根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Güther)类胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-I)基因的cDNA序列, 设计引物扩增编码IGF-I成熟肽序列, 此序列由210个碱基组成, 包括B-C-A-D 4个功能域。利用PCR方法将扩增片段克隆到原核表达载体pET-28a上, 得到重组质粒, 将重组质粒导入到大肠杆菌BL21( DE3)后经IPTG诱导产生N端含6个组氨酸的融合蛋白。以SDS-PAGE电泳检测和SigmaScan软件分析获得的多肽, 结果表明: IGF-I融合蛋白大小为11.4 kD, IPTG诱导3 h时目的蛋白表达量最高, 占细菌总蛋白的58.5%, 1 L菌液表达目的蛋白40.7 mg, 主要以包涵体形式存在。利用Western-blotting方法验证融合蛋白可特异性的被6×His抗体识别。诱导表达后的菌液沉淀经6 mol/L盐酸胍变性、Ni2+离子亲和柱纯化和尿素梯度复性, 获得大小为11.4 kD的纯化蛋白。细胞增殖实验表明, IGF-I融合蛋白可显著促进乳腺癌细胞MDA231细胞的增殖, 具有生物学活性。本研究通过原核表达技术获得了体外重组的具有生物活性的半滑舌鳎IGF-I融合蛋白, 结果可为半滑舌鳎生长调控技术研究提供基础资料。
本研究通过对5个鲤养殖品种即高寒鲤(Cyprinus carpio Frigid carp)、松浦鲤(Cyprinus carpio Songpu carp)、蓝鳞鲤(Cyprinus carpio blue var)、松浦镜鲤(Cyprinus carpio Songpu mirror carp)和红镜鲤(Cyprinus carpio Red mirror carp)的线粒体COI基因部分序列的测定, 比较并分析了其遗传多样性和系统进化关系。在5个鲤品种共100个样本的线粒体COI序列中检测到8种单倍型, 其中5个单倍型(H1、H2、H4、H5、H6)涵盖样本较多, 占总样本数的94.06%。蓝鳞鲤的单倍型数最少, 仅有1个, 红镜鲤单倍型数为2个, 其余3个品种的单倍型数均为5个。5个品种单倍型多样性(Hd)在0.160±0.070~0.811±0.055, 其中, 遗传多样性最高的为高寒鲤。AMOVA结果表明, 品种间变异(50.28%)略高于品种内变异(49.72%), 各品种间的FST值在0.711 4~0.831 2, 其中蓝鳞鲤与其他群体之间差异最大。用MEGA4.0软件构建的基于遗传距离的进化树表明, 5个养殖品种中, 高寒鲤和红镜鲤的遗传距离最近(D=0.31), 聚为一支; 松浦镜鲤和松浦鲤的遗传距离较近(D=0.33), 聚为一支; 蓝鳞鲤与其他品种存在较大遗传差异, 单独形成一个分支。除蓝鳞鲤外, 其余4个养殖品种间均存在共享的单倍型(H2、H4、H5、H6), 可能是由于其在选育过程中亲本的遗传背景存在交叉, 同时也证明DNA条码在分析种内品种间遗传关系时具有可行性但具有一定的局限性。
在基础饲料中分别添加0.0%(对照组)、0.5%、1.0%、2.0%和3.0%的杜仲(Eucommia ulmoides), 饲喂体质量为(7.5±0.2) g的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei), 实验共分5个处理组, 每处理组4个重复, 每重复40尾虾。经过42 d养殖, 各处理组均有较高的存活率, 且无显著差异(P>0.05); 2.0%杜仲组的虾体增重率最高(136.1%), 饲料系数最低(1.33), 较对照组提高增重率9.8%(P<0.05), 降低饲料系数0.13(P<0.05); 饲料中添加0.5%、1.0%杜仲, 显著提高了对虾血清LSZ、PO活性, 添加1.0%杜仲, 显著降低了血清MDA含量, 提高了肝胰腺蛋白酶活性(P<0.05); 攻毒实验结果表明, 以溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)肌肉注射虾体后96 h, 0.5%、1.0%、2.0%杜仲组的虾体死亡率均较对照组显著降低(P<0.05); 在肌肉成分方面, 添加2.0%、3.0%杜仲显著提高了肌肉胶原蛋白含量, 各处理在肌肉水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪含量方面没有显著差异。