福建柏实时荧光定量PCR内参基因的选择

[目的]筛选稳定的内参基因,用于福建柏不同组织部位荧光定量PCR分析.[方法]基于福建柏转录组数据,以福建柏的根、皮和鳞叶为材料,设置5个浓度梯度(0.32、1.6、8、40、200 ng·μL-1)的各组织cDNA混样作为模板,选择ACT7、UBQ、EF2、CACs、TIP41、UBC2b、RH8、GAPDH 8个基...     

光皮桦实时荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】利用定量PCR和表达分析软件研究候选内参基因在光皮桦不同组织中的表达稳定性,并通过目的基因的表达分析验证其可靠性,以获得可用于光皮桦定量PCR的稳定内参基因。【方法】选取16个常用的看家基因作为候选内参基因,设计引物,通过普通PCR、溶解曲线及琼脂糖凝胶电泳验证引物的特异性;通过实时荧光定量PCR及软件ge Norm、Norm Finder和Best Keeper分析候选内参基因在光皮桦16个不同组织中的表达稳定性,根据分析结果筛选出最佳的内参基因和组合,并进一步通过2个目的基因CSLD和KOR对内参基因的稳定性进行验证。【结果】PCR和电泳结果显示,候选内参基因PCR目的片段条带清晰单一,熔解曲线也呈现明显的单一峰,表明这些引物的特异性良好。利用特异引物,对这些候选基因在16个不同组织的表达进行分析,发现除了18S,其他基因的Ct值均集中在25~30之间,表明内参基因在不同组织中表达较稳定,它们之间的表达水平差异不明显。Norm Finder和Best Keeper分析结果均表明基因EF1α的稳定性最好,ge Norm计算得出最稳定的是TATA,而UBi-lp在所有候选内参基因中表达最不稳定。进一步选取3个稳定表达候选基因(EF1α,TATA和UBi4)及稳定性较差的UBi-lp作为内参基因,对2个目的基因CSLD和KOR在不同组织中的相对表达进行分析,结果表明这2个目的基因相对于3个稳定的内参基因显示出一致的相对表达量,而不稳定的内参基因UBi-lp并没有对表达数据进行有效的标准化,结果存在明显偏差。【结论】通过实时荧光定量PCR及综合3种软件分析的结果,在光皮桦不同的组织中,EF1α,TATA和UBi4内参基因的表达稳定性高,对这3个基因进行验证并明确其作为荧光实时定量PCR内参的可靠性。因此,EF1α,TATA和UBi4可作为研究基因在光皮桦不同组织器官中表达的稳定内参。     

杉木实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

目的 筛选适用于杉木不同组织荧光定量PCR分析的稳定内参基因,提高杉木实时荧光定量PCR试验准确性,为杉木体内各个基因表达分析提供合适内参基因。 方法 通过实时荧光定量PCR获取GAPDH、EF1α、18S rRNA、28S rRNA、UBQ、UBC与Actin 7个候选内参基因在杉木无性系的根、茎和叶中的溶解曲线与Ct值;利用软件geNorm、Normfinder和BestKeeper对候选内参基因的表达稳定性进行评价;通过分析2个纤维素合酶基因ClCesA1和ClCesA2在杉木不同组织部位的相对表达情况,对候选内参基因的稳定性进行验证。 结果 geNorm、Normfinder和BestKeeper分析结果均表明：在杉木根和茎中最稳定的内参基因是EF1α和Actin;geNorm、Normfinder结果显示杉木叶中稳定的内参基因是UBQ和EF1α,BestKeeper显示杉木叶中最稳定合适内参基因是EF1α和Actin。以Actin与EF1α作为内参基因,荧光定量PCR分析表明,ClCesA1和ClCesA2基因的相对表达量在杉木不同组织中均有所不同,ClCesA2的相对表达量在各个组织中均高于ClCesA1。以不同内参基因作为试验内参基因分析ClCesA1和ClCesA2的表达情况得到,ClCesA1和ClCesA2在各个组织中的相对表达量排序主要为茎>叶>根。 结论 7个候选内参基因中,杉木不同组织中稳定表达的为Actin与EF1α,适合作为表达分析的内参基因;28S rRNA的表达稳定性低,不适合作为杉木定量PCR分析的理想内参基因。     

一种实时荧光定量PCR方法鉴定野鸟中禽流感病毒方法的建立

为满足高通量快速检测野鸟中禽流感病毒的需要,本研究针对A型流感病毒M基因保守区域设计了一对引物和探针,建立了一种能够检测A型禽流感病毒的实时荧光定量PCR方法,并对该方法的灵敏性、特异性和稳定性进行了评估.结果显示,该方法相较于传统的鸡胚分离和RT-PCR方法,具有灵敏度高、特异性好和耗时短等优点,可用于检测野鸟中携带...     

