刀鲚MOR-2AK2的克隆、序列分析及组织表达

嗅觉是鱼类感知周围环境的重要工具,可能参与生殖洄游的过程。嗅觉由嗅觉受体(olfactory receptor)基因所编码的受体蛋白识别气味分子所引发,主嗅觉受体(MOR)基因是数量最大的一类嗅觉基因,可识别水溶性气味分子。为了弄清刀鲚定居型与洄游型种群的主嗅觉基因差异,本研究通过RACE技术获得了洄游型刀鲚MOR-2AK2基因,其开放阅读框长度972 bp,为单外显子结构,可编码323个氨基酸残基。预测表明,MOR-2AK2基因所编码的蛋白为7个疏水性的α-螺旋跨膜结构,属于G-蛋白偶联受体。对10种组织所作的定量分析表明,MOR–2AK2基因在嗅囊和性腺中的表达量远远高于其他组织器官,并且嗅囊中的表达量还高于性腺中的7~25倍。MOR–2AK2基因的表达量也存在性别差异,其中雌性嗅囊中的表达量约为雄性中的2倍,但精巢中的表达量却约是卵巢中的2倍。序列分析显示,MOR–2AK2基因的5′-UTR区域存在着一段微卫星序列(GT)5,其中定居型多出洄游型14个碱基(GTGTGTGTGTGTTT),这导致了二者所编码的氨基酸序列的相似度仅为84%。这些结果表明,MOR–2AK2基因不但与嗅觉功能有关,也可能参与了刀鲚的性腺发育或生殖洄游过程,同时也可能与定居型种群的形成相关。     

刀鲚POMC基因的cDNA克隆及其应激应答

为了研究刀鲚(Coilia nasus)阿黑皮素原(proopiomelanocortin,POMC)基因的应激应答及调控,克隆了刀鲚POMC基因的c DNA全长。刀鲚POMC基因的c DNA全长2030 bp,编码区699 bp,编码232个氨基酸。二级结构预测显示,刀鲚POMC包括信号肽(signal peptide)、N末端区(N-terminal region,NPP)、促肾上腺皮质激素结构域(adrenocorticotropic hormone,ACTH)、β-脂解素(β-LPH)、α-促黑素(α-MSH)、促肾上腺皮质激素样垂体中叶多肽(CLIP)、γ-脂解素(γ-LPH)、β-促黑素(β-MSH)和β-内咖肽(β-EP)结构域。运用荧光定量的方法检测了该基因在刀鲚不同组织中的表达分布。结果显示,POMC在健康刀鲚的脑高表达,鳃、肾、精巢相对高表达,肝、脾、肠、头肾、肌肉和卵巢中微量表达。运输胁迫后,POMC基因的表达量显著下降(P0.05);10‰ NaCl组4 h和6 h POMC基因的表达量显著上调(P0.05),6 h的表达量恢复至应激前。POMC基因在脂肪代谢及应激调控中发挥重要的功能,本研究结果可为该基因在刀鲚后续育种及应激调控工作提供重要基础。     

刀鲚MSTN基因遗传多态性与生长性状的关联分析

为筛选刀鲚(Coilia ectenes)生长性状遗传改良的分子遗传标记,基于现有刀鲚转录组数据,利用基因克隆技术获得养殖刀鲚肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因的全长序列,采用PCR产物直接测序和SNaPshot技术分别进行基因多态性的筛选和分型,并将不同基因型与刀鲚的生长性状(体长、体高和体质量)进行关联分析。结果显示,养殖刀鲚MSTN基因的DNA序列主要由2个内含子和3个外显子组成,经SNP位点筛选,仅在第1内含子上筛选到2个颠换突变位点(g.564G>T和g.755G>T)和1个转换突变位点(g.786C>T);将3个SNP位点与生长性状进行关联分析发现,SNP位点g.786C>T与刀鲚的体长、体高和体质量呈显著性负相关,具有TT基因型个体的体长、体高和体质量显著低于CC型和CT型(P<0.05),而SNP位点g.564G>T和g.755G>T的不同基因型仅与刀鲚的体高具有一定程度的相关性;3个SNP位点对养殖刀鲚的群体遗传分析显示,刀鲚养殖群体的观测杂合度(H O)、期望杂合度(H E)和多态信息含量(PIC)分别为0.280~0.480、0.332~0.455和0.277~0.351,3个SNP位点均属于中度多态(0.25T有望作为剔除劣质刀鲚繁育亲本的候选分子标记。     

