凡纳滨对虾28.5D血蓝蛋白的降解新片段

血蓝蛋白是一种具有多种非特异性免疫学活性且可以产生免疫学活性降解片段的多功能蛋白。为了探索血蓝蛋白新的降解片段,本研究以凡纳滨对虾旺itopenaeus vannamei）为研究对象,采用比较蛋白质学技术分析对虾感染病原菌后血清蛋白质组的变化。结果发现,对虾感染副溶血弧菌（Hbrio parahaemolyticus）12h后,血清中新增一种28．5kD的蛋白（命名为p28．5）。经MALDI-TOF／MS分析,其与凡纳滨对虾血蓝蛋白75kD亚基具有高度同源性。进一步研究显示,p28．5蛋白不仅可与抗血蓝蛋白抗体发生特异性结合,而且还与对虾抗感染能力呈正相关。由此推测,p28．5蛋白应该是对虾感染病原菌后产生的一种28．5kD血蓝蛋白降解新片段,其可能是血蓝蛋白发挥免疫学功能的一种新方式的产物。[中国水产科学,2008,15（3）：425-430]     

凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗黑曲霉活性

 以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象, 运用亲和层析、SDS-PAGE、Western-blotting、抗真菌实验等技术探索对虾血蓝蛋白的抗黑曲菌活性。结果发现, 血蓝蛋白在质量浓度为0.1～0.8 mg/mL时对黑曲霉(Aspergillus niger)生长表现出明显的抑制活性。在此基础上, 选取0.2 mg/mL血蓝蛋白作用后的黑曲霉进行显微观察分析。光学显微镜观察结果表明, 血蓝蛋白能抑制黑曲霉孢子生长。扫描电镜分析显示, 在血蓝蛋白作用下, 黑曲霉孢子囊萎缩, 分生孢子集聚成团, 菌丝裂解、扭曲、变短、无分生孢子囊。由此推测, 对虾血蓝蛋白具有抗黑曲菌活性, 其抗菌机制可能与血蓝蛋白抑制黑曲菌孢子生长和促使病态菌丝产生等有关。本研究对揭示血蓝蛋白的非特异性免疫机理和寻找新的对虾疾病免疫学防治途径等具有重要意义。

     

与凡纳滨对虾抗副溶血弧菌有关的6.0 kD 血蓝蛋白降解肽段

以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,采用人工感染、Tricine-SDS-PAGE、Western-blotting、MALDI-TOF/TOF、抑菌实验等方法对血蓝蛋白小分子降解肽段进行研究。结果发现,副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)刺激对虾24 h后,与对照组相比,其血淋巴中新出现5个分子量为6.0~31.0 k D的与兔抗血蓝蛋白抗体呈阳性的小分子条带。其中,分子量为6.0 k D的a条带(命名为HMCp6肽段)与凡纳滨对虾血蓝蛋白具有高度同源性,对副溶血弧菌具有明显的抑菌活性,与对照组相比,存在极显著性差异(P0.01)。由此说明,HMCp6应该是对虾感染副溶血弧菌后所产生的一种新的小分子降解肽段,推测其在对虾抗感染防御中发挥重要作用。     

凡纳滨对虾血蓝蛋白的细菌凝集活性

以凡纳滨对虾（Litopenaeaus vannarnei）为研究对象，运用亲和层析、PAGE、SDS-PAGE、Western-blotting和细菌凝集实验等方法探索凡纳滨对虾血蓝蛋白的细菌凝集活性。结果发现，血蓝蛋白对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、溶藻酸弧菌（Vibrio alginolyticus）、河弧菌（Vibrio fluvialis）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、嗜水气单胞菌（Agromona hydrophila）和金黄色葡萄球菌（Stphylococcus aureus）等6种虾类致病菌具有凝集活性，其凝集活性大小为0．27-1．08mg／L，其中对副溶血弧菌和溶藻酸弧菌凝集活性最大，是哈维氏弧菌的4倍。在此基础之上，选取α-D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-山梨糖、蔗糖、麦芽糖、α-D-乳糖、甘露醇和N-乙酰神经氨酸等9种糖考察其对血蓝蛋白细菌凝集活性的影响。结果显示，血蓝蛋白的细菌凝集活性可被α-D-葡萄糖和N-乙酰神经氨酸所部分抑制和全部抑制，其最低抑制浓度范围为50～100mmol／L。由此推测，血蓝蛋白确实具有细菌凝集活性，这对进一步研究血蓝蛋白的抗菌机理具有重要意义。     

