微载体规模化培养草鱼细胞与病毒的工艺及优化

研究了在悬浮培养系统中使用微载体Cephodex规模化培养草鱼肾脏组织细胞CIK和草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的条件并进行了优化。结果表明,Cephodex是一种适合CIK细胞贴壁生长的微载体,搅拌方式(搅拌时间/静止时间)及血清浓度(0%、5%、10%、15%)对CIK细胞在Cephodex微载体上的贴附效率有影响。贴附期以转速35 r/min、每静置45 min搅拌2 min的间歇搅拌方式最佳,8 h后细胞贴附率可达90%以上;细胞贴附期培养基中的血清浓度为5%。当Cephodex微载体用量10 mg/mL、细胞初始接种密度2.5×105cells/mL、连续搅拌速度40 r/min时可获得最佳的细胞生长效能。用优化的最佳工艺条件大规模培养CIK细胞,接种感染复数为0.1的GCRV病毒3 d后,培养细胞出现典型细胞病变效应,病毒滴度(lgTCID50/mL)为8.5。本项研究为草鱼出血病疫苗规模化制备技术研究奠定了基础。     

大鲵虹彩病毒β-丙内酯灭活方法的研究

为探讨β-丙内酯(β-propiolactone,BPL)灭活大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)的最适条件,研究了BPL对GSIV的灭活方法。采用终浓度分别为0.025%、0.05%、0.1%、0.2%的BPL灭活细胞培养的GSIV,4℃条件下分别灭活24 h、48 h、72 h、96 h,通过细菌培养、细胞培养、病毒核酸PCR扩增以及鱼体感染试验进行灭活病毒的安全性检验,确定最适灭活条件。试验结果表明,GSIV经终浓度为0.1%的BPL 4℃灭活处理72 h后可完全灭活病毒,灭活病毒无细菌污染,接种对GSIV敏感的鲤上皮瘤细胞系(EPC)细胞无细胞病变效应(CPE)出现,病毒主衣壳蛋白(MCP)基因特异性引物PCR反应未扩增出靶基因产物,灭活病毒对健康大鲵的感染试验未出现疾病症状。灭活效果检测结果表明,与未灭活GSIV相比较,最适灭活条件下的GSIV结构蛋白与抗原性未发生显著变化。结论显示BPL可用来灭活GSIV,本研究确立了BPL灭活GSIV的最适条件,为大鲵虹彩病毒细胞培养灭活疫苗研究奠定了重要基础。     

大鲵虹彩病毒理化及生物学特性研究

对大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)的理化特性及生物学特性进行了研究。结果表明:GSIV对热处理敏感,56℃和65℃处理30 min均可彻底灭活病毒;GSIV经酸(pH3)和碱(pH10)处理,病毒滴度(TCID50)与对照组相比较分别下降了8.58、9.04个对数级,差异极显著(P<0.01);GSIV经有机溶剂氯仿、乙醚以及胰蛋白酶处理,TCID50与对照组相比较分别下降了9.33、7.83、6.49个对数级,差异极显著(P<0.01)。冻融次数对GSIV滴度的影响不显著(P>0.05)。GSIV对细胞培养物的感染性试验结果表明,GSIV可在鲤上皮瘤细胞系(Epithelioma papilloma cyprini,EPC)、斑点叉尾鮰肾脏细胞系(Channel catfish kidney,CCK)、虹鳟鱼性腺细胞系(Rainbow trout gonadal,RTG-2)等细胞中增殖,但在EPC、CCK细胞中增殖速度快,TCID50高;GSIV在EPC细胞中的最适生长温度是25℃。GSIV在EPC细胞中增殖动态试验结果表明,GSIV感染细胞6 h后TCID50开始快速上升,进入对数增长期,72 h时TCID50达到最大值,以后趋于稳定。GSIV感染EPC细胞超薄切片透射电镜观察结果显示,在EPC细胞质中可见大量虹彩病毒样颗粒,呈晶格状排列,直径约140 nm。     

大鲵虹彩病毒病灭活疫苗安全性与免疫效力研究

为了探明大鲵虹彩病毒病灭活疫苗的安全性与免疫效力,采用β-丙内酯(β-propiolactone,BPL)灭活鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papilloma cyprini,EPC)内增殖的大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus,GSIV),制备成大鲵虹彩病毒病灭活疫苗,利用免疫...     