刀鲚水通道蛋白1的分子克隆及高盐作用下的表达分析

采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)克隆获得了刀鲚(Coilia nasus)水通道蛋白1(AQP1)全长cDNA序列。其碱基序列全长为1299 bp,5′端、3′端非翻译区(untranslated regions,UTR)长度分别为107 bp和458 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为777 bp,共编码258个氨基酸。理论等电点是6.13,蛋白分子量为27.1 kD。结构分析表明,刀鲚AQP1具有水通道蛋白家族典型结构特征,包括6个跨膜结构域,2个天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)特征序列,同时还具有AQP1抑制剂含汞化合物的半胱氨酸结合位点。序列同源性及系统进化分析表明,其与同属鲱形目的大西洋鲱的同源性最高(93%),并且与其聚为一支。实时荧光定量分析结果表明,刀鲚AQP1基因在多种组织中有表达,包括脑、鳃、肝、前肠、后肠、中肾、肌肉。高盐度作用后,AQP1在渗透调节作用关键组织鳃、中肾、肠中的表达水平有显著差异(P0.05),体现了AQP1在刀鲚渗透调节中的重要作用。本研究结果可为今后进一步探讨刀鲚渗透调节相关基因的调控机制提供理论参考。     

刀鲚PPARγ基因的cDNA克隆及其应激应答

旨在研究刀鲚(Coilia nasus)过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor, PPARγ)基因的应激调控表达,克隆并获得了刀鲚PPARγ基因的cDNA全长。刀鲚PPARγ基因的cDNA全长1951 bp,开放阅读框1470 bp,预测编码489个氨基酸。刀鲚PPARγ包括4个功能结构域,即A/B区, DNA结合区(DNA binding domain, DBD区),铰链区,配体结合区(ligand binding domain, LBD区)。运用荧光定量PCR (real time quantitative PCR, RT-qPCR)检测刀鲚PPARγ基因在不同组织、运输胁迫和胚胎发育时期的表达。结果显示,刀鲚PPARγ在各组织中均有表达,其中在肝中表达量最高,在脑、肠、心脏、肾、头肾、肌肉中相对高表达,在鳃和脾中微量表达。运输胁迫过程中, PPARγ基因表达显著上调(P0.05),在4 h达到峰值,随后显著降低,但仍高于对照组。PPARγ在胚胎发育时期各时期均表达,其中在受精卵时期高表达,随后表达量急剧降低,并在此后的时期一直处于较低的表达水平。PPARγ基因在应激过程中发挥重要作用,也是胚胎发育过程中重要的基因。本研究为刀鲚的人工繁育和应激调控提供了理论基础。     

缩骨鲫MSTN基因的克隆与组织表达分析

采用同源克隆、生物信息学方法及荧光定量PCR(Real-time PCR)对缩骨鲫(Carassius auratus sogu var.)肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因进行克隆,分析和组织表达状况研究。结果显示:缩骨鲫基因组MSTN基因全长4 737 bp,含有两个内含子和三个外显子;编码区长度为1 128 bp,编码375个氨基酸,包括信号肽(1aa~23aa),TGF-β前肽保守区域(34aa~256aa),TGF-β功能区(281aa~375aa),保守的RXXR蛋白酶酶切位点以及C-端活性区域9个保守的半胱氨酸残基,这与其他物种MSTN相似。此外,缩骨鲫与鲫鱼(Carassius auratus)的MSTN氨基酸序列同源性最高,达到96.1%。以β-actin为内参基因,荧光定量PCR分析表明,MSTN在肌肉中表达量最高;脑、眼、心脏中次之;在肝胰脏、卵巢、肠和肾脏中微量表达。     

