基因GmRDR1的克隆与表达特性分析

为了寻找大豆抗病新基因,培育大豆新型抗性品种,利用同源克隆的方法从大豆品种科丰1号中分离出1个新的GmRDR1基因,并对其进行序列分析,组织表达、抗逆境胁迫表达分析及该基因的亚细胞定位研究。结果表明:GmRDR1基因位于大豆基因组的第2号染色体,基因全长为3 956 bp,其中ORF为3 378 bp,编码1 125个氨基酸,相对分子量和等电点分别为279.72×103和4.63;GmRDR1含有RDRs家族的保守序列"DLDGD";该基因在所有被检测组织中均表达,并且在叶中的表达量最高;荧光定量结果发现:在大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)处理下,GmRDR1在抗病材料科丰1号中的表达量显著高于感病材料南农1138-2。盐及干旱胁迫下,48 h之内,该基因的表达量明显升高,SA诱导条件下该基因在6 h出现了早期响应,冷害处理下24 h表达量出现了突然的升高。GmRDR1基因的亚细胞定位结果表明:该基因所编码的蛋白定位在细胞核里。根据以上结果判定GmRDR1基因参与了大豆对SMV的抗性反应,并且能够强烈响应盐和干旱的胁迫,因此该基因在大豆抗逆分子育种中具有较好的应用价值。     

小麦耐冷相关基因TaCTR的克隆及其表达特性分析

低温冷害是小麦生长发育过程中面临的重要非生物逆境因素。为了挖掘小麦耐冷功能基因,本研究采用同源克隆的方法从普通小麦品种小偃22中分离到一个耐冷相关基因TaCTR,该基因序列全长2 192 bp,含有12个外显子、11个内含子,编码区全长为1 407 bp,编码468个氨基酸,分子量约为53.43 kDa;系统进化树分析表明,该基因在进化关系上与山羊草最近;亚细胞定位结果显示,该基因编码的蛋白为膜蛋白;实时荧光定量PCR（RT-PCR）结果表明,TaCTR在不同品种、不同组织和不同发育阶段低温特异表达;在干旱、高盐及GA处理下,TaCTR的表达量显著上升,说明该基因可能参与调控小麦的抗逆反应。     

龙眼胚性愈伤组织中ELF4家族基因克隆及其表达分析

ELF4家族是植物特有基因，能调节生物钟、调控开花时间、感受光周期和参与幼苗去黄化等。以龙眼松散型胚性愈伤组织为材料，采用RT-PCR结合RACE法克隆了ELF4家族3个成员cDNA全长，分别命名为DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE 4。DlELF4全长599 bp，编码140个氨基酸；DlELF4-LIKE 1全长762 bp，编码142个氨基酸；DlELF4-LIKE 4全长661 bp，编码114个氨基酸；DlELF4家族成员均为不稳定的亲水蛋白，无信号肽与跨膜结构，都含有DUF1313保守功能结构域。进化树分析表明，植物中ELF4家族可分成二个亚组，ELF4与ELF4-LIKE 1聚为一组，ELF4-LIKE 2、3、4聚为另一组。qPCR结果表明：在体胚发生过程中DlELF4、DlELF4-LIKE 1和DlELF4-LIKE 4表达模式相同，均在球形胚时期表达量极高，而在其它时期表达量很低；DlELF4家族对不同光质和不同处理时间的响应存在差异：DlELF4的表达经24 h处理时可能受绿光和红光诱导，经72 h处理时可能受红光、蓝光和白光诱导；DlELF4-LIKE 1的表达在24 h处理时可能受绿光诱导，经72 h处理时受红光和绿光抑制；DlELF4-LIKE 4的表达在24 h和72 h处理时可能受蓝光和白光诱导。水杨酸和茉莉酸甲酯能促进龙眼胚性愈伤组织中DlELF4家族成员的表达。以上结果表明，ELF4家族可能参与龙眼体胚发生过程中球形胚的形态建成与胁迫应答。     

花生脂肪酸延长酶基因ＡｈＦＡＥ１及其启动子的克隆与功能分析

为探讨花生脂肪酸中低芥酸含量的原因,从花生中克隆了脂肪酸延长酶FAE1及其启动子序列,并进行了功能分析。结果表明,AhFAE1全长cDNA为2 202bp,含有441bp的5?非翻译区及201bp的3?非翻译区,编码蛋白含519aa,分子量58.17Da,理论等电点9.15,AhFAE1与麻疯树（Jatropha curcas ALB76796.1）、黄麻（Corchorus capsularis OMO87584.1）、拟南芥AtKCS4亲缘关系较近。亚细胞定位结果显示AhFAE1定位于内质网。qRT-PCR结果显示,AhFAE1在各个组织中均有表达,在种子中随着种子的发育成“钟”型变化,花后60d表达量最高。构建了植物表达载体,通过农杆菌介导法转化拟南芥研究启动子功能,利用GUS组织化学染色研究其表达特征,在任何组织中未发现GUS活性。推测AhFAE1可能参与了花生长链脂肪酸的合成,但是该基因启动子转录活性弱可能是造成花生中低芥酸含量的主要原因。      