大鲵虹彩病毒的PCR检测及初步应用

通过了解大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)在EPC细胞接毒情况和PCR的实际检测情况,为大鲵的病毒检测提供必要判断依据和检测方法.通过细胞接毒和组织分离分别提取病毒质粒,进行普通PCR扩增,电泳分析,比较病毒细胞培养和组织直接提取结果.Gsiv病毒体外培养:经传代48 h的EPC细胞,25℃培养,12h后可观察到CPE出现,24 h病变明显,CPE达15％,48 h后CPE可达70％,72 h后细胞完全脱落;PCR检测:对3个样本分别从组织提取和经细胞扩增分离的病毒进行普通PCR扩增检测,经细胞培养扩增的3个样本全部呈阳性;经组织提取的3个样本,2个呈阳性,一个呈阴性;电泳观察,病毒的扩增产物在500 bp左右.在体外环境下GSIV是高病力的一种病毒,对EPC细胞在25℃时效应时间为3d,普通PCR经组织的检出率低,经细胞培养扩增可提高检出率但耗时久,不利于实际生产中快速、准确诊断疫情的需要.     

一株大鲵虹彩病毒的分离及鉴定

2020年5月,广东广州某野生动物保护基地爆发疑似病毒引发的疾病。现场采样发现,病鲵体长约2 m,反应迟钝,体表有出血点或溃疡症状。本研究采用胖头鲤肌肉细胞系(fat head minnow epithelial cells, FHM)培养、超薄切片透射电镜观察、病毒主要衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)克隆与测序分析等方法,从患病大鲵中分离得到一株病毒,鉴定其属于虹彩病毒科蛙病毒属,命名为大鲵虹彩病毒广州分离株(CGSIV-GZ)。FHM经患病大鲵组织匀浆液接种后出现细胞圆缩、死亡、脱落等典型的细胞病变症状。将感染后的FHM细胞制作超薄切片,通过电镜观察发现,FHM细胞中存在大量直径约100～120 nm具囊膜的正六边形成熟病毒粒子,形态与虹彩病毒相似。根据虹彩病毒MCP基因保守区域序列设计特异性引物对病鲵组织样本进行PCR扩增,获得了431 bp的目的基因片段,测序后经采用BLAST软件分析,发现其与GenBank中的蛙病毒衣壳蛋白基因同源性达96%～99%。确认本次野生动物保护基地大鲵发生大规模死亡是蛙病毒感染所致。     

大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV)主要衣壳蛋白(MCP)编码区长度为1 392 bp 的片段, 克隆到 pMD19-T载体上, 构建重组质粒 pMD19-T-MCP。经PCR鉴定确认正确后, 以10倍梯度稀释 pMD19-T-MCP重组质粒, 作为标准模板进行 TaqMan实时荧光定量PCR扩增, 制作标准曲线, 建立了大鲵虹彩病毒的 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。制作的标准曲线有极好的线性关系, 且线性范围宽, 相关系数为0.990 19。组内重复试验的CT值标准偏差为0.52%。检测结果显示, 该方法对大鲵虹彩病毒的检测有高度的特异性, 与锦鲤疱疹病毒、弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌以及鲤上皮瘤细胞基因组DNA之间均无交叉反应, 特异性好, 检测总DNA灵敏度为10个病毒核酸分子拷贝数, 约1.1×10-3 pg/μL病毒核酸, 较之常规PCR的敏感度高出约1 000倍。研究建立的大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强, 对大鲵虹彩病毒病的快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。     