我国刀鲚研究进展

刀鲚(Coilia ectenes),属鲱形目、鲲科、鲚属,俗称刀鱼、毛刀鱼、毛花鱼、胡子鱼、鲚鱼等.主要分布于我国黄渤海和东海一带,凡通海的江河如辽河、海河、黄河、长江、钱塘江等均能见到[1].     

刀鲚精子超微结构研究

在光学显微镜及透射电子显微镜下观察刀鲚精子超微结构,并对精子各部分长度进行测定。研究表明,刀鲚精子由头部、中段和尾部（鞭毛）组成。头部在光学显微镜下近梭形,透射电镜下纵切则近圆形。头部无顶体,由细胞核组成,核内染色质致密,空隙少,几乎无细胞质。头部后端偏一侧处有一植入窝,内有中心粒复合体。精子中段位于核后端,由中心粒复合体和袖套组成。中心粒复合体由近端中心粒和远端中心粒组成,两者基本位于一直线上。袖套肥厚的一侧有较多的线粒体和囊泡。尾部分为主段和末段,无侧鳍。主段具典型的“９＋２”的轴丝结构,末段很短,无典型轴丝结构。通过光学显微镜测定,精子头部为（２．３４±０．１６）μｍ,中段（１．４９±０．１８）μｍ,头宽（１．２９±０．２１）μｍ,尾部长（３４．０７±４．３１）μｍ,全长（３７．７７±４．２１）μｍ。     

刀鲚的生殖洄游

我国刀鲚渔业的历史，虽由来已久，但有关专门研究它的生殖洄游规律，还是近年来的事。长江流域已把刀鲚渔业上升到新的阶段。本文介绍长江流域刀鲚生殖洄游规律的问题，希望能对发展刀鲚生产，做好渔汛预测预报等工作起一定参考作用。     

刀鲚精子超微结构研究

在光学显微镜及透射电子显微镜下观察刀鲚精子超微结构,并对精子各部分长度进行测定。研究表明,刀鲚精子由头部、中段和尾部(鞭毛)组成。头部在光学显微镜下近梭形,透射电镜下纵切则近圆形。头部无顶体,由细胞核组成,核内染色质致密,空隙少,几乎无细胞质。头部后端偏一侧处有一植入窝,内有中心粒复合体。精子中段位于核后端,由中心粒复合体和袖套组成。中心粒复合体由近端中心粒和远端中心粒组成,两者基本位于一直线上。袖套肥厚的一侧有较多的线粒体和囊泡。尾部分为主段和末段,无侧鳍。主段具典型的9+2的轴丝结构,末段很短,无典型轴丝结构。通过光学显微镜测定,精子头部为(2.34±0.16)μm,中段(1.49±0.18)μm,头宽(1.29±0.21)μm,尾部长(34.07±4.31)μm,全长(37.77±4.21)μm。     

基于线粒体Cyt-b序列的太湖湖鲚与短颌鲚种群遗传分析

为了解太湖的湖鲚(Coilia nasus taihuensis)与短颌鲚(Coilia brachygnathus)的遗传多样性及遗传分化情况,利用线粒体细胞色素b(Cyt-b)基因,开展了种群遗传学研究。结果显示,47条序列共有变异位点26个,其中,简约信息位点12个,共得到22个单倍型。两物种间Fst值达0.703,分化程度较高,种群间的基因流仅为0.212。湖鲚种群内平均Kimura双参数遗传距离为0.002,短颌鲚种群内为0.001,而湖鲚与短颌鲚种间平均Kimura双参数遗传距离为0.005,湖鲚与短颌鲚种间遗传距离高于湖鲚种群内部遗传距离,也高于短颌鲚种群内部遗传距离。系统发育树和单倍型网络图结果显示,湖鲚与短颌鲚分成2个大的类群,但有1个湖鲚个体与短颌鲚具有共有单倍型。总体结果显示,湖鲚与短颌鲚之间存在明显的遗传分化,Cyt-b序列可用于区分湖鲚与短颌鲚个体。     

