牛呼吸道合胞体病毒的分离鉴定

从黑龙江省某牛场患有呼吸道疾病的病牛鼻汁中分离到1株病毒,并对其进行了系统鉴定.结果该病毒株能在Vero细胞上增殖并产生特征性的合胞体形态的细胞病变;病毒对5-碘脱氧尿核苷不敏感,对酸、氯仿、乙醚均敏感,不耐热,56℃加热30 min可被灭活,且无血凝性和血吸附特性;该病毒能被牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)标准阳性血清中和;应用特异性引物,通过反转录-聚合酶链式反应可从病毒细胞培养物中扩增出BRSV N基因中596 bp的特异性片段,并且分离株与GenBank中BRSV毒株N基因相应片段的核苷酸序列同源性为97.8%～99.3%.以上结果表明所分离到的病毒为牛呼吸道合胞体病毒,命名为BRSV HJ株.     

从吉林省肉牛场新发疫病分离出E种肠道病毒

从吉林省某牛场发生的临床上以发热、咳嗽、呼吸困难、严重腹泻、高发病率和死亡率为特征的新发疫病病牛体内分离到大小为20³0nm和15030nm和150²50nm的2株病毒。病毒生物学特性、理化学特性和分子生物学特性显示,20250nm的2株病毒。病毒生物学特性、理化学特性和分子生物学特性显示,20³0nm的病毒粒子为牛肠道病毒。该病毒命名为HY12毒株。病毒5′端非编码区的核苷酸序列分析结果表明,HY12毒株与国外分离株SL305的同源性最高,为90%;而与国内分离毒株的同源性只有75%。系统进化树分析发现,HY12毒株属于肠道病毒属的E种肠道病毒。本研究首次在国内从临床表现为呼吸道和消化道症状的病牛体内分离出E种肠道病毒,该结果将为牛肠道病毒感染的诊断及防治提供依据。     

伪狂犬病病毒FJSW的分离鉴定及gG基因序列分析

从福建省某规模化猪场的患猪中分离到一株疑似猪伪狂犬病病毒,命名为FJSW株,对其进行PCR鉴定、gG基因测序等鉴定,并与GenBank上发表的国内外毒株进行序列分析和遗传进化分析.结果 显示,病毒经Vero细胞培养可产生典型细胞病变.该毒株gG基因核苷酸序列与国内分离毒株的同源性为99.7％～100.0％,与国外分离毒...     

IBRV内蒙古分离株NM06gE基因的克隆与序列分析

参考GenBank发表的牛疱疹病毒Ⅰ型全基因序列设计gE基因PCR扩增引物,以牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株NM06提取的DNA为模板,运用PCR的方法扩增gE基因,扩增产物经克隆、序列测定和拼接,结果表明:测定序列全长为2086 bp,包含gE基因1793 bp,其中有1728 bp组成的完整开放阅读框,编码576个氨基酸.将NM06株gE基因序列与GenBank发表的参考毒株核苷酸序列相比,与4株BHV-1病毒的同源性在99.3%～99.9%;与2株BHV-1.1型分离株同源性高达99.5%、99.6%;与BHV-1.2型分离株同源性为93.4%.从进化树中也可以看出:NM06株与BHV-1.1型分离株属于同一个进化分支,而BHV-1.2 BH83株属于另一个进化分支,可以推测IBRV NM06分离株属于BHV-1.1型.NM06株与牛疱疹病毒5型N569病毒的同源性为82.9%,与鹿疱疹病毒2型Norway4病毒的同源性为72.6%.     

肉牛溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为探究四川省某肉牛养殖场从外地引种的西门塔尔牛出现体温升高、咳嗽和呼吸困难等症状的病原,本实验采集24份病牛鼻腔棉拭子,随机挑取10份进行细菌的培养、分离鉴定以及分离菌株的耐药性分析;同时采用特异性检测溶血性曼氏杆菌的PCR方法对全部病牛鼻腔棉拭子进行检测。结果显示,从10份病牛鼻腔棉拭子中分离鉴定出10株溶血性曼氏杆菌,分型PCR方法结果显示其中8株为荚膜血清6型,其余2株未定型;药敏试验结果显示,溶血性曼氏杆菌分离株对大多数氟喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类药物敏感,对部分β-内酰胺类和酰胺醇类药物耐药;特异性检测溶血性曼氏杆菌的PCR方法从24份鼻腔棉拭子中检测出23份阳性样品,表明该群病牛溶血性曼氏杆菌的感染率很高。本研究为该牛场的呼吸道病的防控提供了参考。     

