家蚕杆状病毒载体构建及外源基因的表达

本文介绍了杆状病毒载体构建方法,分析了影响外源基因表达效率的因素,概述了近年来家蚕杆状病毒栽体在蚕体内表达外源基因产物所取得的成绩,并指出了这一系统存在的问题,提出了改进意见.     

表达3个外源基因真核表达载体的构建

为构建可以同时表达3个外源基因的真核表达载体,本实验以pCAGGs载体为骨架,引入SV40启动子及单疱疹病毒(HSV)TK基因的polyA序列,并且在β-actin启动子下游插入内部核糖体进入位点序列(IRES),构建了能够同时表达3个外源基因的真核表达质粒pCAGGs-IRES.本研究将PR8流感病毒的M基因、绿色荧光蛋白基因EGFP及H1N1猪流感病毒的HA基因,分别克隆于pCAGGs-IRES载体的3个启动子下游,转染细胞后,通过间接免疫荧光和western blot表明本实验构建的pCAGGs-IRES载体能同时表达3个外源基因.该载体有望为基因疫苗、基因操作及蛋白质相互作用等研究提供新的真核表达载体.     

精子作为外源基因载体的转基因方法研究进展

以精子为载体的转基因动物制作方法巳引起众多研究者的关注与青睐。近年来此法的研究巳取得较大进展，并在多种动物上获得成功。随着对精子载体法的深入研究，外源DNA与精子结合的方法也不断改进。作者就精子与外源DNA体内、体外的结合方法作一综述。     

原核表达PRRSV结构蛋白构建活载体疫苗的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的持续性感染和潜在的免疫抑制现象已成为困扰当前世界养猪业健康发展的主要问题之一。目前国内外学者成功地克隆了PRRSV三种主要结构蛋白——GP5、ORF6、ORF7的基因序列,并采用原核表达载体成功地进行了表达,构建了活载体基因工程苗,经体外试验检测该重组蛋白具有良好的生物活性。     

预防PRRSV的载体疫苗的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是影响世界养猪业的一种传染病的病原体,该病毒对养猪业造成巨大的经济损失。然而商品化疫苗在预防该病毒感染方面效果却不显著,PRRSV弱毒苗还存在散毒和返强的危险性,因此寻找一种新的有效的疫苗势在必行。     

外源基因在减毒沙门氏菌载体中的遗传稳定性和表达

减毒沙门氏菌接种机体后,能够诱导自身及所携带的外源基因免疫,是具有前景的重组疫苗。文章简要介绍了减毒沙门氏菌菌株及外源抗原基因表达产物的免疫应答,重点讨论了提高外源基因在沙门氏菌中的稳定性和表达量这两方面问题。     

基因工程乳酸菌作为活载体表达外源蛋白及疾病防治研究进展

<正>乳酸菌是一类可以发酵碳水化合物产生乳酸的兼性厌氧菌总称,包括乳球菌、乳杆菌、链球菌、片球菌和双歧杆菌等,美国食品和药品监督管理局(FDA)将许多乳酸菌定义为食品级微生物,极少数如化脓性链球菌,肺炎链球菌是致病菌。乳酸菌可以调节肠道菌群组成从而维持肠道稳态,提高免疫力;还可竞争型地占位,定殖在肠道表面诱导黏膜液以及肠道上皮细胞抗菌肽(AMP)的产生[1];在治疗消化系统疾病(病毒性及细菌性腹泻)、炎症性肠病(IBD)和自身免疫性疾病中     

宿主域扩大的重组救活昆虫杆状病毒表达载体的构建及外源基因的表达

通过克隆的家蚕核多角体病毒解旋酶基因DNA与重组救活可线性化的苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒 (BacPAK6 )DNA在昆虫细胞中发生重组 ,经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf 2 1的宿主域扩大的昆虫杆状病毒表达载体 (HyBacPAK6 )。HyBacPAK6DNA经Bsu36Ⅰ酶切后与含植酸酶基因的转移载体pVL1393 phy在家蚕细胞中重组后 ,通过蓝白斑筛选发现重组率可达 90 %以上。然而以杂交病毒为载体的外源基因表达量仅为以BmNPV为载体病毒的表达量的 2 0 %左右。分析认为HyBacPAK6可用于表达一些对蚕体有害的外源基因。     

