紫云英根瘤中共生固氮下调表达基因的分离与初步分析

对前期利用抑制消减杂交技术(Suppressive subtractive hybridization,SSH)构建的紫云英(Astragalus sinicus)根部组织的共生固氮差异表达cDNA文库进行了全文库测序和初步分析,并利用半定量RT-PCR方法验证了其中5个基因片段在根瘤中的下调表达。结果表明,从180个克隆中共获得94个有效序列,文库插入片段长度为200~1 300 bp。BLAST同源比对分析结果表明,有90个序列可以找到同源片段,有4个可能为新基因,按功能分为10个类群。     

Frankia共生固氮基因的分离与克隆

利用ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交方法，分离细枝木麻黄的Ｆｒａｎｋｉａ菌株Ｃｃ０１的ｎｉｆ克隆ｐＣｃ１ＧＸ，赤杨内生菌株Ａｔ４的ｎｉｆ克隆ｐＡｔ１ＧＸ及沙棘的ＦｒａｎｋｉａＨｒ１８的ｎｉｆ克隆ｐＨｒ１８ＧＸ、ｐＨＲ１１－③ＧＸ。用基因功能互补法，从Ｆｒａｎｋｉａ菌株Ａｔ４的基因文库中分离到二个可能可互补豌豆根瘤菌ｎｏｄ基因功能的克隆ｐＡｔ２ＧＸ、ｐＡｔ３ＧＸ，并制作了ｐＡｔ２ＧＸ、ｐＡｔ３ＧＸ的亚克隆，予进一     

激发子PB90诱导不结球白菜过敏性细胞死亡早期上调表达基因片段的分析

【目的】从基因组水平筛选不结球白菜中受激发子PB90诱导过敏性细胞死亡早期上调表达的基因。【方法】采用抑制性差减杂交的方法筛选疫霉菌激发子PB90注射处理不结球白菜叶片5 h内上调表达的基因。【结果】测定分析了200个上调表达的cDNA片段,生物信息学分析表明它们包含70个上调表达的基因片段,共分为9类：基本能量或代谢产物;蛋白质合成分解;细胞信号传导;细胞凋亡;转录;运输相关和编码未知功能的蛋白等。进一步用半定量RT-PCR分析了候选基因beclin,thioredoxin,HLA-B,MAP3K,SPT1, SPT2和AGO1,表明这7个基因在PB90诱导不结球白菜过敏性细胞死亡早期上调表达。【结论】构建了疫霉菌激发子PB90诱导不结球白菜过敏性细胞死亡早期抑制性差减杂交cDNA文库,获得了70个上调表达的基因,并对其中7个基因的可能功能进行预测分析,认为这些基因可能与疫霉菌激发子PB90诱导不结球白菜过敏性细胞死亡有关。这些基因的挖掘为进一步阐明过敏性细胞死亡的分子机制提供了素材。     

应用抑制差减杂交法分离玉米幼苗期叶片土壤干旱诱导的基因

 【目的】分离土壤干旱胁迫条件下玉米幼苗期叶片诱导表达的基因。【方法】本研究利用抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）的方法，以耐旱自交系CN165为材料，构建了土壤干旱胁迫下玉米幼苗叶片的正向抑制差减cDNA文库。【结果】在这个文库中，随机挑取了672个阳性克隆，并进行PCR验证，对所有的单克隆进行了测序。得到了598个有效序列，经过EST聚类分析后，共得到了80个uniESTs。其中57个为contigs。23个为singlets。BLASTN的结果表明，所有的uniESTs都可以在玉米的核酸数据库中找到同源序列。BLASTX的结果表明：68个uniESTs和已知功能的蛋白有高度的相似性，8个uniESTs为未知功能蛋白和假定蛋白，4个uniESTs没有蛋白质的相似性。【结论】在这个cDNA文库中发现了大量抗旱相关的基因，这些基因涉及到植物代谢的多种途径。     

应用抑制差减杂交法分离粗枝大叶黄杨幼苗的冷诱导表达基因

 应用抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）方法，构建冷诱导表达的正向抑制差减cDNA文库，低温处理的幼苗为tester，常温处理为driver，通过cDNA宏阵列差异筛选cDNA文库，得到604个低温诱导或表达增强的候选克隆，对其中的84克隆进行DNA测序，去除冗余的cDNA，在GenBank中进行核酸和蛋白质同源性的比较和功能分析，共有36个单一序列，有 12 个cDNA未找到同源序列，可能为新基因，表明采用抑制差减杂交方法与cDNA宏阵列技术分离诱导表达的基因是可行的。     

紫云英2个转脂蛋白基因在共生及重金属镉胁迫条件下的表达特征

采用实时荧光定量PCR技术,研究了紫云英共生表达的非特异性转脂蛋白编码基冈AsE246和AsJB259在根瘤发育和固氮过程中的组织和时空表达特征,并初步考察了其在重金属镉胁迫条件下表达水平的变化.结果表明:2个目标基因仪在紫云英根瘤中特异表达,并且均在接种华癸中慢生根瘤菌7653R后22 d左右表达量达到最高.在低浓度...     