基于CPB细胞扩增体系的鳜弹状病毒增殖条件的优化

为获知鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)QY株在体外培养细胞中最适增殖条件,以鳜脑细胞系(Chinese perch brain cell line,CPB)为增殖体系,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)技术所测病毒拷贝数为判断指标,比较同步接毒和异步接毒2种接种方式以及病毒接种量、血清浓度等培养条件对病毒增殖的影响,确定SCRV-QY株在CPB细胞中的最适增殖条件。结果显示,单位体积病毒增殖量方面,异步接毒法优于同步接毒法,以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10将病毒接种长满单层的CPB细胞中,28°C吸附1.5 h,用含2%胎牛血清的L15培养液于28°C培养时,病毒增殖量最高,为5.59×10~(10)拷贝/mL;而从单位成本所获病毒量考虑,同步接毒法筛选出的4种增殖条件单位成本所获的病毒产量优于异步接毒法,其中当MOI=0.03、胎牛血清终浓度为6%时,同步接种对数生长中期的CPB细胞,28°C恒温培养70 h后收获病毒液,单位成本所获病毒量最高,为4.88×10~(13)个拷贝/元。综上所述,本研究以病毒增殖量和培养基成本作为考量,优化SCRV-QY株的增殖条件,可为SCRV疫苗低成本、规模化生产提供理论依据。     

大鲵虹彩病毒的形态结构及其包涵体特征

运用电镜和免疫荧光技术,对纯化的大鲵(Andrias davidianus)虹彩病毒粒子、感染病毒的EPC细胞以及确诊感染病毒的病鲵组织样品进行观察和分析。结果表明,纯化的大鲵虹彩病毒负染后电镜下显示球形结构,具囊膜,直径约150 nm;感染EPC细胞中的病毒颗粒呈典型的正二十面体结构,由核衣壳和核心构成,核衣壳呈正六边形,对角直径为(150±5)nm(N=30),核衣壳厚度约5 nm,核心直径为(98±18)nm(N=27)。在病鲵病变的肺和肾组织中发现存在大量聚集或分散的病毒颗粒,其形态特征和感染EPC细胞超薄切片观察的结果一致。免疫荧光电镜观察结果显示,感染病毒的细胞可观察到明显的红色荧光信号,且呈斑块状分布,大小不等。综合大鲵虹彩病毒初步的形态发生和免疫荧光观察结果,认为病毒感染细胞后在不同的发生时期会形成不同类型的病毒包涵体。     

工厂化养殖条件下大鲵适宜养殖密度的研究

在工厂化养殖条件下,研究了养殖密度对2~5龄大鲵(Andrias davidianus)摄食与生长的影响。结果表明:2龄大鲵适宜养殖密度为27尾/m2,该组特定生长率显著高于9尾/m2组、18尾/m2组(P<0.05),且饵料系数最低;当养殖密度为17尾/m2时,3龄大鲵的增重率、特定生长率最大,饵料系数最低且与低密度5尾/m2组差异显著(P<0.05),确定3龄大鲵的适宜养殖密度为17尾/m2;4龄大鲵特定生长率的最大值出现在养殖密度为10尾/m2,显著高于16尾/m2组(P<0.05),且饵料系数最低,4龄大鲵的适宜养殖密度为10尾/m2;5龄大鲵的适宜养殖密度为5尾/m2,特定生长率与高密度组9尾/m2差异显著(P<0.05),饵料系数最低。大鲵适宜养殖密度与体重存在显著的负相关性,关系式为y=-0.016 4x+25.34(r2=0.839 9)。     

Stability comparison of three candidate internal reference genes in Chinese giant salamander (Andrias davidianus)

The Chinese giant salamander (Andrias davidianus) as food and medicinal product has been an important aquaculture object in China. Study of gene function in the Chinese giant salamander requires accurate normalization though the use of appropriate reference genes. In this study, the expression levels of three candidate reference genes including β‐actin, GAPDH and cytb of different tissues, different developmental stages and different challenges in Chinese giant salamander were evaluated by qPCR. The stabilities of these three reference genes were analysed by geNorm, NormFinder and BestKeeper software. The results showed that the expression of GAPDH was more stable than that of β‐actin and cytb in four tissues and at two developmental stages of Chinese giant salamander. Compared with GAPDH and cytb, β‐actin was the most stable in spleen of Chinese giant salamander treated with LPS or GSIV. Therefore, the result showed that GAPDH was the suitable reference gene in different tissues and at different developmental stages of Chinese giant salamander. The β‐actin could be used as a reference gene in spleen of Chinese giant salamander challenged with LPS and GSIV. This study provides convincing information for the GAPDH and β‐actin as suitable reference gene in Chinese giant salamander of different tissues, different developmental stages and different challenges respectively.     