花生油质蛋白基因的克隆与表达分析

油质蛋白作为贮藏蛋白的一种,特异性表达在油料种子中。本研究从花生中克隆得到3个Oleosin22基因,分别命名为AhOleosin22a,AhOleosin22b,AhOleosin22c。AhOleosin22a基因全长为630bp,编码210个氨基酸;AhOleosin22b基因全长为636bp,编码212个氨基酸;AhOleosin22c基因全长为582bp,编码194个氨基酸,均属于Oleosin蛋白质家族。通过荧光定量PCR对Oleosin22基因在花生中的表达模式进行分析。结果显示,AhOleosin22基因在种子中的表达量最高。本研究为阐明Oleosin22基因在花生油脂合成的生理生化机制中的功能奠定了理论基础,丰富了花生品质改良育种的基因资源。     

花生种子长宽比性状遗传分析和相关SSR标记筛选

本研究以‘花育36号’ב高油613’构建重组自交系(recombinant inbred line,RIL)群体为试验材料,考察2个环境下(E1、E2)RIL群体种子长宽比表型数据,采用数量性状主基因+多基因混合遗传模型联合分离分析方法进行遗传分析。结果表明,E1环境下花生种子长宽比符合B_1_8模型(即2对存在重叠作用的独立主基因遗传模型),主基因间互作效应为-0.19,主基因遗传率为89.86%;E2环境花生种子长宽比符合B_1_7模型(即2对存在互补作用的独立主基因遗传模型),主基因间互作效应为-0.22,主基因遗传率为92.04%。通过对多态性SSR标记筛选和相关性分析,发现标记AGGS1325在2个环境下均与种子长宽比显著性相关。本研究将为深入开展花生粒型分子机制研究和推进花生外观品质育种提供重要理论基础。     

高油酸新品种花育917在花生主产区的展示试验

为客观评价高油酸花生新品种的特征特性及生产利用价值,本研究对高油酸花生新品种花育917进行了产量鉴定和品质分析。结果表明:在花生主产区参加试验的8个品种中,花育917表现出稳产、高产、适应性好的优势。花育917油酸含量77.5%,油亚比13.5,符合高油酸花生标准。其株型为小匍匐型,连续开花结果,单株结果率高,适合精准的单粒稀播技术。     

盐碱地种植高油酸花生品种(系)产量品质性状分析

培育和筛选适宜在盐碱地种植的花生品种,对盐碱地开发及提高土地利用率有重要意义。本研究对种植在滨州盐碱地的13个高油酸花生品系和1个普通油酸对照品种的产量和品质性状进行测定,发现5个花生品种(系)在盐碱地种植相对产量较高,分别为花育33号、P16-8、P16-7、P16-10和P16-41。此外,在盐碱地种植的品种(系)的含油量、油酸含量和油亚比值均有不同程度的降低。本研究为耐盐碱花生品种(系)的筛选提供了参考数据。     

花生白绢病生防菌筛选及防控作用研究

为获得用于花生白绢病防控的生防菌,本研究通过培养皿对峙培养和田间防效试验,进行生防菌株的筛选。结果表明:从土壤中筛选的花生白绢病生防菌为木霉菌和芽孢杆菌,经形态学鉴定与分子生物学鉴定确定为棘孢木霉菌( Trichoderma asperellum)、拟康宁木霉菌(T.koningiopsis)、钩状木霉菌(T. hamatum)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus )。芽孢杆菌和木霉菌对花生白绢病均有一定的防控作用。生理生化测定结果显示,生防菌能提高花生叶片中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)防御酶的活性,表明获得的生防菌木霉菌株及芽孢杆菌株能提高花生植株抗病性。     

不同花生基因型机械化收获相关特性的研究

在对57个花生品种(系)的果柄强度和鲜荚果不同方向果壳强度进行测定的基础上,提出适合鲜花生机械化收获的普通型花生品种的技术指标,即果柄强度最小值不低于5N且果壳强度最小值不低于1.26kN。选出16L25、16L90、16L9、16L8、15L26、16L72、宇花31号、花育31号、15L36G和吉花11号等10个适合一段式机械收获的花生新品种(系),并提出了花生机械化收获适宜性指标研究的思路。     

