过氧化氢和谷胱甘肽对延边黄牛体细胞克隆胚胎氧化损伤的影响

在延边黄牛体细胞克隆胚胎体外培养液中分别添加H2O2和GSH,观察重组胚体外发育情况,探究二者对延边黄牛体细胞克隆胚胎氧化损伤的影响.结果表明:不同时间添加H2O2时0～24 h组卵裂率显著高于其它组(P＜0.05),48 ～72 h组16细胞以上发育率显著低于其它处理组(P＜0.05).不同时间不添加H2O2时48～72 h组16细胞期以上发育率显著高于0～24 h组和24～ 48 h组(P＜0.05),24～48 h组显著高于0 ～24 h组(P＜0.05).不同时间添加GSH时0～24 h组和24 ～ 48 h组卵裂率显著高于对照组、48 ～72 h组和72～96 h组(P＜0.05),对照组16细胞以上发育率显著低于48 ～72 h组和72 ～96 h组(P＜0.05).结论:H2O2对延边黄牛体细胞克隆胚胎发育前期的氧化损伤较大,特别是在48 ～72 h.培养前期添加1 mmol/L的GSH能够有效提高延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育效率,缓解有害应激带来的氧化损伤.     

延边黄牛体细胞克隆激活条件的研究

从激活前恢复时间、激活方式、激活培养时间等3个方面研究延边黄牛体细胞克隆的适宜激活条件.结果表明:延边黄牛体细胞克隆激活的理想条件为激活前恢复培养25~30 min,采用离子霉素(Ionomycin,Ion) 6-Dimethyaminopurin(6-DMAP)激活方式,激活培养4 h.     

延边黄牛体细胞克隆融合条件的研究

以体外成熟培养22-24h的延边黄牛卵母细胞作为受体,颗粒细胞为供核细胞,挤压法去核,注入供体颗粒细胞到卵黄周隙中,甘露醇融合液中施加20μs时长的电脉冲刺激使之融合,复合化学方法激活,从融合前恢复培养时间、融合电场强度、甘露醇浓度等3个方面研究延边黄牛体细胞克隆的适宜融合条件．结果表明,2．5h处理组的融合率（70．9％）显著高于4．0h处理组（58．2％,P〈0．05）,2．5h处理组重组胚的卵裂率（77．9％）显著高于其它4组（P〈O．05）,其它各组间差异不显著（P〉0．05）;融合电场强度1100V／cm处理组的融合率（86．4％）显著高于900V／cm处理组（67．1％）和1200V／cm处理组（75．2％,P〈O．05）,重组胚的卵裂率（84．6％）显著高于900V／cm处理组（69．6％,P〈O．05）,囊胚发育率（26．1％）显著高于900V／cm处理组（10．0％）,1200V／cm处理组（8．0％,P〈O．05）;不同浓度的甘露醇对融合率和重组胚的卵裂率没有明显的影响,但是0．28mol／L组囊胚发育率（25．3％）显著高于0．25mol／L组（15．3％,P〈0．05）．因此,适合延边黄牛体细胞克隆的融合条件为融合前恢复培养2．5h,0．28mol／L甘露醇作为融合液,电场强度1100V／cm．     

精氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,试验研究了在体外培养液中添加不同浓度的精氨酸对重组胚发育的影响。选择形态良好排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核操作,然后开始融合、激活,最后在添加不同浓度(0、0.061、0.132、0.264mmol/L)精氨酸的培养液中培养。结果发现,对照组与处理组之间重组胚的卵裂率和8-16C的发育率差异不显著,而囊胚的发育上,0.061mmol/L处理组显著高于对照组。表明体外培养液中添加精氨酸后能够促进体细胞克隆重组胚的发育。     

谷氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,试验研究了在培养液中添加一定浓度的谷氨酸对延边黄牛克隆重组胚发育的影响。选择成熟了20～22 h并且排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核,然后进行体外培养,观察卵母细胞的卵裂以及囊胚发育情况。结果显示,低浓度的谷氨酸能够提高重组胚的卵裂率,高浓度则抑制卵母细胞的卵裂;而囊胚的发育方面,低浓度的谷氨酸会降低其发育率。所以,添加适量浓度的谷氨酸能够提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率。     

牛磺酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

研究了体外培养液中添加不同浓度的牛磺酸对重组胚发育率的影响。试验中设计了4个牛磺酸浓度组,分别是0、7.0、14.0、21.0 mmol/L。各浓度组之间的卵裂率没有差异,其中低浓度组7.0 mmol/L的囊胚发育率较其他组高,随着浓度的上升囊胚发育率逐渐降低。体外培养液中添加牛磺酸的最佳浓度为7.0 mmol/L,能够显著提高延边黄牛体细胞克隆牛重组胚的发育率。     

