农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化影响因素分析

为解决农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化效率较低的难题,以春小麦Bobwhite成熟胚为外植体,分析植物激素、愈伤组织预培养时间、侵染时间和共培养阶段干燥处理对小麦成熟胚愈伤组织遗传转化的影响,并在遗传转化处理中辅以3个组织再生相关基因(TaSERK1、TaSERK2、TaNiR)的qRT-PCR分析。结果表明,愈伤组织预培养阶段添加适量的2,4-D和Picloram均可诱导成熟胚愈伤组织的形成,但是2mg·L~(-1)Picloram培养基中愈伤组织的胚萌发率为20.78%,远高于2,4-D诱导的胚萌发率(11.38%);共培养阶段对农杆菌侵染的愈伤组织进行干燥处理能适当提高愈伤组织的转化效率;qRT-PCR分析发现再生相关基因TaNiR相对表达量的增加能适当提高愈伤组织的转化率。     

农杆菌介导的小麦幼胚遗传转化体系的优化

为了优化农杆菌介导的小麦幼胚转化体系,通过对4个小麦品种河农827、石新828、河农825、良星99的幼胚组织培养及再生系统的研究表明,在改良培养基MSW1和MSW2中,小麦幼胚胚性愈伤组织诱导率与MSW0培养基相比分别提高了6.0%和5.4%,并且显著提高了植株再生能力。采用混合正交试验设计,对农杆菌遗传转化过程中小麦幼胚的诱导培养基、诱导时间、农杆菌侵染浓度、侵染时间进行了优化。结果表明,在诱导培养基MSW2,诱导培养6d,OD660=1,侵染时间3h时,愈伤GUS瞬时表达率及抗性愈伤成活率最高,对河农827成活的抗性再生植株进行PCR检测,获得了候选转基因植株。     

根癌农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化影响因素的研究

为了进一步完善根癌农杆菌介导的小麦遗传转化体系,以小麦成熟胚为转化受体,研究了根癌农杆菌介导法转化小麦的主要影响因素,结果表明,以gus基因瞬时表达率、抗性愈伤组织获得率和分化率为转化指标,小麦成熟胚在预培养基CM4C1P上预培养14d后,用侵染培养液Ⅰ侵染3 h,再经干燥共培养方式处理3 d,是根癌农杆菌介导成熟胚转化的合适条件.在优化条件下,转化约30 d后GUS稳定表达的愈伤组织数占受体组织总数的15.83%;GUS稳定表达的抗选择剂G418的植株数占受体组织总数的0.28%.     

小麦成熟胚诱导胚性愈伤组织的影响因素

为加快小麦成熟胚在转基因研究中的利用,以陕麦159成熟胚为外植体,通过胚性愈伤组织诱导,建立了一套有效的小麦愈伤组织诱导体系。研究表明,不同消毒处理、2,4-D浓度和接种方法对胚性愈伤出愈率的影响有极显著差异,不同浸种时间和培养基类型对胚性愈伤组织出愈率的影响无显著差异。采用次氯酸钠初次消毒20min,升汞二次消毒5min,消毒彻底,对种子损害较小;浸种时间18～20h易于成熟胚的剥取,且诱导的愈伤组织质量较好;MS培养基较1/2MS培养基诱导愈伤组织效果好,MS培养基2,4-D浓度为4mg.L-1时（30g蔗糖＋7g琼脂）胚性愈伤组织率最高,愈伤组织质量较好;完整胚诱导胚性愈伤组织率最高达84.17%,碎胚诱导胚性愈伤组织率最高达94.17%。     

农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素

为了研究农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素,以6个小麦品种成熟胚为外植体进行离体培养,以EHA105和LBA4404农杆菌为供体(含有pCAMBIA1305双元载体)材料,研究了诱导培养基、分化培养基、农杆菌菌株、愈伤组织诱导培养时间、农杆菌菌液浓度和侵染时间对小麦成熟胚愈伤组织诱导、分化、再生的影响。结果表明:(1)以小麦品种小偃22的成熟胚为材料,获得最佳的诱导培养基方案(MS+2mg.L-1 2,4-D+0.5mg.L-1 KT+500mg.L-1水解酪蛋白+150mg.L-1天门冬酰胺)和分化培养基方案(MS+2mg.L-1 ZT+0.5mg.L-1 KT);(2)6个小麦品种中,洛阳8176和张掖春小麦具有较强的再生能力,筛选培养后较多的愈伤组织分化出小绿点;(3)洛阳8716和张掖春小麦的成熟胚,经愈伤组织诱导培养6-7d,农杆菌侵染后愈伤组织再生能力强;(4)农杆菌侵染后愈伤组织的再生能力与农杆菌菌株的关系不明显,而与小麦品种基因型、侵染时间和菌液浓度有较明显的关系;(5)以小麦洛阳8716和张掖春小麦成熟胚愈伤组织为受体,黑暗条件下诱导培养6-7d,在24±1℃黑暗条件下共培养3d和500mg.L-1羧苄青霉素(Cb)除菌及10mg.L-1潮霉素筛选处理后,共得到分化植株23株,其中以洛阳8716为受体材料,由农杆菌LBA4404和EHA105转化得到的植株分别为11株和4株,植株分化率分别为3.57%和1.31%;以张掖春小麦为受体材料,由农杆菌LBA4404和EHA105转化得到的植株分别为5株和3株,植株分化率分别为1.57%和1.14%。     