凡纳滨对虾血蓝蛋白酚氧化酶活性的研究

试验结果表明,凡纳滨对虾血蓝蛋白在胰蛋白酶诱导下可表现出一定的酚氧化酶活性,与对照组相比,其酚氧化酶活力单位显著上升。同时,其活性可被D-半乳糖、α-葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇和N-乙酰神经氨酸不同程度地抑制,其抑制率分别为67%、100%、33%、33%、67%和100%。血蓝蛋白与胰蛋白酶孵育后经SDS-PAGE分析和L-Dopa显色,其75 kDa单体呈明显的棕褐色,添加抑制剂N-乙酰神经氨酸之后,其显色强度显著减弱。由此进一步证实凡纳滨对虾血蓝蛋白在胰蛋白酶诱导下确实具有酚氧化酶活性,其活性可被不同的糖所抑制,其发挥活性的单体为75 kDa单体。     

凡纳滨对虾血蓝蛋白与人红细胞的作用靶位

采用亲和层析、SDS-PAGE、Far-Western-blotting、MALDI-TOF/MS等亲和蛋白质组学方法,发现凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血蓝蛋白可与人红细胞膜上一种分子量为27 kD的膜蛋白发生特异性结合,经Mascot搜索引擎检索该蛋白与人红细胞膜蛋白——硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase)具有高度同源性。继而运用生物信息学技术对其相互作用进行分析,结果显示,硫氧还蛋白过氧化物酶与血蓝蛋白在三维结构水平可发生特异性的对接,且其结合位点呈现"锁钥模型"。由此推测,硫氧还蛋白过氧化物酶可能为对虾血蓝蛋白与人红细胞结合靶位之一,所获研究结果为进一步揭示血蓝蛋白的凝血、溶血作用机制等奠定了良好的基础。     

源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的化学合成肽段的免疫调控活性

以源于血蓝蛋白化学合成肽段B1为研究对象,运用蛋白质组学、分子生物学等策略分析其对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的免疫调控活性。结果显示,与对照组比,对虾在受到肽段B1刺激后,血浆中2条分子量分别为65 kD和35 kD的蛋白条带(分别命名为p65和p35)表达水平显著上调。经质谱和Western blot鉴定, p65、p35与包括对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白、葡聚糖模式识别脂蛋白、血蓝蛋白等在内的13个蛋白具有高度同源性,其中p65与兔抗血蓝蛋白抗体呈明显的阳性反应。实时荧光定量PCR检测显示,肽段B1刺激对虾24 h后, 5个质谱鉴定免疫相关基因:血蓝蛋白大亚基、血蓝蛋白小亚基、谷氨酰胺转氨酶、α2巨球蛋白亚型2、葡聚糖模式识别脂蛋白在肝胰腺、鳃和血细胞等组织中mRNA的表达水平显著性(P0.05)或极显著性(P0.01)上调。由此推测,源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的化学合成肽段B1对包括血蓝蛋白在内的多种免疫因子的表达具有一定的调控作用。     

源于凡纳滨对虾血蓝蛋白化学合成肽段的抗黑曲霉活性

选用黑曲霉(Aspergillus niger)为研究材料,采用滤纸片法、显微观察和电镜分析等方法探索12种源于凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血蓝蛋白化学合成肽段的抗黑曲霉活性。结果发现,6种合成肽段(B2、B10、B13、B14、S7和S9)在80μg/mL时能不同程度地抑制黑曲霉的生长,抑制率为30%~100%,其中,S7和B10抑制效果最佳。在此基础上,进一步选用B10分析其对黑曲霉孢子数目和形态的影响。结果显示,B10不仅可以明显延迟黑曲霉孢子的生长,而且还可以显著抑制孢子囊的发育。由此推测,对虾血蓝蛋白可能可以降解产生具有抗黑曲霉活性的功能性肽段,这对进一步阐明对虾血蓝蛋白功能性降解肽段的免疫学活性及其作用机制具有重要价值。     