一株c基因型牛副流感病毒3型病毒的分离鉴定

从黑龙江省某牛场当中患有呼吸系统疾病的病牛鼻拭子中分离到一株病毒,该病毒在MDBK细胞上能够产生典型的病变。经免疫荧光鉴定表明成功分离到一株牛副流感病毒3型,命名为HLJ1。将病毒的M基因与GenBank中已发表BPIV3毒株的M基因进行同源性比较及系统进化分析,结果表明HLJ1与BPIV3c型参考毒株NX49的同源性最高为99.7%,因此HLJ1分离株属于c基因型BPIV3。我们的结果将为牛副流感病毒3型检测试剂盒及疫苗的研发工作奠定基础。     

犬瘟热病毒山东株的分离及N蛋白基因的克隆与序列分析

本试验采用Vero细胞从临床疑似患犬瘟热的犬组织病料中分离出一株病毒,通过观察细胞病变,提取细胞培养物RNA并扩增克隆分析N蛋白基因部分序列进行了鉴定。结果表明,该毒株接种于Vero细胞后,出现了典型的细胞病变;对接种病料后的Vero细胞培养物提取总RNA进行RT-PCR扩增,得到了287 bp的目的片段;序列分析表明该分离株与犬瘟热病毒弱毒(Onderstepoort和Snyder Hill)的同源性为95.5%~96.9%,与标准强毒株(A75/17和2544/Han95)及野毒株(XJ-4、ZJ7、98-2646等)的同源性较高,为97.2%~99.0%,证明该毒株为犬瘟热病毒野毒株,命名为QD10。     

牛呼吸道疾病混合感染的病例诊断

牛呼吸道疾病综合征是危害全球养牛业发展的一类重要疾病,具有很高的发病率和死亡率。2017年3月黑龙江某牛场牛只突然出现精神沉郁、厌食、咳嗽、呼吸困难等症状,采集病牛鼻拭子,提取DNA或RNA,通过RT-PCR、PCR技术进行牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛腺病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛支原体的病原学检测。通过实验室检测确诊该牛场患病牛只为牛副流感3型病毒和牛支原体混合感染,因此建议牛场应及时对病牛进行对症治疗并做好未发病牛的防护工作。     

牛病毒性腹泻病毒LJ36/14的分离与鉴定

为确定牛呼吸道传染病的病原,本研究对2014年从黑龙江省发生牛呼吸道传染病的某肉牛场采集的40份鼻拭子进行了病毒分离,结果分离到一株牛病毒性腹泻病毒(BVDV),命名为LJ36/14株。病毒鉴定结果表明,分离株在单层MDBK细胞中不产生细胞病变;利用BVDV p80蛋白的单克隆抗体(MAb)进行的间接免疫荧光试验表明接种LJ36/14株的细胞结果显示阳性。分离株的TCID_(50)为10~(5.9)/0.1 mL。对该分离株的5'端非编码区(5'UTR)和Npro基因进化树分析表明该分离株为国内首次分离并鉴定的基因亚型,即BVDV1v亚型。本研究为了解BVDV地理分布和流行情况及BVDV疫苗的制发奠定了基础。     

一株3型牛腺病毒的分离与鉴定

本研究于2009年由患急性呼吸道疾病牛的鼻拭子中分离获得一株病毒,经形态特征、血清学试验及PCR鉴定表明,该病毒与牛腺病毒3型(BAV-3)相似。对其E2A基因进行序列测定,并与GenBank中登录的BAV1型、3型、4型及人、绵羊、鼠等其它种属来源的腺病毒E2A基因序列进行比对及系统进化分析,结果显示该分离株与BAV-3的同源性为95.5%。经MEGA4软件分析,分离株与BAV-3验证值为100,表明其为BAV-3,并命名为BAV-3HLJ0955株。对该分离株热敏感试验表明,BAV-3 HLJ0955在56℃ 30min可被完全灭活,属于BAV第一群。这是国内首次分离获得BAV-3的报道。     

猪伪狂犬病病毒ZY-2014株的分离与鉴定

从河南省某规模化猪场的死亡仔猪中分离到1株疑似猪伪狂犬病病毒,命名为ZY-2014株,并对其进行了PCR鉴定、g E基因序列分析、动物感染试验等鉴定。病毒经vero细胞培养可产生典型细胞病变,用Reed-Muench法测定病毒的滴度为107.4TCID50/100μL。分离病毒基因组DNA经过g D、g E、g G、三对特异性检测引物扩增后,均出现伪狂犬病毒特异性目的条带,分别为217 bp、636 bp、1440 bp。测序结果与预期结果相符。将ZY-2014毒株g E基因测序结果与10个新分离毒株、14个经典毒株进行同源性比对分析,其核苷酸及推导的氨基酸序列与国内2012年以来新分离毒株的同源性分别为99.6%~100%和99.1%~100%,与2012年以前分离毒株核苷酸及推导的氨基酸序列的同源性分别为97.7%~99.6%和95.7%~99.3%。遗传进化树结果显示,所分离的ZY-2014毒株与2012年以来新分离毒株同属一分支,与经典毒株分属不同进化分支。动物攻毒试验中,家兔和小鼠均出现明显的伪狂犬病临床症状。鉴定试验表明,分离株ZY-2014是一株猪伪狂犬变异毒株。     