基于线粒体Cytb基因和D-loop区序列的高邮湖湖鲚(Coilia nasus)遗传多样性分析

本研究利用线粒体细胞色素b(Cytb)基因和控制区(D-loop)序列作为分子标记,调查了高邮湖湖鲚(Coilia nasus)种群遗传多样性。结果显示,Cytb基因和D-loop区序列碱基A+T含量均高于G+C含量,显示碱基组成具有偏倚性。38条Cytb基因序列检出26个变异位点,定义13个单倍型,单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.716±0.078和0.002 70±0.000 57;40条D-loop区序列检出53个变异位点,定义21个单倍型,单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.906±0.034和0.006 27±0.000 99。13个Cytb基因单倍型之间的遗传距离在0.001~0.014之间,NJ系统进化树显示单倍型聚为1支;21个D-loop区单倍型之间的遗传距离在0.001~0.019之间,NJ系统进化树显示单倍型聚为2支。中性检测结果和歧点分布图均表明高邮湖湖鲚种群稳定,近期没有发生种群扩张。整体来看,高邮湖湖鲚种质资源遗传多样性水平较高,具有高单倍型多样性和低核苷酸多样性的特征。     

双台子河口刀鲚个体生殖力

于2015年5~6月在辽河双台子河口水域采捕176尾性腺发育到Ⅳ期的刀鲚Coilia nasus雌鱼,测量其体长(L)、体质量(W)、净体质量(W_o)、性腺重(W_l)和卵径等生物学指标。取左侧鳃盖骨鉴定年龄,用重量法计数个体绝对生殖力(F),计算体长相对生殖力(F_L)和体重相对生殖力(F_w),用5种数学模型及多元逐步回归方程拟合个体生殖力与生物学指标的关系。结果显示:样本由4~+~6~+龄组成,个体绝对生殖力(F)17 968~116 935粒,平均44 995粒;体长相对生殖力(F_L)66~297粒/mm,平均为145粒/mm;体质量相对生殖力(F_w)192~710粒/g,平均为362粒/g。F和F_L与体长(L)、体质量(W)、净体质量(W_o)、性腺重(W_l)、成熟系数(GSI)和年龄呈极显著正相关,与肥满度(K)相关关系不显著。F_w仅与W_l、GSI极显著正相关,和其他指标的相关性不显著。多元逐步回归显示,F与W和W_l密切相关,相关式为:F=-15 623.878+1 158.377W_l+324.104W(n=176,R=0.851;DW=1.890,P0.01);F_L与W_l和K密切相关,相关式为:F_L=-68.850+3.868W_l+302 687.076K(n=176,R=0.728;DW=1.743,P0.01);F_w均与L和GSI密切相关,相关式为:F_w=207.215-5.17L+7.5918GSI(n=176,R=0.646;DW=1.849,P0.01)。第Ⅳ~Ⅴ期刀鲚卵巢中,卵径变化范围在0.55~1.05mm之间,平均0.81mm。依据卵径频率分布推测,刀鲚属单峰一次性产卵鱼类。     