红豆杉TbAP2基因荧光定量PCR体系的建立及优化

[目的]建立稳定可靠的、适合检测红豆杉(Taxus L.)TbAP2基因表达量的荧光定量PCR实验体系。对于检测该物种中基因的组织特异性表达具有重要意义。[方法]以曼地亚红豆杉细胞为试材,提取总RNA并反转录为cDNA,根据TbAP2基因序列设计多对引物,合成内参基因TBC41的引物,采用正交试验L_9(3~4)方法分别筛选以上2个基因5μL和10μL小反应体系及20μL常用体系中的最佳组合,并通过cDNA模板用量和引物用量等方面进行优化,以确保基因扩增效率在90%～105%之间。[结果]本研究建立了TBC41和TbAP2基因在5、10、20μL体系下的荧光定量最佳PCR反应体系,在优化后的5μL体系下,加入Mix(2×) Universal 2.5μL,cDNA模板1.0μL,正反引物共1.5μL,内参基因TBC41和目的基因TbAP2的扩增效率均为94%;在优化后的10μL下,加入Mix(2×) Universal 5μL,cDNA模板1.2μL,正反引物共1.3μL,TBC41和TbAP2的扩增效率分别为95%和94%。在优化后的20μL下,加入Mix(2×) Universal 10μL,cDNA模板0.5μL,正反引物共1.5μL,TBC41和TbAP2的扩增效率分别为93%和99%,以上各扩增体系回归系数R~2均大于0.980。[结论]在以上3种反应体系下,内参基因和目的基因均具有接近100%的扩增效率,表明本研究成功建立了适合检测红豆杉TbAP2基因表达量的荧光定量PCR实验体系,并为红豆杉其它基因的表达研究提供参考。     

海州常山叶片实时荧光定量PCR的内参基因选择

目的 通过实时PCR（qRT-PCR）筛选海州常山叶片不同非生物胁迫条件下稳定的内参基因。 方法 利用已有的转录组数据,筛选出17个候选内参基因,在不同非生物胁迫（盐害、干旱和热害）下进行qRT-PCR,通过利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper及ReFinder软件分析筛选不同胁迫中最适的内参基因,选择CtNHX1基因,验证所筛选的内参基因的稳定性。 结果 RPL、AP-2盐害胁迫下最稳定,MDH、AP-2干旱胁迫下最稳定,UBCE2、ACT热害胁迫下最稳定;综合来看,非生物处理中,AP-2、UBCE2是最稳定的参考基因。 结论 AP-2、UBCE2可作为海州常山叶片非生物胁迫研究中基因定量使用的内参基因,为进一步开展海州常山分子机制研究、耐盐基因的开发利用奠定基础。     

巨龙竹秆形发育过程实时荧光定量PCR内参基因的筛选

[目的]利用荧光定量PCR(q RT-PCR)和表达分析软件筛选适用于巨龙竹秆形发育研究的q RT-PCR的稳定内参基因。[方法]应用常规PCR和q RT-PCR,分析EF-1α、GAPDH、Actin、Tubulin、TIP-41、PP2A共6个内参基因在不同秆形巨龙竹("通直型"和"弯曲型")竹笋3个不同发育时期的表达情况。利用Ge Norm、Norm Finder软件对各内参基因的表达稳定性进行评估;以筛选的内参基因对巨龙竹木质素合成中的PTAL基因的表达量进行定量分析,验证所筛选内参基因的有效性。[结果]PCR和q RT-PCR的结果表明,6个候选内参基因PCR目的片段电泳条带单一,熔解曲线具有明显的单一峰。内参基因Actin、EF-1α、GAPDH的稳定性和相关性表现最佳;以它们为内参,对茎秆发育过程中PTAL基因进行定量分析,结果显示它们均具有高效性。[结论]Actin、EF-1α、GAPDH可以作为巨龙竹秆形发育研究中目的基因定量分析的内参基因。为进一步分析巨龙竹秆形发育过程中关键基因表达量的变化提供研究基础。     