甘薯IbTPS1基因的克隆与活性鉴定

[目的]发掘植物海藻糖合成途径关键酶基因,探究其编码蛋白TPS活性,为作物遗传改良抗多种胁迫提供优良的候选基因。[方法]本研究基于干旱条件下从甘薯转录组数据库中得到一条与拟南芥AtTPS1基因高度同源的Unigene序列,通过RT-PCR技术克隆了甘薯TPS基因。利用生物信息学软件分析序列特征,酵母互补试验鉴定编码蛋白TPS活性。[结果]IbTPS1基因cDNA序列全长2 811bp,编码936个氨基酸,且具有典型的GT1-TPS和HAD-TPP结构域;生物信息学预测表明IbTPS1编码的蛋白是一个不稳定亲水性蛋白,无信号肽,定位于细胞质中;二级结构元件多以无规则卷曲和α-螺旋为主;酵母互补实验证明表达IbTPS1基因的TPS突变酵母菌株(tps1Δ)和TPS,TPP双突变酵母菌株(tps1Δtps2Δ),以葡萄糖为唯一碳源的尿嘧啶缺失培养基上可恢复生长。[结论]证实甘薯IbTPS1基因的编码蛋白具有生物活性。     

高温胁迫下草坪草高羊茅差异表达基因的分子研究

通过构建高羊茅高温胁迫下的消减文库,并使用斑点印迹技术从中筛选出差异表达基因,以期深入研究高羊茅适应高温的分子机制。以冷季型草坪草高羊茅为研究对象,在两年生理指标测定的基础上通过构建高羊茅在高温胁迫下的SSH文库,分别以正、反向SSH探针与尼龙膜上的消减c DNA质粒进行杂交,并经相应的显色反应得到杂交信号,比较了38/30°C(昼/夜)的培养箱中高温胁迫6 h的高羊茅叶片和对照组高羊茅叶片的RNA差异。结果表明:试验得到的差减文库中大量组成型表达基因已经被有效去除,使某些特有的差异基因得到了富集;利用斑点杂交共得到252个差异片段,库中阳性克隆约占50%以上;阳性克隆中91个为上调基因,161个为下调基因,这些与高羊茅的耐热性密切相关的基因即为试验所寻的差异表达基因。本试验为找出高羊茅耐热相关基因奠定了基础,为草坪草的转基因育种工作提供了相关依据,结合恰当的水肥调控措施可有效提高草坪草的抗逆性。     

滇牡丹中3个类查尔酮合成酶基因的克隆与表达

从开黄花的滇牡丹转录组中分离了3个CHS基因,利用生物信息学预测其基因功能,并比较不同花发育时期CHS基因的表达量。结果显示:3个CHS基因的cDNA全长分别为1 173、1 185、1 128 bp,依次命名为PdCHS1(GenBank登录号MK516264)、PdCHS2(GenBank登录号MK516265)和PdCHS3(GenBank登录号MK516266),分别编码390、394和375个氨基酸;这3个CHS基因编码的蛋白均为无信号肽的非分泌蛋白,均含查尔酮合成酶活性位点基序(G/A) FGPG。聚类结果显示,滇牡丹中的3个CHS蛋白归属于不同分支。基因表达结果显示,PdCHS1基因在花蕾期和花蕊中表达量较高,PdCHS2基因在末花期和初花期表达量较高,PdCHS3基因在末花期和花蕾期表达量较高。这3个CHS基因分别参与不同次生代谢产物的合成,推测PdCHS1参与柚皮素查尔酮,PdCHS2参与芪类化合物,PdCHS3参与聚酮类化合物的生物合成。     