上述研究表明, 在凡纳滨对虾饲料中添加杜仲2.0%, 可显著改善生产性能, 提高肌肉胶原蛋白含量; 在饲料中添加杜仲0.5%~1.0%, 可提高凡纳滨对虾非特异性免疫能力。本研究旨在考察杜仲对凡纳滨对虾生长、血清非特异性免疫和肌肉成分的影响, 为杜仲在对虾饲料中的合理应用提供科学依据。
从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)全基因组序列中获得肿瘤抑制基因 WT1a 的部分序列, 然后利用 RACE 技术克隆了WT1a 基因的全长, 运用组织学方法, 对半滑舌鳎性腺分化早期的组织切片进行了观察, 并分析了该阶段WT1a 的表达特征。克隆结果显示, WT1a 基因cDNA全长为1 886 bp, 开放阅读框(ORF)长为1 470 bp, 编码490个氨基酸, 并且包含 KTS 三肽, 5′-UTR 和3′-UTR 分别长为245 bp 和171 bp。在 ORF 末端发现2个微卫星(SSR)序列和2个跨膜螺旋区域, 而在其他物种中未发现这些区域。氨基酸序列分析显示, WT1a 基因的保守性很高, 与人的同源性高达90%。通过组织切片观察发现, 该批半滑舌鳎在56 d时性腺开始分化, 并且卵巢分化早于精巢。荧光实时定量分析结果显示, WT1a 在半滑舌鳎成鱼性腺中表达量显著高于其他各组织, 在肝、肾、脾、心脏等组织中有微量表达, 并且在成鱼性腺中, 雄鱼表达量显著高于雌鱼, 雌鱼显著高于伪雄鱼。在胚胎发育各时期以及初出膜后WT1a的表达结果显示, 在12 h (原肠早期)显著升高, 20 h (神经胚期)达到最高。在性腺分化早期雌雄性腺中的表达结果显示, WT1a 在雌雄半滑舌鳎16~66 d 的性腺中表达量持续平稳升高, 在性腺分化时期表达量并没有特殊的变化。这些研究结果说明, WT1a 基因是半滑舌鳎性别相关基因, 并在半滑舌鳎的性腺分化、发育过程中持续表达, 但可能对性腺的分化过程并不起决定作用。
为验证Ferritin基因是否对三疣梭子蟹的盐度胁迫具有适应性, 利用PCR扩增获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)第六对鳃的Ferritin基因, 将该目的基因克隆到表达载体pET28a(+)中, 转化大肠杆菌DE3(BL21), 并进行IPTG诱导表达。结果表明: 经诱导的转pET28-Ferritin重组质粒菌株有特异的表达蛋白条带出现, 与预期的理论值(19.448 kD)相符合; 高盐胁迫下, 转重组质粒的大肠杆菌比转pET28空载质粒存活率显著提高(P< 0.001), 并且随盐度升高, 两者差异越显著。这表明Ferritin基因能够提高大肠杆菌的盐度耐受力, 由此推测Ferritin基因参与了三疣梭子蟹盐度适应的生理过程。本研究旨在为生产过程中三疣梭子蟹养殖水体的盐度调控策略提供理论依据。
通过分析半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) Dmrt1重组蛋白注射卵巢后基因表达调控, 探讨Dmrt1在半滑舌鳎性别决定与分化中的功能。实验利用原核表达系统(Pet-32a)对半滑舌鳎Dmrt1基因进行重组表达, 并通过亲和层析纯化获得了重组目的蛋白(Pet-32-dmrt1)。重组蛋白注射卵巢后实时定量PCR分析结果显示, Cyp19a和Foxl2在6~24 h内两基因表达量均显著下调, Sox9a基因表达量在6~24 h内有显著上调, 但48 h后3个基因的表达量逐渐恢复正常表达水平。研究结果证实, Dmrt1重组蛋白具有生物活性, 且对性别相关基因表达调控具有一定的影响, 在性别决定中发挥一定作用。
以牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗病群体(RS)、RS(♂)与从日本引进的日本群体(♀)交配建立的群体(RJ)、日本群体(♂)与RS(♀)交配建立的群体(JR)、以及韩国群体(KS)为基础群体, 通过随机交配建立牙鲆家系, 研究了4个群体作为亲本的育种性能。待所建立的家系生长至19月龄左右时, 测量家系生长性状, 包括全长和体质量, 测量所得数据用SPSS及DMU软件中的REML算法和BLUP方法进行分析。结果显示, 从表型参数可以看出KS(♂)×RJ(♀)杂交后代表现出明显的生长优势。19月龄牙鲆全长和体质量的遗传力分别为0.301、0.295, 都属于中等遗传力。因此, 牙鲆群体具有较好的遗传改良潜力。全长、体质量育种值与其表型值的相关系数分别为0.838和0.827, 且呈极显著相关(P<0.01), 表明个体育种值的预测结果具有较高的准确性。对父母本分别进行育种值比较可知, 父本中KS的育种值最高, 母本中RJ的育种值最高, 因此选用KS(♂)和RJ(♀)杂交可培育出生长迅速的牙鲆新品种。本研究通过比较4个资源群体牙鲆生长性状的育种性能, 并以此作为筛选优良亲本群体的重要依据, 旨在为牙鲆新品种的成功选育奠定理论基础, 同时为牙鲆的进一步遗传改良提供重要的科学依据。
以初始体质量(6.02±0.16) g的鲫鱼(Carassius auratus)为研究对象, 在鲫鱼基础饲料中分别添加0.0 g/kg、1.0 g/kg、2.5 g/kg、5.0 g/kg、7.5 g/kg的包膜丁酸钠, 配制5种等氮等能的实验饲料, 研究不同浓度包膜丁酸钠通过促进鲫鱼肠细胞增殖对其生长作用的影响。实验在室内养殖系统中进行, 每水族缸饲喂30尾, 每处理组3个重复, 以鱼体质量3%~5%投喂量, 日投喂3次, 试验持续7周。实验结果表明: 在饲料中添加丁酸钠对鲫鱼有明显的促生长作用, 显著提高了鲫鱼前肠绒毛高度/隐窝深度的比值以及肠道细胞增殖因子CREB和CDX2基因的表达。当丁酸钠添加量为2.5 g/kg时, 鲫鱼增重率、特定生长率、蛋白质效率和肥满度最高, 显著高于对照组(P<0.05), 比对照组分别提高了25.76%、16.46%、28.91%和8.37%; 与对照组相比, 丁酸钠添加量达到2.5 g/kg时, 鲫鱼干物质与蛋白质表观消化率、前肠绒毛高度、肠道CREB基因和CDX2基因的相对表达量显著升高, 分别比对照组提高8.36%、6.21%、34.22%、51.11%和42.13%(P<0.05)。上述研究表明饲料中添加适量的丁酸钠可能通过显著提高鲫鱼肠绒毛高度和肠道细胞增殖因子CREB和CDX2基因的表达量, 从而促进其生长, 适宜添加量为2.5 g/kg。
以在盐度2~3条件下养殖至9月龄的凡纳滨对虾( Litopenaeus vannamei )成虾为材料, 研究低盐度养殖对虾在不同盐度驯养条件下的繁殖性能, 以期为利用低盐度养殖对虾培育亲虾提供科学依据。实验盐度梯度设置为1、8、15、23和30。雌虾经剪切单侧眼柄后进行促熟培育, 促熟期间的雄虾养殖水温控制在(27±0.5)℃, 雌虾水温控制在(28±0.5)℃。定期检查雌虾卵巢和雄虾精荚的发育情况, 采用精荚人工移植技术对不同盐度条件下培育的亲虾进行组合交配, 统计受精率和孵化率, 组织切片观察卵巢发育, 综合评价各实验组合的繁殖性能。结果表明, 在实验盐度梯度范围内, 雌虾卵巢都可发育成熟; 盐度1组雌虾成熟比例仅10%, 且全部死亡; 盐度8和15下发育成熟的雌虾达70%, 可正常产卵, 但产出的卵子受精率较低, 不能孵化出无节幼体; 盐度23和30下发育成熟的雌虾超过76%, 可正常产卵、孵化, 但孵化率较低。组织切片观察, 盐度8~30范围内各组雌虾卵巢发育无明显差异。在盐度8~30范围内, 凡纳滨对虾雄虾精巢都能够正常发育成熟, 但盐度30和23实验组的雄虾精巢发育速度明显快于盐度15和8组; 随着盐度的降低, 精荚发育成熟所需要的时间明显延长; 所有盐度实验组的精荚被移植后都可与卵子受精并孵化出无节幼体。