落叶松实时定量PCR内参基因的筛选

本研究针对日本落叶松(Larix kaempferi (Lamb.) Carr.)体细胞胚胎发育过程中原胚团时期到胚胎成熟时期、种子萌发过程、植株幼年生长阶段和成年生长阶段等生长发育过程中的31份材料,应用实时荧光定量PCR(qPCR)技术,分析了12个持家基因(ACT 4、APm、Chc、Gapc、RPL1、RPL2、EF1、EF2、eIF、E3UL、UBQ和UPL2) 在这31份材料中的表达情况。经geNorm和NormFinder两种分析软件对这12个持家基因进行表达稳定性分析,结果表明:APm在不同器官、体细胞胚胎发育和种子萌发过程中表达均最为稳定;EF1 在不同生长年龄植株的顶梢中表达最为稳定;eIF在不同年龄植株的针叶中表达最为稳定。分析结果表明,针对不同的研究材料和发育阶段应选择适合的持家基因做内参基因使用。进行基因表达细微差异研究时,可根据需要使用2个或2个以上内参组合。     

旱柳在Pb、Cd胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选适用于Pb与Cd胁迫下旱柳实时荧光定量PCR的内参基因,应用荧光定量PCR技术分析UBQ1、TUB6、Actin、EF1α、18SRNA、GAPDH、TUA8和UBQ2这8个内参基因在旱柳根部的表达情况。通过Normfinder、ge Norm和Best Keeper3个软件进行综合分析,发现在Pb与Cd胁迫下表达较为稳定的内参基因均为EF1α、GAPDH和Actin,差别是在Pb胁迫下的旱柳根组织中最为稳定的内参基因是EF1α,而在Cd胁迫下的旱柳根组织应最稳定的内参基因为GAPDH。该研究结果可用于旱柳根组织在Pb、Cd胁迫下基因表达的进一步研究。     

角倍总RNA提取方法建立及ACTIN基因片段克隆

角倍总RNA的提取是研究角倍蚜虫瘿形成分子机制的基础.本研究针对其多酚、多糖含量高的特点,从各类试剂盒及常规方法改良中优选出CTAB(异丙醇)沉淀方法,较为简单、经济、有效地提取角倍总RNA,其得率可达60.16 μg·(100 mg)-1.利用该方法提取的RNA,通过RT-PCR克隆肌动蛋白基因ACTIN片段,碱基序列长度为934 bp,编码311个氨基酸,该序列与GenBank中已登录的ACTIN基因序列比对显示与芒果同源性最高,相似性达到95％,与其它肌动蛋白的氨基酸序列同源性达到86％以上.角倍总RNA的提取及看家基因ACTIN的克隆可为盐肤木和其他蚜虫虫瘿的分子克隆及基因表达分析奠定基础.     

刺槐实时定量PCR分析中内参基因的选择

The real-time PCR is an important method for analyzing gene expression levels. Selection of reference genes suitable for calibration of the expression of objective gene according to specific experiment...     

光皮桦总RNA的提取及Actin基因的克隆

以光皮桦(Betula luminifera)的嫩叶为材料,针对光皮桦组织中富含多糖多酚等特点,改进了CTAB法,采用β-巯基乙醇和PVP去除酚类,无水乙醇去除多糖,LiCl沉淀过夜.运用该方法提取得到的RNA,条带整齐、清晰,证明得到的RNA纯度、完整性和产率均较高,蛋白、多糖及酚类等去除较彻底.在此基础上,通过逆转录、PCR和RACE实验从光皮桦中克隆得到Actin基因.     

松材线虫实时PCR检测方法的建立

对南京林业大学开发的松材线虫实时PCR检测方法的操作过程进行了规范化.介绍了检测松材线虫所需要的试剂及使用方法,对仪器的稳定性进行了验证,对检测结果的判读方法进行了规定.规范化的检测方法灵敏度高,特异性强,应用方便.     