鄱阳湖同时存在溯河洄游和淡水定居的刀鲚

为确认鄱阳湖中是否仍存在有溯河洄游的刀鲚个体,利用X射线电子探针微区分析技术(EPMA)研究了采自鄱阳湖星子县水域2尾刀鲚个体矢耳石的锶和钙微化学特征。定量线分析结果显示,上颌骨较短个体(PYCB02)的耳石锶钙比值(即Sr/Ca×1 000)为稳定的低值(1.66±0.54),反映了其淡水定居的生活习性;而上颌骨较长个体(PYCE05)的锶钙比值波动显著,不仅具有对应淡水生活的低值(1.82±0.50),而且出现了对应于海水生活的高值(5.79±0.91),显示出其溯河洄游的"履历"。这些结果更得到了耳石元素面分布分析结果的支持。这两种截然不同的耳石微化学特征类型首次直观地反映和证实了目前距长江河口约800 km的鄱阳湖中同时存在有溯河洄游和淡水定居的两类刀鲚个体。     

菊黄东方鲀与长江刀鲚池塘混养试验

为探索适合长江刀鲚的新的养成模式,于2020、2021年两个年度在主养菊黄东方鲀的池塘中进行了混养长江刀鲚的试验,每年养殖周期为5月中旬至11月底。试验结果：2020、2021年,菊黄东方鲀的单位面积产量分别为2 812.5、3 007.5 kg/hm²,收成规格分别为261.5、268.5 g;长江刀鲚的成活率分别为57.45%、66.90%,收成规格分别为38.6、50.7 g,单位面积产量分别为73.50、112.65 kg/hm²。试验结果表明,在菊黄东方鲀池塘中混养长江刀鲚不会影响主养对象的养成效果,且在不额外增加日常养殖生产成本(不单独投喂饵料或饲料)的情况下,能保证长江刀鲚的养殖成活率和收成规格,从而提高了养殖生产经济效益。     

1+龄长江刀鲚与暗纹东方鲀池塘混养试验

为探索适合刀鲚的池塘养殖新模式,分别在淡水和半咸水环境下开展了1⁺龄刀鲚与暗纹东方鲀的混养试验。试验结果表明,刀鲚与暗纹东方鲀在半咸水环境下混养,在产量、成活率、平均出塘规格等方面具有明显优势,当刀鲚放养密度为3 000尾/hm²时,单位面积产量最高可达116.70 kg/hm²,该塘刀鲚成活率为68.16%,平均出塘规格可达57.11 g,体质量在50 g以上的比例为61.66%。     

长江刀鲚鱼种驯食浮性颗粒饲料试验研究

采用灯光诱鱼协同缓沉饲料驯食过渡至浮性颗粒饲料投喂的方法,高密度驯养长江刀鲚(Coilia nasus)鱼种,建立了8~10 cm刀鲚鱼种转食浮性颗粒饲料的人工饲养技术,为刀鲚的集约化养殖提供技术支撑。结果显示,经16 d的驯食,刀鲚在投饵后1 h之内吃完饲料,驯食期间刀鲚平均成活率为75.05%。闪光诱鱼比常光诱鱼更利于刀鲚鱼种驯食浮性颗粒饲料;先期对浮性颗粒饲料处理成缓沉投饲驯食并逐步过渡至完全摄食浮性颗粒饲料的操作能让刀鲚鱼种在短期内(16 d)完全摄食浮性颗粒饲料。     

1+龄刀鲚与暗纹东方鲀成鱼的混养自繁试验

为提高刀鲚和暗纹东方鲀的池塘养殖效益以及获得大规格刀鲚鱼种,2021年在上海市水产研究所奉贤科研基地的4口池塘中进行了1⁺龄刀鲚(3 000尾/hm²)与暗纹东方鲀成鱼(12 000尾/hm²)的混养试验以及刀鲚生态自繁养殖试验。经过132 d的养殖,刀鲚出塘规格达到24.99～59.90 g/尾,成活率为15.0%～54.1%,其中有3口试验池塘获得了大规格刀鲚自繁鱼种,数量分别为2 515、2 871、3 399尾;暗纹东方鲀出塘规格在280.2～296.3 g/尾,单位面积产量达到3 372.8～3 502.5 kg/hm²,成活率达97.8%～100.0%。