对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28研究进展

对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是在水产养殖中引起对虾等甲壳类动物发生严重病害的病原体。VP28是WSSV中最重要的囊膜蛋白之一,在WSSV感染对虾的初期起着至关重要的作用。文章从基因和蛋白质结构、VP28在病毒入侵中的作用及免疫应用等方面概述了VP28的研究进展,可为WSSV的防治研究提供参考。     

对虾白斑综合征病毒（WSSV）囊膜蛋白VP110部分重组表达及其与对虾鳃细胞膜蛋白结合分析

将VP110基因的部分序列克隆到pET-28a载体中构建pET28a-vp110b重组质粒并进行原核表达,获得重组表达的蛋白rVP110-B;用rVP110-B注射凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei后,经WSSV感染,实验表明,该蛋白注射使凡纳滨对虾感染WSSV的半数死亡时间比对照组延长了20%。用表达纯化的该重组蛋白制备了兔抗rVP110-B多克隆抗体,该抗体用于凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白与rVP110-B的Far-western分析显示,凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白中除90 kDa左右的血蓝蛋白外,在41.7 kDa存在结合条带,经质谱分析表明这条鳃细胞膜蛋白是肌动蛋白。     

白斑综合征病毒囊膜蛋白VP19及VP28的研究进展

自二十世纪90年代,白斑综合征病毒(WSSV)就因其暴发范围广、致死率高得到了广泛的关注。研究主要集中在确定该病毒蛋白的结构及功能,以及利用其囊膜蛋白制备亚单位疫苗、研发DNA疫苗等来提高对虾抵抗白斑综合征病毒的能力,尽管免疫防治目前在实验室阶段已取得了显著的保护效果,但因其给药方式局限以及成本较高等因素一直没有应用于实际生产中。VP19和VP28是白斑综合征病毒主要的囊膜蛋白,在WSSV感染对虾的过程中起着非常重要的作用。本文从WSSV的基因组学、VP19和VP28的蛋白质结构及其在免疫防治中的应用等方面概述了VP19和VP28的研究进展,包括蛋白亚单位疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗以及相关抗体的研究。在总结了不同类型疫苗的保护效果后发现,VP19和VP28的双价疫苗的保护率较高,为今后制定有效的WSSV控制方法提供了参考。     

对虾白斑综合征病毒在螯虾动物模型的感染特性

应用克氏原螯虾作为动物模型研究对虾白斑综合征病毒（ＷＳＳＶ）的感染增殖特性，涉及感染温度，感染途径，继发感染，半数致死量（ＬＤ５０），免疫保护及保存期等，结果显示，２２－２５℃时，接种ＷＳＳＶ的螯虾一般于２－７d内死亡，温度升高对病毒增殖影响不显著，３０－３２℃时，平均死亡时间２－６d，温度降低对病毒增殖影响较显著，１５－１９℃时，接种螯虾平均２－１０d内死亡，８－１０℃时，平均死亡时间３－６d，感染途径分别用腹节肌肉，腹节皮下洲射及口服，均能使螯虾感染发病，而浸泡方式不能使螯虾发病，细菌分离和细菌定量结果表明，寄考于螯虾心脏，肝胰腺内的阴沟肠杆菌在感染后期大量增殖，菌量分别是正常螯虾的２５和３０倍，形成继发感染，用螯虾心脏，肝胰腺内的阴肠杆菌在感染后期大量增殖，菌量分别是政党螯虾的２５和３０倍，形成继发梁。用螯虾测定ＷＳＳＶ的ＬＤ５０为１０^-6.5.mL^-1种毒液，将病毒５６℃，３０min灭活后免疫螯虾，不能使螯虾形成免疫保护，ＷＳＳＶ匀浆液－３０℃冻存１年后失活，而－３０℃冻存于螯虾体内ＷＳＳＶ保存１年后仍有活力。     

白斑综合征病毒(WSSV)在市售克氏原螯虾中携带情况调查

近年来白斑综合征成为制约克氏原螯虾养殖的重要病害。对市场销售的克氏原螯虾抽样调查,采用PCR仪检测白斑综合征病毒(WSSV)的携带情况,结果为:湖泊养殖的克氏原螯虾不携带WSSV,池塘单养的克氏原螯虾及江河野生克氏原螯虾携带WSSV。     