盐胁迫下构树DREB转录因子基因表达的实时荧光定量PCR分析

转录因子是指那些专一性地结合于DNA特定序列上、能激活或抑制其他基因转录的蛋白质(王少峡等,2004)。DREB(dehydration responsive element binding protein)转录因子是一种特异性的转录因子,当植物在干旱、低温及盐等逆境胁迫下,DREB转录     

黄脊竹蝗荧光定量PCR内参基因的鉴定与筛选

【目的】基于黄脊竹蝗若虫不同龄、成虫不同性别及不同组织筛选稳定表达的内参基因,为黄脊竹蝗后续转录调控研究提供参考。【方法】依据黄脊竹蝗转录组测序结果,以TUB、RPS27A、RPL10、AK、GAPDH、EF1A、RPS3、Actin和18S rRNA常用的9种昆虫内参基因作为候选,本地Blast后获得碱基序列并设计引物。利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析这9种内参基因的稳定性,筛选出在若虫不同龄、成虫不同性别与不同组织（触角、头、唇须、肌肉组织、精/卵巢）中表达量最为稳定的内参基因。【结果】9种候选内参基因在黄脊竹蝗体内均为首次验证并报道,且与其他昆虫相应基因同源性高（高于70%）,差异值小;9种候选内参基因的引物均具有良好的扩增效率（均在90%～120%）;在所有样品中,18S rRNA表达水平最高（C_t=10.78±2.58,P<0.05）,Actin表达水平差异值最大（C_t=23.55±3.84,P<0.05）。黄脊竹蝗不同龄若虫的内参基因稳定性分析时,3个软件排在前2位的内参基因均为RP...     

慈竹β-tubulin基因片段的克隆及序列分析

利用Trizol一步法提取慈竹幼笋总RNA,运用RT-PCR方法首次在慈竹中克隆到3条β-tubulin基因部分序列,命名为Na-βtub1、Naβ-tub2、Naβ-tub3,长度分别为958bp、958bp和959bp,分别编码318、318和319个氨基酸。核酸和氨基酸的序列比对分析结果表明,慈竹中3条β-tubulin基因核酸和推测的氨基酸序列之间相似性分别为92.46%和98.22%,与禾本科植物水稻、玉米、小麦的β-tubulin基因核酸和氨基酸序列相似性分别在89%和95%以上。     

油桐LEAFY同源基因片段的克隆与分析

根据不同植物LEAFY（LFY）同源基因序列的保守区,设计合成1对简并引物,利用该引物通过PCR技术从油桐基因组DNA中分离出1条长约1050bp的LFY同源基因（TUNGlfy）片段,克隆到pMD18-T载体,以期为进一步研究LFY基因表达特性及其与油桐成花生物学的关系打下基础.进行测序和生物信息学分析的结果表明,该片段长1059bp,在中间有1个长639bp的内含子,前面的外显子长294bp,后面的长126bp,共编码135个氨基酸,拼接位点与其它植物的LFY同源基因一致;其推导蛋白质序列与其它植物LFY同源基因的相似性为88%～97%,其中与毛白杨的相似性最高,达到了97%,推测它们具有相似的功能.     

漆酶高产菌株筛选及漆酶基因片段的克隆

研究利用不同底物浓度、不同培养时间、不同培养基为优化因素,对漆酶产生菌株筛选条件进行了初步研究,从广泛4株食用真菌中筛选具有高产漆酶特性的真菌,双孢菇2796,并以双孢菇2796为供体菌,提取菌株RNA,运用RT-PCR方法对漆酶基因进行扩增,克隆后得到长度为160bp的漆酶基因片段。     

刺苋和苋属的实时荧光PCR鉴定

基于叶绿体的Psb A基因(Genbank登录号:DQ006133.1),设计了ASP-1和ASP-2两组具有刺苋特异性的引物探针,对苋科Amaranthaceae苋属Amaranthus刺苋A.spinosus的9个不同地理种、长芒苋A.palmeri的2个不同地理种、其它5种苋属植物和苋科非苋属8种,以及苋科外植物3种共27个样品进行Taq Man实时荧光PCR鉴定。结果表明,ASP-1适合作为刺苋的实时荧光PCR鉴定引物,其最佳扩增温度62℃;ASP-2适合作为苋属的实时荧光PCR鉴定,其最佳扩增温度为60℃。首次建立了Taq Man探针实时荧光PCR快速鉴定刺苋和苋属植物的方法。在优化后的检测条件下,ASP-1的检测灵敏度可达到0.03 ng·μL~(-1);ASP-2的检测灵敏度则可达到0.01 ng·μL~(-1)。上述方法作为形态鉴定的辅助方法,可准确有效的对刺苋及苋属植物进行鉴定。