PCV-2 ORF2和PRRSV ORF5基因的扩增与双基因真核表达载体的构建

根据GenBank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因序列,分别设计一对引物,应用PCR和RT-PCR扩增出PCV-2 ORF2基因和PRRSV ORF5基因。将PCR产物ORF2经Nhe Ⅰ／EcoRⅠ双酶切回收后插入真核表达载体pIRES得到pIRES-ORF2,RT-PCR产物ORF5经NotⅠ／XbaⅠ双酶切回收后插入pIRES-ORF2构建重组质粒pIRES-ORF2／ORF5。对此质粒中的插入片段,进行PCRRT-PCR及双酶切鉴定,同时对插入序列进行测序分析,表明SD1株ORF2与国内多种毒株的同源性为99％,pIRES-ORF2ORF5转移载体ORF5基因的核苷酸推导氨基酸与北美洲原型（VR-2332株）氨基酸同源性为99％。此重组表达载体的成功构建,为进一步研究PCV-2ORF2及PRRSV ORF5编码蛋白的生物学活性及研究猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二联核酸疫苗奠定了基础。     

腺病毒表达载体研究进展

基因治疗和基因免疫技术已成为解决生物学领域问题的重要手段之一,多种治疗因子的设计、研发和应用,促进了更多高效转移载体的发展.腺病毒载体由于宿主范围广泛和对人体的低致病性、病毒颗粒比较稳定、基因组较少发生重排等优点,已经成为最常用的病毒载体之一.但由于细胞的靶向性和宿主的免疫反应限制了腺病毒载体的应用和发展,针对这种情况,对腺病毒载体进行了不断改进和完善,其潜在的应用价值也得到了广泛关注.文章综述了腺病毒载体的性质、研发过程及应用前景,为进一步优化和利用腺病毒表达载体提供参考.     

PRRSV GP5多表位融合基因的生物信息学分析及真核表达载体的构建

为构建一种安全、有效的猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)多表位基因融合疫苗,通过对5株美洲型猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)毒株JL580、HENAN、VR2332、NADC30、JXA1的GP5蛋白序列进行同源性分析,并对其保守区进行T细胞和B细胞表位预测;将预测获得的序列进行连接、重组得到GP5多表位融合基因(GP5 recombinant epitopes sequence,GRE),利用生物信息学软件分析GRE序列的二级结构、亲水性及跨膜区;分别将GP5和GRE基因构建至真核表达载体pEGFP-N1,并将上述构建成功的无内毒素重组质粒转染至Marc145细胞,RT-PCR分析其表达情况,CCK-8检测其对细胞增殖率的影响。结果显示,GRE序列二级结构较稳定,亲水性较好,存在2个跨膜区域;分别获得了真核表达载体pEGFP-GP5和pEGFP-GRE,且RT-PCR证明重组质粒在Marc145细胞中能够转录目的基因;经CCK-8检测,重组质粒对真核细胞的增殖无显著性影响。结果表明,试验成功组建GRE序列并构建了其真核表达载体,且GP5和GRE的表达对真核细胞均无明显毒性作用。本试验为PRRS多表位疫苗的研制奠定了基础。     

PRRSV SD-1株ORF7基因的克隆、测序及原核表达载体的构建

参照PRRSV ATCC VR2332株基因序列设计1对引物P1、P2,经RT-PCR扩增出PRRSV SD-1株ORF7基因,经与PMD18-T Vector连接后筛选出阳性克隆株测序。把PRRSV SD-1株ORF7 cDNA亚克隆到PQE上构建PQE-N原核重组表达载体。结果表明,PRRSV SD-1株ORF7核甘酸序列与PRRSV ATCC VR2332株ORF7核甘酸序列完全一致,与欧洲株LV符合率为58%。成功构建原核表达载体PQE-N,为N蛋白的研究和制备诊断性抗原奠定了基础。     