延边黄牛体细胞克隆囊胚中总基因组RNA的提取

以延边黄牛体细胞克隆囊胚为试验材料,采用试剂盒GMS12106的使用方法提取试材的总基因组RNA,在琼脂糖凝胶电泳检测后,得到最适的囊胚数为5个。通过试验发现,生殖细胞的特殊生理结构限制了RNA提取的效果。为提取完整、纯度高的RNA,采用链蛋白酶对囊胚的透明带进行了消化处理,最终得出链蛋白酶处理的最适时间为10min,提取的RNA质量好,可为后续试验奠定基础。     

谷氨酰胺对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚发育率,研究了在体外培养液中添加不同浓度的谷氨酰胺对克隆重组胚发育率的影响.试验中选择成熟培养20～22 h的卵母细胞,脱颗粒细胞后选择排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核操作,然后将融合、激活后的卵母细胞在添加不同浓度谷氨酰胺的体外培养液中进行培养.结果显示,体外培养液中添加浓度为1....     

延边黄牛体细胞克隆囊胚染色体标本制备的研究

[目的]探讨适合延边黄牛体细胞克隆胚胎染色体标本制备的方法。[方法]利用延边黄牛体细胞克隆产生的囊胚制备染色体标本,采用传统的细胞遗传学方法,将延边黄牛体细胞克隆囊胚分别在含有0.11、.0和10.0μg/ml浓度秋水仙素的CR1aa培养液中继续培养4或6 h,以使细胞分裂停留在中期。处理后的囊胚移入柠檬酸钠低渗液中,室温下处理15~20 min。将低渗后的单个胚胎转移至载玻片上,固定并用体积分数为25%的Giemsa溶液染色1~5 h,蒸馏水冲洗脱色,于室温干燥。显微镜下计算胚胎细胞数和有丝分裂指数以及标本制备质量。[结果]结果表明,1.0μg/ml秋水仙素处理6 h后的染色体标本制备效果较为理想。[结论]该研究为制备延边黄牛体细胞克隆囊胚染色体标本提供适宜的试验参数。     

延边黄牛核移植胚胎的活性氧含量的测定

为了研究延边黄牛体细胞克隆胚胎内部的活性氧水平,以延边黄牛孤雌激活胚胎为对照,用2,′7′-二氯荧光素二乙酸酯和二氢乙锭两种染料分别对体细胞克隆胚胎进行染色,测定其内部超氧阴离子和过氧化氢含量。结果表明,2细胞期处理组间超氧阴离子水平差异不显著(P0.05),其它细胞期体细胞克隆组均显著高于孤雌激活组(P0.05),过氧化氢水平各细胞期体细胞克隆胚胎均显著高于孤雌激活胚胎(P0.05)。因此,延边黄牛体细胞克隆胚胎氧化损伤水平显著高于孤雌激活胚胎。     

延边黄牛体细胞核移植胚胎编码抗氧化酶的基因表达研究

为研究延边黄牛体细胞核移植(SCNT)胚胎编码过氧化氢酶(CAT)、锰超氧化物酶(Mn-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的mRNA表达情况,以孤雌激活(PA)胚胎为对照,利用反转录PCR扩增延边黄牛SCNT胚胎编码CAT、Mn-SOD和GPx的mRNA,琼脂糖凝胶电泳后使用计算机软件进行半定量分析。结果显示:延边黄牛SCNT胚胎编码CAT的基因在2细胞期开始表达,且与PA胚胎存在显著差异(P0.05);编码Mn-SOD的基因在8细胞期开始表达,与PA胚胎在16细胞期以上时期差异显著(P0.05);编码GPx的基因在4细胞期开始表达,与PA胚胎在4细胞期差异显著(P0.05),8细胞期以上时期差异不显著(P0.05)。与孤雌激活胚胎的差异表明SCNT胚胎抗氧化酶表达的异常可能是由核移植操作过程所引起的。     

细胞松弛素B对延边黄牛体细胞核移植效率的影响

探讨融合液、激活液中添加细胞松弛素B(CCB)对延边黄牛体细胞核移植效率的影响,以摸索适合延边黄牛体细胞核移植的电融合、激活条件。结果表明,融合液中添加7.5μg/mL CCB组的桑葚胚及囊胚发育率显著高于其他3组;激活液中添加5.0μg/mL的CCB组的卵裂率、桑葚胚及囊胚发育率显著高于其他3组;融合液、激活液中同时添加CCB的囊胚发育率高于单独添加组,但是差异不显著。     