注射磷脂酰丝氨酸对凡纳滨对虾血蓝蛋白合成、酚氧化酶活性的影响

为研究磷脂酰丝氨酸(PS)对凡纳滨对虾血蓝蛋白合成、酚氧化酶活性的影响,并探讨PS激活凡纳滨对虾血蓝蛋白发挥酚氧化酶活性的机制,实验采用5、10和20μg/mL 3个PS浓度对凡纳滨对虾尾节肌肉进行注射,注射量为50μL,对照组注射生理盐水,各处理组设3个平行组,取样时间为0、6、12、24、36、48和60 h,分别测定了血浆血蓝蛋白含量,肝胰脏血蓝蛋白p75、p77亚基和mRNA的表达以及血浆血蓝蛋白酚氧化酶活性。结果显示:与对照组相比,血蓝蛋白含量在6 h内略有下降,6～36 h内呈峰值变化,24 h时达到最大值(P<0.05);血蓝蛋白亚基p75、p77和mRNA表达在0～36 h内呈峰值变化,12 h时达到最大值(P<0.05);血蓝蛋白酚氧化酶活性在36 h内呈峰值变化,12 h时达到最大值(P<0.05)。研究表明,PS能够激活凡纳滨对虾血蓝蛋白的酚氧化酶活性,表现出明显的时间剂量效应,同时在短时间内引起血蓝蛋白含量下降,随后机体启动血蓝蛋白的合成机制,证实PS是凡纳滨对虾血蓝蛋白发挥酚氧化酶活性的激活因子,为对虾血蓝蛋白免疫活性的研究奠定了理论基础。     

凡纳滨对虾血清中直接与病原菌相结合的主要蛋白的鉴定

以凡纳滨对虾为研究对象,将其血清分别与溶藻酸弧菌,哈维氏弧菌,嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌等4种病原菌孵育,采用亲和蛋白质组学和Western-blotting等分子生物学方法纯化、鉴定和确证其中可与病原菌直接结合的蛋白.结果发现,与对照组相比4种病原菌与虾血清孵育5 h后均可与对虾血清中分子质量约为75 000 (p75) 的蛋白相结合,而孵育15 h后既可与p75相结合,还可与分子质量约为77 000 (p77) 的蛋白以及0～4种不同分子质量的蛋白相结合.经MALDI-TOF/MS分析和Mascot搜索引擎检索,p75和p77蛋白分别与凡纳滨对虾中分子质量约为75 000、77 000的2个血蓝蛋白亚基具有显著一致性.尤其是p75蛋白还可与兔抗血蓝蛋白75 000亚基抗体发生特异性结合.由此推断,凡纳滨对虾血清中与病原菌直接结合的主要蛋白为血蓝蛋白,提示血蓝蛋白全蛋白可能具有抗菌活性.     

凡纳滨对虾饲料添加剂的研究进展

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾,是目前世界养殖产量最高的三大虾种之一,具有对水环境抗逆能力强、营养要求低、生长速度快,虾体含肉量大、肉质鲜美、营养丰富等诸多优点,自1998年来,在广东、广西、海南等省(区)广为     

凡纳滨对虾养殖成本控制浅析

本文主要从养殖管理、饵料选择投喂及苗种选择等几方面介绍了凡纳滨对虾在养殖过程中成本控制技术要点,为指导生产实践提供借鉴。     

凡纳滨对虾热休克蛋白70的原核高效表达

将凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）热休克蛋白70基因（heat shock protein 70，HSP70）克隆到原核表达载体pET-3c中，经酶切和DNA测序鉴定后，将重组质粒转入表达宿主BL21（DE3），在不同温度、时间下经IPTG诱导表达。收集菌液，进行SDS-PAGE和Western blot检测，并用软件Bandscan分析蛋白表达水平。结果表明，成功构建含凡纳滨对虾HSP70基因的重组表达载体pET-3c／HSP70，表达的目标蛋白相对分子量约为72kD，并能与小鼠抗人HSP70抗体特异性结合。37℃诱导5h目标蛋白表达量最高；但25℃诱导目标蛋白的可溶性比例达80％，目标蛋白占全菌总蛋白70％以上，均较37℃为高。     