克氏原螯虾自噬相关基因PcAtg2的克隆及其在白斑综合征病毒胁迫下的表达分析

为了解自噬相关基因Atg2在克氏原螯虾(Procambarus clarkia)先天免疫中的作用,本研究克隆了克氏原螯虾Atg2 (PcAtg2)基因全长序列。生物信息学分析显示,PcAtg2蛋白编码序列全长为9 966 bp,推测其编码2 189个氨基酸。组织定量表达分布显示,PcAtg2在克氏原螯虾的各个组织中均有表达,其中在肝胰腺中表达最高,在眼柄中表达最低。在白斑综合征病毒(WSSV)感染实验中,PcAtg2基因表达量在不同组织中均呈现显著上调趋势。RNA干扰(RNAi)实验显示,PcAtg2基因沉默后,WSSV在克氏原螯虾体内的增殖明显被抑制,同时,自噬相关基因的表达量上调。透射电镜分析结果显示,在WSSV感染后,PcAtg2基因沉默组中克氏原螯虾肝胰腺组织中的自噬小体多于对照组。本研究结果可为了解克氏原螯虾应对WSSV胁迫下的调控机制提供理论参考。     

中国明对虾caspase2基因克隆及其在抗白斑综合征病毒中的表达分析

采用RACE技术克隆获得中国明对虾caspase2基因cDNA序列全长,并对该序列进行分析。结果显示,中国明对虾caspase2基因全长为1517 bp,开放阅读框长924 bp,5'非编码区长78 bp,3'非编码区长515 bp,命名为FcCasp2。推测该基因编码307个氨基酸,预测分子量为34.21 ku,理论等电点为7.62。同源性和系统进化分析发现,FcCasp2基因与凡纳滨对虾caspase2和斑节对虾caspase的相似性分别为88%和80%,与其他节肢动物caspase家族基因聚为一类。荧光定量RT-PCR结果显示,FcCasp2基因在肝胰腺中的相对表达量最高,在肌肉中表达量最低。WSSV感染后该基因在中国明对虾肌肉、肝胰腺和鳃丝中的表达量有不同的时空表达趋势,表明FcCasp2基因可能参与中国明对虾生物胁迫的应答反应。     

不同温度下凡纳滨对虾和中国明对虾对白斑综合征病毒(WSSV)耐受性比较

本研究分别对凡纳滨对虾"壬海1号"(Litopenaeus vannamei"Renhai No.1")和中国明对虾"黄海2号"(Fenneropenaeus chinensis"Huanghai No.2")在3种温度条件下(24℃、28℃和32℃),采用单尾定量口饲感染白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的方法进行感染实验,比较2种对虾在不同温度情况下对WSSV的耐受性差异(L代表凡纳滨对虾,F代表中国明对虾)。结果显示,L-24℃和F-24℃组的平均存活时间分为(184.05±69.56)h和(101.68±38.45)h;L-28℃和F-28℃组的平均存活时间分别为(100.25±26.79)h和(73.38±22.22)h,相同温度组内均存在显著性差异(P0.05);截至第15天,L-32℃和F-32℃组的存活率分别为45.74%和23.47%。3个温度组对虾在50%的死亡率时的存活时间分别为178 h和98 h、98 h和74 h、292 h和78 h;死亡高峰时间分别为第5天和第4天、第5天和第4天、第10天和第4天。另外,分别在感染后的12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、15 d共9个时间点对每组对虾进行活体取样,利用实时荧光定量RT-PCR技术对其进行病毒载量检测,从对虾体内肌肉组织病毒载量的角度探寻不同对虾抗病性能的差异。6 d时,L-24℃和F-24℃组对虾肌肉内病毒载量分别达到(2.97×10~6±7.44×10~6)和(8.08×10~6±3.22×10~6)copies/ng DNA,差异极显著(P0.01),L-28℃和F-28℃组分别达到(6.73×10~6±1.49×10~6)和(1.20×10~7±6.15×10~5)copies/ng DNA,差异极显著(P0.01);15 d,L-32℃和F-32℃组分别达到(5.18×10~4±4.32×10~4)和(3.78×10~4±8.97×10~4)copies/ng DNA,差异显著(P0.05)。研究表明,2种对虾在3种温度环境下感染WSSV后,凡纳滨对虾耐受WSSV能力要高于中国明对虾;不同温度下同种对虾肌肉体内WSSV的增殖能力从强到弱依次为28℃组、24℃组和32℃组。     