一株鸽源新城疫病毒的分离鉴定

从广东发病鸽群中采集的拭子样本中分离到1株新城疫病毒,用聚合酶链反应(PCR)、血凝抑制试验(HI)及基因测序等对其进行鉴定。结果表明,此分离株具有血凝活性,且可与新城疫病毒标准阳性血清发生特异性抑制反应;用针对新城疫病毒的F基因及P基因特异性鉴定引物对该分离株进行PCR扩增,可扩增出特异性目的片段;测序及BLAST分析表明,其与美国新城疫病毒分离株Pigeon/US(TX)/98的F基因核苷酸序列相似性高达97%以上。毒株被鉴定为鸽源新城疫病毒,并命名为Pigeon/Guangdong/ZQ-17。     

新疆南疆牛冠状病毒BCV-Aks-01株分离及基因型鉴定

将疑似感染牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)病死犊牛的粪便样品,滤菌处理后接种于HCT-8细胞,盲传数代,出现细胞病变后收获细胞液。提取病毒RNA,依据NCBI登录的牛冠状病毒高度保守N基因设计1对特异性引物,对N基因进行RT-PCR扩增、测序及序列分析。结果显示,BCV-Aks-01毒株与牛冠状病毒参考株N基因核苷酸同源性为97.5%~98.6%,同BCoV参考毒株Mebus同源性为97.8%,N基因遗传进化树表明,BCV-Aks-01毒株与BCoV参考株亲缘关系较近,处于遗传进化树中同一分支上,属于冠状病毒Betacoronavirus,证实该分离株为牛冠状病毒。     

光生物素核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒的研究

用光生物素标记牛传染鼻气管炎病毒(IBRV)基因的9.6kb片段制成探针,能检出10pg的IBRV—DNA,1个TCID_(50)量的病毒和1个TCID_(50)掺毒量的精液,与其它病毒无交叉反应。检测人工感染牛的鼻、眼拭子和病毒分离符合率为84.4％,检测感染细胞与细胞病变符合率达81.7%,两项综合符合率为82.5%,以病毒分离为标准,核酸探针检测的鼻眼拭子特异性为90.9%,灵敏度为71.4%。鼻眼拭子经一代细胞培养增毒后再用核酸探针检测,与病毒分离的符合率达93.8%,特异性和灵敏度均达92.9%。 牛传染性鼻气管炎是由IBRV引起的牛呼吸道炎症、生殖道感染、结膜炎、脑膜脑炎等症状的疾病。此病的诊断通常采用中和试验、ELISA等方法检查感染动物的血清抗体以及病毒分离检测病原。只要病料新鲜,分离病毒并不困难,但从牛精液中分离IBRV,由于精液对细胞有毒性影响,有时不一定能成功。用核酸探针检测病毒基因是一种快速、灵敏、简便的方法,我们采用光生物素标记IBRV基因的9.6kb片段作探针,对IBRV掺毒精液及人工感染牛的鼻、眼拭子进行检测,并与病毒分离进行比较,结果表明核酸探针具有较高的特异性和灵敏度,与病毒分离符合率在8(?)%以上,可与病毒分离互相补充作为病原检测的一种手段。     

牛肠道病毒的分离鉴定

本研究从内蒙古某奶牛场的犊牛粪便样品中分离的一株牛肠道病毒(BEV),命名为BHM26,通过电镜观察显示和分子生物学鉴定,发现病毒粒子在细胞浆中呈结晶状排列,单一病毒粒子呈典型小RNA病毒粒子形态,直径为25nm～30nm,无囊膜;病毒的部分3D蛋白编码区和全长3'UTR区段的1 026bpDNA片段的RT-PCR扩增和序列分析表明,其核苷酸序列与GenBank登录的参考病毒株核苷酸序列同源性为71.9%～87%,其中与BEV Wye-3A株同源性最高,为87%.分析表明中国BEV分离株与国外参考毒株具有较大差异.     