不同紫云英品种与根瘤菌匹配对结瘤固氮的影响

研究不同紫云英品种与根瘤菌匹配后对紫云英的结瘤固氮影响。结果表明：M10根瘤菌种可分别显著提高8410441、闽紫6号、弋江籽的固氮酶活性、紫云英根瘤数、紫云英根瘤鲜重;ZLH2根瘤菌显著提高8410441紫云英地上部鲜重,ZK7根瘤菌提高闽紫1号紫云英全氮含量。从总固氮量来看,M10、XZ、ZLH2、ZK7、M3根瘤菌分别对提高闽紫6号、8324411、8410441、余江大叶、弋江籽品种的总固氮量效果最佳,其中以ZLH2对8410441的总固氮量最高。固氮酶活性与根瘤数呈极显著负相关,根瘤数与根瘤重呈极显著正相关,产量、全氮含量与总固氮量呈极显著正相关。通过多指标综合评价发现,ZLH2对闽紫6号、8410441的促生效果较好;M10对8324411和弋江籽的促生效果较好;ZK7对余江大叶的促生效果较好。     

紫云英根瘤中特异表达CCPs基因的同源分析及表达定位

将紫云英根瘤中特异表达的编码CCPs(cysteine cluster protein)同源多肽的蛋白AsF259在大肠杆菌表达菌株(DH10B)中进行体外诱导表达,分别检测其在洋葱表皮细胞与紫云英根瘤中的细胞定位,并利用免疫荧光技术,检测紫云英中AsF259基因的时空表达特征。结果表明:AsF259蛋白分布于洋葱表皮的细胞壁、细胞膜、细胞质;基因表达和融合蛋白定位实验显示,AsF259在根瘤中呈特异性表达,在类菌体分化前期大量表达,且AsF259蛋白与类菌体共定位,表明AsF259基因属于NCR家族,在类菌体分化、维持和共生固氮过程发挥重要作用。     

紫云英类受体蛋白激酶Nip43靶蛋白的筛选与初步鉴定

以紫云英类受体蛋白激酶Nip43的S-TKs结构域构建诱饵载体,通过酵母双杂交技术,筛选获得17个候选的阳性克隆。经过测序分析和Blast比对,最终确定了1个互作蛋白EPN。EPN蛋白是网格蛋白聚合反应中的配体蛋白,可调控网格蛋白的聚合反应。通过实验验证显示,靶蛋白EPN与Nip43蛋白互作最强的区域为ENTH/ANTH结构域。Real-time q PCR检测表明,epn基因参与了根瘤菌早期结瘤过程。     

普通田菁的共生固氮特性

普通田菁(Sesbania cannabina)在苗龄10天左右主根开始结瘤,根瘤呈马蹄形至鸡冠状,深红,大小为0.5cm×1.0cm;苗龄65天,主根瘤开始衰败,苗龄35天侧根显瘤,侧根瘤多为球状,少数呈马蹄形,生长期长达80天以上。乙炔还原法测定表明:湿润和旱栽田菁根瘤固氮酶活性的变化比较一致,苗龄60～65天出现活性高峰,分别为16.45微克分子乙烯/株·小时和16.43微克分子乙烯/株·小时。在淹水条件下,固氨酶活性在苗龄,60～80天之间出现两个高峰,其峰值分别为19.91和14.51微克分子乙烯/株·小时。同时,比色测定的结果也表明。在不同的栽培条件下,根瘤豆血红蛋白含量的消长与固氮酶活性变化相一致。在适宜的栽培条件下,普通田菁的固氮周期可长达120天以上,湿润栽培下每季田菁的总固氮量估计可达13g/m~2。     

跨季节种植紫云英适宜播期的选择

湖南省长沙地区紫云英的播种时间一般为9月上旬至10月中旬,为了探索春、夏季播种紫云英效果,确定适宜播种期,试验设立3月7日、4月8日、5月11日、6月12日、7月13日5个播期,对其主要形态指标、生理指标及产草量进行比较。结果表明:3月7日播种的紫云英能量积累较差,植株矮小,产草量相对较低;4月8日播种的紫云英受温度胁迫作用较小,株高、根长、根重等形态指标较佳,个体发育较好,产草量最高;5月11日、6月12日和7月13日3个播期的紫云英受到不同程度高温胁迫,表现为株高降低,根长缩短,根重减小,在生理指标方面表现为叶绿素含量降低,可溶性糖含量和相对电导率升高,尤其是7月13日播种的紫云英受高温胁迫最大,播种后45d出现干枯、死亡现象。因此,湖南长沙地区跨季节播种紫云英以4月8日为宜。     