大鲵病毒性疾病最新研究进展

中国大鲵(Andrias davidianus)是我国的特有物种,具有极高的产业开发价值,但病毒性疾病严重危害大鲵人工养殖产业的健康发展。本文对大鲵虹彩病毒的分类地位及主要特征、大鲵虹彩病毒病的病理症状及诊断防治措施几个方面进行了简要概述,以期为大鲵病毒性疾病的深入研究提供科学依据。     

大鲵幼苗饲养增重效果研究

人工养殖大鲵幼苗100尾,分5组每组20尾,饲养时间从稚鲵开食至1龄末,共一年时间。在适宜的饲养环境下,幼鲵体重从出膜的0.27-0.33g经过1年的饲养达24.68～30.42g,1龄净增重达24.41～30.09g,1龄增重率达8826%～9118%。1龄内的幼鲵生长态势极为迅速,增重效果明显。     

三种水生动物细胞系对两株蛙病毒敏感性的比较

利用3个不同物种的水生动物细胞系,包括爪蟾肾细胞系(A6)、大鲵胸腺细胞系(GSTC)和鲤上皮瘤细胞系(EPC),分别用沼泽绿牛蛙蛙病毒(RGV)和大鲵蛙病毒(ADRV)感染,进一步研究细胞病变显微形态、病毒滴度、细胞病变与不同感染时间的相关性等。结果显示,在光镜下可见感染病毒的细胞发生病变,A6和EPC细胞肿胀或破裂;GSTC细胞收缩或聚在一起形成多层。同种水产动物细胞系对不同蛙病毒的敏感性不同,在A6、EPC和GSTC细胞中,RGV的滴度分别为10~(3.6)、10~(5.9)和10~(6.6) TCID_(50)/m L;ADRV的滴度分别为10~(4.3)、10~(5.4)和10~(6.1) TCID_(50)/m L,表明GSTC细胞系对两种蛙病毒都更敏感。研究为后续蛙病毒致病机理提供了有用的信息和重要实验材料。     

大鲵细菌性疾病研究进展

为深入了解和治疗大鲵(Andrias davidianus)细菌性疾病,针对已知的大鲵细菌性疾病的致病病原菌、发病的临床特征及诊断防治措施进行了简单概述,并提出了相应研究展望。     

大鲵蛙病毒感染大鲵的动态病理损伤及病原的组织分布

本研究旨在观察大鲵在大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV)感染过程中组织的动态病理损伤,同时定量检测CGSRV在组织中的动态分布。对大鲵腹腔注射1.0×106.5 TCID50/m L的CGSRV进行人工感染,在感染的0d,3d,5d,7d,9d,13d,16d随机采集3尾,取肝、肾、脾、肺、肠、皮肤、肌肉、脑、心脏和胃等组织,石蜡切片和HE染色对CGSRV感染大鲵的病理损伤过程进行观察,采用SYBR Green q PCR技术对病毒在组织中的动态分布进行定量研究。组织病理结果表明,CGSRV感染导致大鲵多组织器官损伤,其中肝、脾、肾和皮肤肌肉病变严重,为损伤靶器官,且在一些损伤的细胞内见嗜碱性或嗜酸性包涵体。感染后3d肝细胞与肾小管上皮细胞变性,肾间以及肝小叶中央静脉周围淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润;感染后5~7d实质性器官变性、坏死,炎症加重,胃肠道呈卡他性炎。感染后9d表皮细胞坏死、脱落,肌纤维变性、坏死。感染后13~16d肝出现广泛变性、坏死与炎症,脾淋巴细胞数量显著减少,肾小球渗出性-坏死性炎,皮肤肌肉呈出血性坏死性炎和实质性心肌炎。SYBR Green qPCR结果显示,整个感染进程中各组织CGSRV含量呈上升趋势,不同组织中病毒量为2.36×103~1.84×109 copy/mg组织,其中肺、肠、肝、脾、肾和皮肤肌肉含量高,表明CGSRV具有广泛的组织分布特征,但肝、脾、肾、皮肤肌肉为其复制和损伤的靶器官,且病毒分布量与病理损伤程度呈正相关。