鸭新城疫病毒山东分离株的生物学特性与F基因遗传进化分析

从山东规模化鸭场采集棉拭子样品并接种SPF鸡胚分离鉴定NDV,通过测定鸡胚平均致死时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致死指数(ICPI)来确定分离株的毒力,采用RT-PCR方法对分离株F基因进行测序并进行遗传进化分析。结果显示,从正常鸭群棉拭子中分离到4株NDV,F蛋白裂解位点的氨基酸序列表明4个分离株中2株氨基酸序列为112 ERQERL117,1株为112 GKQGRL117,符合弱毒株序列特征;1个分离株为112 RRQKRL117,符合强毒株序列特征。系统进化分析表明,其中2株属于ClassⅠ分支、2株属于ClassⅡ分支,ClassⅡ分支中的2个分离株1个为基因Ⅶ型强毒株,1个属于基因Ⅰ型弱毒株,与Queensland V4等毒株的同源性较高。     

牛分枝杆菌广西分离株MPB70基因的克隆及序列分析

利用牛分枝杆菌MPB70基因特异性引物,以2株牛分枝杆菌广西分离株的染色体DNA为模板,扩增MPB70基因,产物经纯化后与载体PMD18-T连接,然后转化至大肠杆菌DH5α。提取转染后大肠杆菌的质粒进行双酶切和PCR鉴定,鉴定为阳性的质粒进行序列测定。测序后通过序列分析软件DNAstar MegAlign对MPB70基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,并与GenBank上已发表的8株牛分枝杆菌的MPB70基因参考序列进行比较。结果显示广西分离株mt359、mt370与已发表的7株参考株序列比较,其核苷酸序列和氨基酸同源性在77.4%~95.9%之间。这一结果表明广西奶水牛分枝杆菌分离株与参考的其他牛分枝杆菌毒株的MPB70基因没有太大的差异,说明牛分枝杆菌分泌蛋白MPB70基因十分保守,从而为检测跟踪毒株的变异,研制牛分枝杆菌亚单位疫苗提供基础。     

一株牛肠道病毒的分离与鉴定

本研究从山西某奶牛场的泌乳奶牛粪便样品中分离得到一株牛肠道病毒(BEV),命名为HLJ-3531/2013。理化特性鉴定结果表明,该病毒粒子呈典型小RNA病毒粒子形态,直径为25~30nm,无囊膜;该病毒在p H3~9时稳定,对氯仿、乙醚、胰酶等均有一定的抗性,但50℃可迅速被破坏,1mol/L Mg SO4能显著提高该病毒对热的抵抗力。采用随机引物通过RT-PCR扩增获得病毒部分VP2及VP4蛋白编码区的DNA片段,序列分析结果表明,其核苷酸序列与Gen Bank登录的参考病毒株核苷酸序列同源性为65.0%~79.2%,其中与德国分离株D3/98株同源性最高,为79.2%。进化树分析其可能为EV-E种群中新的基因型。此前中国已分离得到的三株牛肠道病毒均为EV-F,该病毒株与中国已分离株分属于不同的血清型。     

牛病毒性腹泻病毒LN-1株的分离鉴定及基因组序列分析

【目的】查明并掌握辽宁地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)的流行特性及生物学特点,为BVDV的防治提供理论基础和技术支持。【方法】采集辽宁省某养牛场疑似发生BVDV感染的病死牛脾脏组织,用牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)及BVDV基因特异性引物进行RT-PCR鉴定,将组织液接种MDBK细胞分离病毒。对细胞进行细胞病变效应(CPE)观察后再通过电镜观察、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定病毒,PCR扩增病毒全基因组序列并对其进行遗传进化分析。【结果】BVDV特异性引物RT-PCR鉴定结果为阳性,在280 bp处有条带,与预期条带大小相符,其余病原特异性引物未扩增出条带,证明未感染其他病原;分离得到的毒株在MDBK细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒纯化后,...     

犬瘟热病毒蓝狐株的分离鉴定

为了对狐犬瘟热的防治提供参考依据,试验通过观察接种分离病毒细胞的细胞病变(CPE)情况,结合反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、核苷酸序列同源性分析对从疑似犬瘟热死亡的蓝狐脾脏中分离出的病毒进行了鉴定。结果表明:该毒株可使培养细胞出现明显的细胞病变。提取感染细胞的总RNA进行RT-PCR,扩增出1 044 bp的融合蛋白基因片段,大小与预期值相符;分离毒株与GenBank中已发表的10株犬瘟热毒株核苷酸序列同源性为92.9%～97.1%,氨基酸序列同源性为96.3%～97.7%。说明分离株为犬瘟热病毒。