强壮藻钩虾对中国明对虾与日本囊对虾生长和抗病力的影响

以强壮藻钩虾(以下简称钩虾)作为中国明对虾和日本囊对虾的天然饵料,以对虾人工配合饲料为对照研究钩虾对中国明对虾和日本囊对虾生长和抗病力的影响。对两种规格的中国明对虾[体质量分别为(0.33±0.0204)g和(2.07±0.184)g,分别记为SF组和MF组]和日本囊对虾[体质量为(0.25±0.018 1)g,记为SM组]分别投喂人工配合饲料和钩虾,养殖35 d。结果显示:(1)与人工配合饲料相比钩虾可以提高MF组和SM组对虾的特定生长率和SM组对虾的成活率;(2)钩虾可以显著提高SF组和SM组对虾血细胞总数(P<0.05);(3)钩虾可以显著提高3组对虾血清总蛋白含量(P<0.05)及SF组和SM组血蓝蛋白含量(P<0.05);(4)钩虾可以显著提高日本囊对虾溶菌酶活力(P<0.05);(5)钩虾可以显著提高FM组和SM组对虾酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力(P<0.05);(6)钩虾可以显著性提高SF组和SM组对虾血清过氧化物酶相对活力(P<0.05);(7)对虾健康指标总得分与其感染WSSV后的100%致死时间关系密切,两者之间呈现一定的线性关系(R2=0.948 9)。研究结果表明,钩虾与对虾人工配合饲料相比可以促进中国明对虾和日本囊对虾的生长及提高对虾抗病力。     

cDNA芯片结合抑制性差减杂交技术构建对虾白斑综合征病毒表达基因和螯虾免疫相关基因文库

以克氏原螯虾做为对虾白斑综合征病毒（WSSV）的增殖模型,试验组接种WSSV,对照组接种PBS。分别以试验组为检测组（tester）、对照组为驱逐组（driver）,进行正向抑制性差减杂交;以对照组为tester、试验组为driver,进行反向SSH。将获得的正、反向差减杂交产物克隆入质粒载体PinPointTM Xa1 TVector,再转化大肠杆菌DH5α,共构建了2个分别含1620和400个克隆的正、反向差减文库。经PCR扩增,1514个差减克隆得到产物,其中正向差减克隆1221个,反向差减克隆293个。获得的PCR产物经浓缩、变性处理,用自动点样仪点制于尼龙膜载体上,制成cDNA芯片,用cDNA芯片对SSH获得的差减克隆进行鉴定,共获得差异表达克隆278个,其中攻毒组高表达克隆255个;对照组高表达克隆23个。     

Three tetraspanins from Chinese shrimp, Fenneropenaeus chinensis, may play important roles in WSSV infection

Three members of the tetraspanin/TM₄SF superfamily were cloned from Chinese shrimp, Fenneropenaeus chinensis . The deduced amino acid sequences of the three proteins have typical motifs of the tetraspanin/TM₄SF superfamily. Phylogenetic analysis of the proteins, together with the known tetraspanins of invertebrates and vertebrates, revealed that they belong to different tetraspanin subfamilies: CD9, CD63 and tetraspanin-3. The three cloned genes of CD9, CD63 and tetraspanin-3 showed apparently different tissue distributions. The CD9 gene ( FcCD9 ) was specifically expressed in the hepatopancreas. While for the CD63 gene ( FcCD63 ), the highest expression was detected in nerves, epidermis and heart, with low expression in haemocytes, ovary, gill, hepatopancreas and stomach and no expression in intestine, muscle and lymphoid organ. Compared with FcCD9 and FcCD63 , the tetraspanin-3 gene ( FcTetraspanin-3 ) was more broadly expressed and its highest expression was detected in the intestine. Its expression in nerves was lower than in the intestine, but was higher than in other tissues. Expression in haemocytes, ovary and muscle was much lower than in other tissues. The expression profiles of FcCD9 , FcCD63 and FcTetraspanin-3 in different tissues, including haemocytes, lymphoid organ and hepatopancreas, were compared by real-time PCR when shrimp were challenged by live white spot syndrome virus (WSSV) and heat-inactivated WSSV. All three tetraspanins were markedly up-regulated in the live WSSV-challenged shrimp tissues. The data suggested that the three cloned members of TM₄SF superfamily in Chinese shrimp may play a key role in the route of WSSV infection.     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis) Tetraspanin-3与WSSV的体外相互作用