紫云英新品种（系）在闽侯地区适应性研究

对4个紫云英品种(系)生长发育过程的特征特性进行研究。结果表明,福建省农业科学院土壤肥料研究所选育的新品系闽紫6号和84471031表现中熟;在福建省闽侯地区生长良好,株高、茎粗、分株数等性状均优于余江大叶和宁波大桥2个品种,盛花期鲜草产量分别达37190 kg/hm2和d 39944 kg/hm2;参试品种(系)的生物量和N、P、K养分积累量的大小均为:84471031>闽紫6号>宁波大桥>余江大叶。     

不同紫云英种质种子形态与碳、氮、磷生态化学计量特征

采用生态化学计量与形态计量方法,评价紫云英种质不同品种的种子计量学特征,以期作为紫云英品种(系)鉴别分类指标.11个紫云英品种的千粒重马溪种最大,平均达3.40 g,光泽种和闽紫3号最小,分别平均为3.05 g和3.11g,表征了紫云英马溪种的特性,但不能作为早熟品种的特征;11个品种种子表面积闽紫5号最小为3.46 mm2,马溪种面积最大,均值4.12 mm2;其种子形态,肾形和近肾型种子所占比例范围为83％～96.7％,闽紫7号所占的肾形比率最高为96.7％,闽紫4号和闽紫5号种子为最低,只占83％,差异达到了显著水平.从生态化学计量看,早熟品种C/N和C/P比值居高,如光泽种、闽紫3号.通过聚类分析与主成分分析,闽紫2号、闽紫5号在种质特性方面明显区别于其余9个品种.总之,紫云英种子的千粒重、面积与外观形状特征不易区别不同基因型的品种,但可作为个体区别于其他品种的参考指标.种子C/N和C/P比值可以作为紫云英早、晚熟的参考指标之一.     

冬种紫云英和稻草还田下氮钾肥减量施用对双季水稻产量和养分吸收的影响

大量研究表明有机培肥对提高作物产量、土壤肥力以及农田生产力的可持续性具有重要作用,但对有机肥在化肥减量方面的研究相对较少。本研究利用豆科绿肥生物固氮和稻草富含钾素的特点,以明确双季稻系统冬种紫云英和稻草联合还田在减少化学氮钾肥用量上的效果。于2013—2014年开展田间试验,设置无肥对照、单施化肥(NPK)、在NPK的基础上,冬种紫云英联合双季稻草还田(GM+RS)、冬种紫云英联合稻草还田下,NK肥在NPK的基础上减少20%,P不变(G+S-20%)、冬种紫云英联合稻草还田下,NK肥在NPK的基础上减少40%,P不变(G+S-40%)等5个处理,以明确冬种紫云英和稻草还田下NK肥减量施用对双季水稻产量和养分吸收的影响。结果表明,与NPK处理相比,GM+RS处理的早晚稻产量均有增加的趋势,但仅在2014年的早稻季存在显著差异。NPK与G+S-20%处理的水稻产量无显著差异,G+S-20%处理甚至显著提高了2014年的早稻产量。与NPK处理相比,除2014年的早稻外,G+S-40%处理有降低水稻产量的趋势,但差异均不显著。有机肥处理主要是通过有效穗数影响水稻产量。NPK和G+S-20%处理的N素吸收量无显著差异。与NPK相比,G+S-40%处理降低了2013年早晚稻的N素吸收,但差异不显著。但是,2014年G+S-40%处理早晚稻的N素吸收均显著低于NPK处理。与NPK处理相比,G+S-20%和G+S-40%处理均显著提高了早稻地上部的PK吸收量,晚稻季差异不显著或者有降低趋势。因此,冬种紫云英和双季稻草还田具有显著的节肥效果,而且冬种紫云英和双季稻草还田下有进一步降低早稻化学P肥和K肥用量的潜力。     

磷素营养与大豆生长和共生固氮的关系

在水培条件下,研究了磷素营养对２个大豆品种生长和共生固氮的影响。结果表明,水培液中磷含量在２．３～９．３ｍｇ／Ｌ时,２个大豆品种的植株生长量、根瘤数、根瘤干重、固氮活性和氮积累量均随磷浓度增加而显著增加;而在９．３～３７．０ｍｇ／Ｌ时则大大降低。磷浓度过高会造成毒害,但植株的磷积累量却与施磷量呈显著的线性回归关系。植株不同部位磷含量是根瘤＞根＞地上部分;氮含量是根瘤＞地上部＞根。２个大豆品种对磷肥反应有显著差异。