农杆菌介导的宁麦13成熟胚遗传转化体系的构建

宁麦13是目前生产中应用面积较大的弱筋小麦品种,以此品种建立农杆菌介导的成熟胚遗传转化体系有助于对该品种的个别性状进行针对性改良。本研究利用分别携带不同质粒pCXK1301和pAt-MYB12u的农杆菌株系GV3101对宁麦13成熟胚愈伤组织进行转化,通过对预培养时间、共培养时间和干燥处理等参数的研究,建立了农杆菌介导的宁麦13成熟胚遗传转化体系。宁麦13成熟胚转化体系的条件为:利用预培养6d的宁麦13成熟胚愈伤组织作为转化受体,使用含pAtMYB12u质粒的农杆菌株系GV3101,侵染菌液浓度OD600=0.6,侵染时间60min,采用干燥共培养4～5d(23℃,暗培养),诱导恢复培养10d,分化培养每4week继代一次,分化培养8week(12h光周期,25℃,2 000lx)。试验侵染2 600个宁麦13愈伤组织,获得127株再生植株,经分子检测,其中9株证实为阳性转化植株。     

卡那霉素在小麦愈伤组织遗传转化中的应用

为建立利用卡那霉素筛选的小麦遗传转化的有效体系,采用不同浓度的卡那霉素对小麦品种的幼胚愈伤组织进行处理,系统地研究了不同品种、不同愈伤组织诱导培养基、不同诱导培养时间下愈伤组织对卡那霉素筛选的反应。结果表明,不同小麦品种的愈伤组织对卡那霉素的抗性存在显著差异;同一品种不同培养条件下产生的愈伤组织对卡那霉素的反应存在显著差异;小麦品种河农827在N培养基上诱导培养14d得到的愈伤组织在含有15mg.L-1卡那霉素的分化培养基上筛选,效果较好。基因枪介导转化河农827的愈伤组织,用卡那霉素筛选得到的抗性再生苗经PCR检测,检测出12.5%的阳性株。     

二穗短柄草成熟胚再生体系建立及农杆菌介导转化研究

为建立二穗短柄草组织培养及遗传转化体系,以二穗短柄草BD21-3成熟胚为外植体,对成熟胚愈伤诱导、分化以及农杆菌侵染条件进行了研究。结果表明,在含有2.5mg·L~(-1) 2,4-D的培养基上,愈伤组织出愈率最高为93.83%;在含有0.2mg·L~(-1) KT的分化培养基上,分化率最高为38.18%;对二穗短柄草胚性愈伤组织农杆菌转化和GUS染色结果表明,侵染的过程中农杆菌菌液浓度OD_(600)为0.6、侵染时间为5min时转化率最高。     

不同小麦成熟胚对愈伤组织形成及萌发的影响

为了解决小麦成熟胚离体培养过程中脱分化较为困难的问题,对2001-2003年不同时期收获及不同保存条件下的小麦品种川农17、川农12号成熟胚分别在六种诱导培养基中进行离体培养,结果表明,2002年成熟胚形成愈伤组织的能力和萌发能力高于2001年的成熟胚;2003年4月27日与5月13日收获的两批成熟胚(包括在室温26 2℃和低温4℃下存放)在形成愈伤组织及愈伤组织的分化能力方面没有显著差异,但2003年5月13日收获的成熟胚在诱导培养基中直接萌发成苗的能力更强。4℃存放虽然促进早期(4月27日)收获的成熟胚在诱导培养基中直接萌发成苗,但对各时期收获的成熟胚形成愈伤组织的能力没有影响;高浓度2,4-D(6 mg／L和8 mg／L)抑制胚萌发,但KT(0.5 mg／L)可以促进胚萌发。     