采用RACE方法获得了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因的cDNA序列。该基因全长1 516 bp, 开放阅读框1 245 bp, 编码414个氨基酸, 其预测分子量为45.06 kD, 理论等电点为5.694, 并含有两个糖基结合位点。同源性分析发现其与斑节对虾(Penaeus monodon)同源性最高, 达到49%。组织表达分析表明, serpin基因在脊尾白虾血细胞中表达量最高, 其次是肝胰腺和鳃组织, 在肌肉中表达量最低。不同盐度胁迫后脊尾白虾的血细胞serpin基因表达量在盐度胁迫8 h时显著高于对照组(P<0.05), 肝胰腺组织中serpin基因表达量在盐度胁迫后2 h和24 h出现明显峰值, 且显著高于对照组(P<0.05)。上述结果表明, 脊尾白虾serpin基因参与了急性盐度胁迫下机体的应激反应。本研究通过克隆脊尾白虾酚氧化酶原激活系统中的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因cDNA全长, 分析盐度胁迫后其在血细胞和肝胰腺组织中的表达变化规律, 以期为脊尾白虾的健康养殖提供理论基础和参考依据。
对浒苔(Enteromorpha prolifera)的一般营养成分、氨基酸及脂肪酸含量进行测定, 并以浒苔为原料投喂体质量(5.26±0.14) g的刺参(Apostichopus japonicas Selenka)幼参, 与幼参常用饵料如鼠尾藻(Sargassum thunbergii)、马尾藻(Sargassum muticum)、海带(Laminaria japonica)进行效果对比。营养成分检测结果显示, 浒苔蛋白质含量为15.7%, 其中含量较高的氨基酸有天门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸等; 脂肪含量低(1%), 多不饱和脂肪酸比例较高(0.24%); 浒苔中各重金属(无机砷、镉、铅、甲基汞)含量均低于国家相关限量标准。以4种海藻为饵料投喂幼参70 d后, 各组刺参幼参生长良好, 成活率无明显差异(P>0.05), 幼参体质量均显著增长(P<0.05); 各组刺参的特定生长率(SGR)由高到低依次为鼠尾藻组、浒苔组、马尾藻组、海带组; 摄食率(IR)由高到低依次为海带、马尾藻、浒苔、鼠尾藻, 饵料转化率(FE)由高到低依次为鼠尾藻组、浒苔组、马尾藻组、海带组。浒苔、鼠尾藻、马尾藻3个投喂组刺参幼参特定生长(SGR)无显著差异(P>0.05), 但显著高于海带组(P<0.05)。本研究说明, 浒苔蛋白含量高、脂肪含量低, 可全部或部分替代鼠尾藻添加到幼参饵料。
2009—2012年于陕西省陇县秦岭细鳞鲑(Brachymystax lenok tsinlingensis)国家级自然保护区内采集秦岭细鳞鲑样本397尾。以鳞片为年龄鉴定材料, 显微镜下观察发现, 秦岭细鳞鲑鳞片上的年轮特征主要表现为普通切割形; 研究样本的年龄共分为5个年龄组, 其中以1~3龄为主, 约占85.64%; 体长(L, mm)和鳞径(R, mm)具有显著的相关性(L= -5.83R2 + 208.06R + 34.99, r2=0.88); Von Bertalanffy生长方程分别为: Lt=729.38[1-e-0.08(t+0.5)], Wt= 6 288.74·[1-e-0.08(t+0.5)]2.968 1, 雌雄个体的生长速率无显著差异; 生长系数为0.08, 拐点年龄为13.10 龄, 对应的的体长和体质量分别为483.66 mm和1 857.86 g。结论认为, 秦岭细鳞属生长缓慢型鱼类, 在所调查的保护区中秦岭细鳞鲑显现出个体小型化趋势。在制定资源保护策略时, 应考虑采取人工增殖放流措施来扩大自然种群数量, 增强种群的自然调节能力, 恢复种群数量。本研究旨在了解秦岭细鳞鲑的生长规律, 为秦岭细鳞鲑的资源保护与合理利用提供理论指导。