凡纳滨对虾G蛋白Gβ1亚基的克隆、表达与鉴定

根据G蛋白Gβ1亚基的保守序列设计简并引物,通过简并PCR和RACE技术,克隆到凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)Gβ1基因的全长cDNA序列。利用Blast、DNAstar和Genedoc软件分析,发现该Gβ1编码的蛋白序列与其他物种已知的Gβ1序列具有相当高的保守性,将它命名为pvGβ1。免疫共沉淀分析发现pvGβ1能在体外适当条件下与对虾Gαs或Gαq相互结合。Westernblot-ting分析发现,pvGβ1在对虾身体各部位都有广泛分布,尤其在脑神经、眼和眼柄有大量表达。说明了Gβ1在对虾的神经系统和光信号传导等生命过程中的重要性。     

凡纳滨对虾卵子发生的超微结构

利用透射电镜研究凡纳滨对虾卵子发生过程中细胞内部结构的变化。结果显示,卵原细胞结构简单,代谢水平低,核孔稀少,通过核周池来完成核、质之间的物质交换。卵黄发生前晚期和卵黄发生初期的卵母细胞变化显著：核膜凹凸不平,核仁数量多,核孔密集,大量核仁外排物经核孔输送到卵质中;卵质中胞器极为丰富和发达,代谢活性极强。卵黄发生旺盛期是卵黄大量形成的阶段,卵质边缘还呈辐射状排列了一圈椭圆形皮质棒,细胞出现微吞饮活动并形成卵黄膜。卵黄发生晚期卵质中充满了粗大的卵黄粒和脂滴,胞器锐减。另外,探讨了卵细胞内部结构的变化和卯黄形成的关系以及皮质棒的来源与功能。     

凡纳滨对虾循环水养殖可行性研究

为探寻高产高效的养虾模式,应对环境恶化及疾病蔓延对凡纳滨对虾养殖的制约,以凡纳滨对虾新品种"科海1号"SPF优质虾苗为对象,采用循环水养殖系统及其高效水处理技术,进行了为期90d的循环水养虾试验,以探析循环水养虾的可行性及适宜的养虾条件与管控措施。结果显示:在循环水系统,凡纳滨对虾活动正常,生长快速;在放虾苗750~1200尾/m2的高密度情况下,养成产量平均高达8.6016kg/m2(5.734 4kg/m3),平均存活率64.88%,饵料系数1.22。由此表明,循环水系统适合凡纳滨对虾集约化养殖,并能高产高效。     

凡纳滨对虾虾头蛋白的内源酶水解研究

试验结果表明,凡纳滨对虾虾头蛋白白内源的最优水解条件为:40℃,pH 6,固液比1∶3,7 h,此时得氨基态氮达6.90 mg/g。从水解液检出16种氨基酸,其中含7种人体必需氨基酸。     

凡纳滨对虾真空冷藏保鲜技术研究

研究了凡纳滨对虾在0～2℃条件下的真空保鲜技术。结果表明,在冷藏条件下,真空包装能有效防止对虾体内酚酶作用引起的黑变现象,抑制微生物的活动,降低总挥发性盐基氮的生成量和对虾热烫的失水率,保鲜期可达12d,与对照组相比,延长了6～7d。     

凡纳滨对虾的脂肪营养需求

脂肪在凡纳滨对虾的生命活动中有着重要的作用,主要用于能量代谢和生长发育。虾类的脂肪来源一部分来自于体内的三大营养物质转化,另外主要的来源还是来自于饲料的供给。凡纳滨虾饲料中脂肪和脂肪酸的种类以及含量的不同,直接影响凡纳滨对虾的机体的生长和养殖效益。研究发现凡纳滨对虾幼虾饲料C18:3n-3/C18:2n-6比值为0.44,凡纳滨对虾饲料中脂肪添加量在8.5%~9%之间的效果最好。