以导学案为载体的教学模式研究进展

本文通过对国内外有关文献的研究分析发现,关于对导学案教学模式的研究目前存在着以下问题:理论研究相对较多,结合具体学科的学案导学教学模式研究较少,多数只是研究了导学案教学模式的理论基础、设计原则、操作程序,总结导学案教学的经验、分析存在的不足和问题等,而没有涉及导学案教学模式下具体的教学问题,比如这一模式下的心血管系统用药的教学,几乎没有人研究。而真正应用好导学案上好课,我认为针对某一学科具体教学内容的导学案的设计内容及学材的重编排质量等环节才是关键,而这方面的研究恰恰是目前所缺乏的。     

外源基因导入蚕体的研究进展

家蚕(Bombyx mori.L.)是以中国为发祥地(田村俊树,1994;吕鸿声,1992)向世界传播的昆虫。长期以来家蚕既是一种重要的经济昆虫,又是生物科学研究的模式昆虫之一。随着分子生物学与基因工程的发展,生物技术开始渗透到各个学科,蚕业科学这一领域也不例外。由于转基因     

甲醇酵母表达外源蛋白研究进展

甲醇酵母是一种近年来广泛使用的基因表达系统,它具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等优点。本文综述了甲醇酵母表达系统的特点及外源蛋白如何在甲醇酵母表达系统中提高表达量的方法。     

PRRSV核衣壳蛋白基因在杆状病毒中的表达

根据已发表的猪生殖 -呼吸道综合征病毒 ( PRRSV) CH-1 a分离株核衣壳 ( N)蛋白基因核苷酸序列和杆状病毒转移载体 p Blue-Bac-His B多角体蛋白阅读框架 ,设计合成了 1对特异性引物 P7S1 /P7R1。应用PCR对重组质粒 p UC1 8-ORF7扩增 ,获得了 CH-1 a株 N基因的片段。经 Hind 和 Bgl 双酶切 ,将其定向克隆到同样双酶切的 p Blue-Bac-His B的 PH启动子下游 ,获得转移载体 p Blue-Bac-His B-ORF7。将转移载体p Blue-Bac His B-ORF7与苜蓿银蚊夜蛾多核型多角体病毒 ( Ac MNPV,简称杆状病毒 )线性化 DNA ( Bac-N-Blue TMDNA)共转染 Sf9细胞 ,经过蓝斑筛选和蚀斑纯化 ,获得重组病毒 r Bac7。经用引物 P7S1 /P7R1和杆状病毒多角体蛋白基因通用引物 PCR鉴定 ,证明目的基因已插入到杆状病毒中。将重组病毒接种于对数生长期的 Sf9细胞 ,分别于感染后 2 4、4 8、72、96、1 2 0 h收集感染细胞 ,经 SDS-PAGE和 Western blot分析 ,结果表明 ,细胞接种重组病毒 2 4 h即开始表达重组蛋白 ,至 96h达到峰值 ,占整个细胞蛋白的 8.4 % ,此后开始下降。表达产物为融合蛋白 ,大小约 2 0 0 0 0。将重组病毒感染的 Sf9细胞用抗 PRRSV N蛋白的单克隆抗体SDOW-1 7进行间接免疫荧光试验 ,结果在细胞浆和细胞核中观察到了特异性的亮绿     

PRRSV GP5基因的原核表达及其免疫性分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的糖蛋白GP5含有中和表位,是检测用抗原和亚单位疫苗的首选蛋白。本研究将糖蛋白GP5基因截短后,克隆至表达载体pET-30a,转化大肠埃希菌,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示重组蛋白以包涵体形式得到了表达,每升重组菌可纯化得到目的蛋白87.5mg。Western blot和间接酶联免疫吸附试验分析表明,该蛋白与PRRSV阳性血清具有良好免疫反应性。