Tetraspanin-3是四跨膜蛋白超家族的一员,在信号转导和免疫等过程中起到重要作用。本研究将中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis) Tetraspanin-3 (FcT3)的大胞外环区(Large extracellular loop, LEL)基因片段克隆,与原核表达载体pBAD/gⅢA连接,获得重组表达载体pBAD/gⅢA-T3L,转化入大肠杆菌TOP 10中,用L-阿拉伯糖(L-Arab)诱导并经钴离子亲和层析纯化得到重组蛋白。质谱分析显示,纯化的重组蛋白为FcT3。用地高辛将FcT3L标记并与WSSV作用,Far-western分析显示,FcT3L与VP26结合。ELISA实验结果显示,FcT3L与VP26蛋白的相互作用随VP26量的增加而增强。推测FcT3通过与VP26作用介导病毒核衣壳的入胞过程。     

中国对虾雄性生殖系统感染WSSV在其垂直传播中的作用

通过人工感染实验,对中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)雄性亲虾进行投喂感染。在确定其携带WSSV粒子后,将被WSSV感染的精荚人工移植到健康的雌虾纳精囊内。在无其他病源的情况下,促其产卵繁殖,统计各组子代的受精率、孵化率及无节幼体至溞状幼体的变态率贸?式PCR技术对亲虾及子代进行WSSV检测。结果表明,受WSSV感染的精荚能够把病毒传播给健康雌虾,雌虾能产出携带WSSV的卵子,培育出带毒幼体。各组子代的受精率、孵化率及变态率的统计结果表明,感染组和对照组在受精率上没有明显区别,受WSSV感染的精卵细胞可以正常结合。对照组受精卵的孵化率明显高于感染组,差异显著(P=0.045<0.05)。对照组无节幼体的变态率也高于感染组。说明WSSV的入侵对受精卵及幼体的发育有影响,WSSV感染导致部分受精卵及幼体不能正常发育或死亡。     

控制环境养殖下近交对中国对虾早期体重和抗WSSV性状的影响

过量的捕捞和不合理的人工育种措施,使中国对虾野生和养殖群体的遗传多样性均遭到不同程度的降低。本试验在相似的环境条件下养殖了40个野生对虾产生的家系和3个兄妹交产生的家系,定量测定了平均体重(1.43~1.58) g 1 460尾中国对虾早期体重和感染白斑综合征病毒（WSSV）后存活时间的近交衰退系数。结果显示,野生对虾家系组的平均体重和平均存活时间分别为(1.58±0.01) g和(100.43±0.68) h,而兄妹交家系组平均体重和平均存活时间分别是(1.43±0.04) g和(85.84±1.70) h,平均体重和平均存活时间在两组间均存在极显著差异（P<0.01）。野生对虾家系组体重和存活时间的表型相关系数为0.16±0.00,而兄妹交家系组两者间的表型相关系数为0.20±0.00,但是两组间表型相关系数差异不显著（P>0.05）。近交系数每增加10％,体重和感染WSSV后存活时间分别衰退-3.80%±0.17%和-5.81%±0.11%,与近交能够降低生长和疾病抗性的观点相一致。实验结果表明,在选择育种和种质资源保护过程中都应该保证基础群体遗传背景最大化,从而有效控制近交。图0表2参39     