不同融合液对延边黄牛体细胞核移植效率的影响

[目的]探寻适宜延边黄牛体细胞核移植的最佳融合液。[方法]用延边黄牛颗粒细胞为供体细胞。试验1,比较3种浓度(0.25、0.280、.30 mol/L)3种融合液(蔗糖、D-山梨醇、甘露醇)对核移植胚胎融合率及重组胚体外发育的影响。试验2,比较3种0.28 mol/L融合液对核移植效率的影响。[结果]3种浓度的蔗糖、D-山梨醇、甘露醇融合液的融合率和卵裂率差异均不显著,但0.28 mol/L融合液处理的重组胚后期发育相对较好。3组融合液融合率(88.44%、86.83%、86.85%)差异不显著,蔗糖、甘露醇融合液卵裂率(87.98%、86.06%)差异不显著,在0.05水平上显著高于D-山梨醇融合液(78.64%);蔗糖、甘露醇融合液囊胚发育率(22.16%、19.91%)差异不显著,在0.05水平上显著高于D-山梨醇融合液(10.14%)。[结论]适宜延边黄牛体细胞核移植的最佳融合液为0.28 mol/L蔗糖融合液。     

利用冷冻的GV期卵母细胞制备延边黄牛核移植胚胎的研究

研究使用玻璃化冷冻、程序化冷冻和超快速冷冻3种方法冷冻延边黄牛的卵母细胞,确定适宜的延边黄牛核移植受体卵母细胞的冷冻方法。结果显示,3种冷冻方法处理的GV期卵母细胞在成熟率上相似,玻璃化冷冻法得到的卵母细胞形态正常率要高于程序化冷冻和超快速冷冻法(P<0.05),超快速冷冻法回收率最低。采用玻璃化冷冻法,核移植重组胚卵裂率明显高于程序化冷冻和超快速冷冻法(P<0.05),在融合率上,3种方法差异不显著。表明玻璃化冷冻方法对延边黄牛GV期卵母细胞冷冻效果优于程序化冷冻和超快速冷冻方法,是一种较适合延边黄牛核移植的卵母细胞冷冻方法。     

体细胞克隆牛生产效率的影响因素

体细胞克隆牛生产效率受实验室环节和胚胎移植环节等多种因素的影响。依据前期试验结果,重点分析了胚胎移植数量、季节变化和胚胎移植受体牛生理状态等因素对体细胞克隆牛生产效率的影响。结果表明:移植2枚胚胎比移植1枚胚胎和3枚胚胎能获得较高的妊娠率和产犊率及较低的流产率;在春、夏和秋季(5~9月)进行胚胎移植的效果显著优于冬季(12~1月);A、B级黄体受体牛的妊娠率显著高于C级黄体受体牛的妊娠率。胚胎移植数量、移植季节和受体牛生理状况均能显著影响克隆牛的生产效率。     

胚胎移植时机对牛体细胞克隆胚胎妊娠率的影响

以活体取卵OUP来源的牛卵母细胞为受体胞质,以Holstein奶牛的牛耳成纤维细胞作为供核细胞进行体细胞克隆．并将发育7d的克隆囊胚和体内胚分别及体外胚进行移植,观察移植时机对受孕率的影响。依据代孕牛排卵后天数的不同分为3个实验组,组1：排卵后5-6d（不含6d）;组2：排卵后6—7d;组3：排卵后7～8d（不含7d）。结果显示：对于体外胚胎而言,第2组的受孕率高于第1组（P〉0．05）,第3组的受孕率最低（Pt0．05）,且120d的受孕率为0。与此相反,对于体内胚胎。第3组的受孕率高于其他2组。通过实验可以证明对于7d的体外胚胎选择在代孕牛排卵后6—7d移植可以得到较高的受孕率：而对于体内胚胎而言则应选择在受体牛排卵后7—8d移植,可得到较高的妊娠率。     

猪体细胞核移植电融合参数的研究

试验旨在研究不同电融合参数(场强、脉冲时程)对猪核移植胚融合率及发育能力的影响。采用44～48h成熟培养的去核猪卵母细胞作为受体细胞,颗粒细胞为供体。结果表明,在20μs脉冲时程条件下,0.8kV·cm-1组融合率显著高于0.4、1.2、1.6kV·cm-1组(P0.05)。0.8、1.2kV·cm-1组卵裂率显著高于0.4、1.6kV·cm-1组(P0.05)。场强为0.8kV·cm-1条件下,20μs组融合率显著高于30、40、50μs组(P0.05)。卵裂率20、30μs组显著高于40、50μs组。根据试验数据,本试验室最佳融合电参数为:0.8kV·cm-1、20μs,1次脉冲。