基因型和成熟度对鲜食花生感官品质的影响

依据甜味、香味、细腻度、脆性、苦味、异味和总体喜欢度等7项指标按5级标准(1~5),评价了4个基因型3个不同成熟度花生样品的鲜食感官品质。结果表明,基因型间总体喜欢度有显著差异、细腻度有极显著差异;成熟度间总体喜欢度和甜味均有极显著差异,脆性有显著差异。总体来看成熟度较好的花生其鲜食口感较好。基因型和成熟度的互作对各指标均无显著影响;主导分析表明,甜味是影响鲜食花生总体喜欢度的主要因素,其他因素的重要性依次为异味>细腻度>脆性>苦味>香味。     

一种快速高效提取花生叶片DNA的简化方法

为获得适用于高通量测序的高质量花生叶片DNA,本方法取第三对真叶为实验材料,设计烧制圆球状枪头和离心管装置代替研钵研磨,并在CTAB法的基础上在杂质沉淀前快速分离DNA等简化方法提取DNA。琼脂糖凝胶电泳检测结果表明DNA条带清晰、完整性高。经超微量分光光度计检测,DNA浓度范围在104～131ng/μL,OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.7～2.0,OD₂₆₀/OD₂₃₀大于2.0,说明杂质少,可获得高纯度,高浓度的DNA。此方法与常用的植物基因组DNA提取方法相比,具有成本低、时间短、质量高的优点,可用于基因组重测序、分子生物学技术以及分子标记筛选等后续研究,可提高花生分子育种与筛选工作效率。     

辽西地区花生田昆虫种级群落组成及益害比分析

为阐明辽宁西部风沙地区花生田的昆虫种级群落,剖析花生害虫与益虫发生动态,2015年5-10月,采用马来氏网收集结合形态学鉴定、解剖鉴定、DNA条形码三种鉴定方法,对辽宁西部重要花生产区阜新花生试验田开展了昆虫系统调查,并对其主要害虫与天敌益害比进行分析。结果表明:共获得昆虫标本15725头,鉴定为7目65科206种。其中膜翅目的茧蜂科、姬蜂科、隧蜂科、金小蜂科,半翅目的叶蝉科、蚜科,鞘翅目的叶甲科、瓢虫科为科级优势类群;优势种有膜翅目的卷叶虫绒茧蜂(11.10%)、铜色隧蜂(9.80%)、粘虫绒茧蜂(7.52%)、食蚜蝇姬蜂(7.14%)、喜马拉雅聚瘤姬蜂(7.01%)、燕蚜茧蜂(6.15%);半翅目的小绿叶蝉(44.88%)、花生蚜(14.63%)和小长蝽(11.79%);鞘翅目的双斑萤叶甲(71.68%)、龟纹瓢虫(8.90%)、异色瓢虫(8.26%);鳞翅目的小菜蛾(23.88%)、草小卷蛾(22.55%)、玉米螟(9.12%);双翅目的粘虫缺须寄蝇(30.63%)、大灰优食蚜蝇(21.77%)和夜蛾土蓝寄蝇(19.19%)等。斜纹夜蛾、花生须峭麦蛾的天敌种类分别为11种和3种;益害比分别为244.80、33.26,显示出较好的天敌控制作用;花生蚜天敌种类24种,益害比为2.39,西花蓟马天敌种类为4种,益害比为3.29,花生蚜和西花蓟马的天敌控制力较差。     

减施氮肥对旱地花生农艺性状及产量的影响

为明确减施氮肥对提高氮肥利用效率和稳定提高花生产量的途径,采用田间小区试验,研究减量施用氮肥和配施有机肥、钙肥对花生生长发育及产量的影响。结果表明,减施氮肥可显著降低肥料贡献率、花生主茎高、侧枝长、生物积累量和饱果数,最终降低产量,减氮量越多影响作用越大。减量施用氮肥同时增施有机肥,可显著提高花生主茎高、侧枝长、生物积累量、饱果数及产量,其中N1O3处理效果最为理想,其主茎高、侧枝长、生物积累量、饱果数及产量均优于常规施肥处理(CK),较之分别增加2.63%、1.44%、3.74%、2.58%、2.41%、3.89%,但差异不显著。减量施用氮肥同时配施钙肥可显著增加花生地下部生物积累量、单株荚果数、饱果数及产量,其中N1Ca2处理效果最为理想,其地下部生物积累量、饱果数及产量均优于常规施肥处理,较之分别增加6.86%、0.81%、6.92%,但各处理与CK间差异均不显著,减氮配施钙肥处理对主茎高、侧枝长、地上部生物积累量的影响不明显。本研究为花生生产中氮肥减量、提高花生产量提供了技术途径。