农杆菌介导优良玉米自交系Ⅱ型胚性愈伤组织遗传转化体系的建立

以玉米自交系8902、340、4112未成熟幼胚为材料,诱导、继代筛选出良好的Ⅱ型胚性愈伤组织,用农杆菌(EHA105和LBA4404)介导法转化其愈伤组织.利用本室构建的植物双元表达载体中携带的GUS报告基因对农杆菌转化系统的条件进行了研究,如农杆菌的侵染浓度、菌种类型、侵染时间、A8(乙酰丁香酮)浓度及基因型等,建立了农杆菌介导优良玉米自交系Ⅱ型胚性愈伤组织高效遗传转化体系。     

利用农杆菌介导法进行亚麻转基因的培养基研究

本试验以亚麻幼苗的下胚轴为外植体进行了卡那霉素选择压力的试验。确定5 0mg/L为适宜的选择压力。同时采用农杆菌介导法 ,利用EHA1 0 5菌株进行了亚麻转基因适宜培养基筛选试验。经试验认为MS培养基是亚麻转基因的适宜培养基。在附加IAA3.5mg/L、KT2mg/L、LH1 5 0mg/L的MS选择培养基上转化外植体的愈伤组织的诱导率可达 77.4%。     

农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系的研究

以携带pCAMBIA1301(含GUS基因)质粒的EHA105菌株侵染玉米优良自交系齐319的幼胚,培养3 d后,借助GUS基因的瞬时表达率,对影响农杆菌介导玉米幼胚转化的部分因素进行优化。结果表明,农杆菌侵染液最佳浓度OD600为0.4～0.6,最适合用于转化的幼胚大小为直径1.5 mm,最佳侵染时间为20 min,GUS瞬时表达率为23.46%。     

亚麻转基因植株的再生及生根培养的研究

本试验以亚麻幼苗的下胚轴为外植体 ,利用抗除草剂 Basta的目的基因和 GUSINT基因 ,采用农杆菌介导法进行了亚麻转基因过程中植株再生及生根适宜培养基的筛选试验。经试验得出 :在附加少量 BA和 NAA的 Ms培养基上愈伤组织的再分化率可达31.8%～ 40 .2 %。经 GUS基因检测在脱菌后 3天亚麻下胚轴初步形成的愈伤组织的转化率可达 72 .2 %;四周后的转化率为 2 5 %;再生植株的转化率为 2 0 %。在 1/2 Ms培养基中附加 0 .0 0 1mg/L NAA可使再生植株的生根率达到 87.4%。通过试验初步建立起了根瘤农杆菌介导法亚麻转基因系统。     

小麦基因转化研究进展

为了给小麦遗传转化研究提供参考,总结和分析了小麦基因转化的最新研究进展,并针对存在的主要问题提出了今后的研究方向.目前在小麦表达载体构建中普遍采用Ubi和在35S基础上改造而来的启动子序列,使用的报告基因主要有gus、uidA、gfp和Cl/LC等,选择基因主要有bar、nptⅡ、manA(pmi)、Cah、gst27、mopat、popat、CP4和GOX,筛选剂一般选用Bialaphos、Glufosinate、G418和Glyphosate等.小麦基因转化的主要受体为幼胚及其愈伤组织,转化方法主要有花粉管通道法、基因枪法和农杆菌介导法.受体类型、表达载体序列组成和基因转化方法是影响小麦基因转化效率的主要因素.     

氨基酸对小麦成熟胚愈伤组织诱导率的影响

为优化小麦成熟胚愈伤组织诱导体系,以中国春（Chinese Spring）成熟种子为材料,MS培养基为基础培养基,研究酒精、双氧水不同的灭菌时间和不同氨基酸组分对小麦成熟胚愈伤组织诱导与分化的影响。结果表明,当75%酒精浸泡时间控制在180 s、30%双氧水灭菌时间15 s以上时和当30%双氧水消毒时间控制在180 s、75%酒精浸泡时间15 s以上时,成熟胚均不会出现污染。甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸和亮氨酸是小麦成熟胚诱导的必须氨基酸。正交实验结果表明,培养基中最佳的氨基酸配组为甘氨酸60.0 mg·L^-1、天冬氨酸2.0 mg·L^-1、脯氨酸2.0 mg·L^-1和亮氨酸0.1 mg·L^-1。利用该培养体系,小麦成熟胚的出愈率达到97%以上。本研究优化了小麦成熟胚的培养体系,也为研究小麦氨基酸代谢的生理过程提供了参考。