中国明对虾抗菌肽基因应答WSSV侵染的表达及其SNP分析

通过白斑综合征病毒(WSSV)感染实验,利用实时定量PCR技术研究了中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)应答病毒侵染后,已知的3种抗菌肽(对虾肽)在肝胰腺、肌肉、肠和鳃4种组织中的差异表达情况.结果显示,虽然3种抗菌肽表现出明显的组织表达特异性,即在不同组织中的表达趋势和表达丰富度存在明显的差异,但是就同一个组织而言,3种抗菌肽在1～120 h WSSV侵染区间内的表达趋势基本一致,在0 h(未侵染病毒)时,3种抗菌肽的表达量极低(为0);在6～24 h期间,检测到明显的表达量;48～120 h期间,3种抗菌肽的表达量总体呈现下降的趋势.这暗示3种抗菌肽在对虾机体内可能具有相似的生物学功能.在此基础上,本研究对各类型中国明对虾抗菌肽的SNP位点进行了筛选,进一步对不同SNP类型与抗WSSV或易感WSSV的关联程度进行了分析,结果显示3种抗菌肽基因的SNP位点很少,且在抗性和易感对虾群体内不存在明显的偏向分布.     

不同饵料对中国对虾幼虾生长及感染WSSV存活率的影响

采用4种饵料投喂中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）幼虾，用投喂感染的方法人工感染WSSV。测定体长、体重以及各组的攻毒存活率，实验周期15d。ANOVA分析结果表明，投喂鲜活卤虫组体长、体重的增长明显优于其他各组，差异达极显著水平（P〈0．01）；投喂人工配合饵料实验组的体长、体重增长量最小；投喂鱼肉组体长增长慢于投喂蛤蜊肉组，而体重的增长快于投喂蛤蜊肉组，差异均不显著（P〉0．05）。投喂卤虫成体和投喂鱼肉两组的攻毒存活率最高，明显高于投喂配合饵料和蛤蜊肉两实验组，差异达极显著水平（P〈0．01）；投喂卤虫组和投喂鱼肉组之间存活率无显著差异（P〉0．05），投喂人工配合饵料组和蛤蜊肉组差异不显著（P〉0．05）。巢式PCR检测表明，人工感染前的中国对虾幼虾少数携带WSSV，人工感染后全部个体检测到病毒特征片段。     

中国对虾几个产卵场群体携带白斑综合征病毒状况调查

白斑综合征可以导致养殖对虾短时间内大面积死亡,是迄今为止对虾养殖业面临的最大挑战。本试验采用巢式PCR法对2001年采自黄渤海的中国对虾几个产卵场群体进行白斑综合征病毒检测,旨在较全面地了解黄渤海野生中国对虾携带病毒状况。各群体的阳性检出率分别为：朝鲜半岛南海岸群体55％;渤海湾群体35％;辽东湾群体94．7％;海州湾群体47．4％。结果显示,中国对虾几个产卵场群体均不同程度地携带白斑综合征病毒。辽东湾产卵场群体阳性检出率明显高于其他群体,推测人工孵化苗种放流、海湾的地理和水质条件与中国对虾的WSSV感染率相关。而中国对虾野生群体携带病毒对于对虾养殖业的影响是不容忽视的,笔者认为,只有从无特异病原(SPF)及抗特异病原(SPR)对虾养殖群体的建立着手才能从根本上避免由于对虾携带病毒而可能导致的病毒性疾病的暴发。同时,应该重视海区污染的治理,减少病毒病暴发的诱因。本试验建立了快速检测WSSV的PCR方法,1pg病毒核酸仍可检测到,为白斑综合征病毒病的防治及早期诊断提供了有效的手段。     

抗WSSV囊膜蛋白（VP28和VP19）单抗的体内中和效果研究

通过酶联免疫吸附法（ELISA）测定不同稀释度对虾白斑综合征病毒（WSSV）与已制备的WSSV囊膜蛋白单克隆抗体结合的OD值。利用克氏原螯虾Cambarus proclarkii动物模型,将不同稀释度病毒与单抗1：1混合孵育2h后,肌肉注射克氏原螯虾（50μl／只）,观察记录螯虾的死亡情况。ELISA结果显示,在1×10^-3病毒稀释度下两种单抗均足量。在螯虾体内中和实验中,当病毒浓度为1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5和1×10^-6稀释度时,MAb1D6（VP28）螯虾组最终死亡率分别为100％、90％、16．7％和6．7％,而MAb2E9（VP19）螯虾组最终死亡率分别为100％、100％、100％和93．3％。这表明随病毒浓度的降低,MAb1D6（VP28）的中和效果越明显。而MAb2E9（VP19）并无明显的中和效果。