牙鲆选育家系生长性状的因子分析

记录了2009年建立的12个牙鲆家系240日龄个体的体质量、全长、体长、头长、躯干长、吻长、尾柄长、尾长、体高,和尾柄高等10个生长性状,对这12个家系的生长性状进行了因子分析。结果表明：第一至第四公因子对变异的方差贡献率分别为81．36％、10．12％、5．3％,和1．31％,累积贡献率达98．1％,表明这4个公因子很好地反映了所控制的10个生长性状及其相互作用关系。贡献率最高的第一公因子包含了大多数生长性状,其因子得分排序在前两位的家系为F11和F4,与这2个家系生长性状表型值排序相一致,表明这两个家系具有结构较好的生长构成性状和较高的性状表型值,可作为培育快速生长型牙鲆新品种的候选家系,进行生产验证和推广养殖。     

牙鲆抗鳗弧菌病家系筛选及其分析

2007年以从养殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)中筛选出的抗病选育群体、从日本引进的日本群体以及从黄海捕捞的野生群体为基础,进行各种组合方式的交配,建立了63个牙鲆家系;2008年又建立了30个家系。对2007年培育的59个家系和2008年培育的30个家系进行了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染实验,结果表明,不同家系间的抗病力存在极显著的差异(P0.01)。从2007年培育的59个家系中筛选出4个抗病家系,鳗弧菌感染后存活率达到50%以上;2008年的30个家系中5个家系抗病力较强,鳗弧菌感染后的存活率达到60%以上。2008年培育的30个家系其4月龄和6月龄的感染后存活率的相关系数为0.403(P0.05),表明不同生长时期的感染结果具有一致性。230d的体长和体质量与对鳗弧菌的抗病力存在显著的相关关系(P0.05),皮尔森相关系数分别为0.282和0.237。研究发现,日本群体与抗病选育群体的杂交后代抗病性能表现优异,可以通过日本群体与中国群体间的杂交进行遗传改良,达到培育出高产、抗病牙鲆新品种的目的。     

牙鲆抗淋巴囊肿病家系选育及生长和抗病性能分析

为了选育抗淋巴囊肿的牙鲆(Paralichthys olivaceus)新品种,2015年建立了5个普通家系(C1~C5)、3个雌核发育家系(G1、G2、G3)和1个对照组,在淋巴囊肿病高发养殖场进行自然染毒实验,统计各家系的抗病保护率。同时对各家系120 d、180 d、240 d和300 d时的生长性状进行跟踪测量和比较。结果表明,各家系牙鲆在不同时期有各自不同的生长规律,呈现出家系间生长规律的不一致性。但在所有家系中,家系G2各个时期的生长表现始终排名靠前。390 d统计抗病保护率的结果显示,对照组的抗病保护率只有59.57%,而经选育所有实验组的抗病保护率都在60%以上,最高达97.20%(家系G2)。但总体上,390 d时牙鲆淋巴囊肿抗病和患病个体间体重和体长差异均不显著;体重、体长与抗病保护率为正相关,但相关性均不显著。家系G2抗病个体的平均体重显著高于患病个体(P0.05)。以G2家系为基础,继续进行选育,有望获得牙鲆抗淋巴囊肿速生新品种。     

牙鲆连续三代抗鳗弧菌病家系的筛选与分析

为了培育牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)病的品系或品种, 2009和2012年利用中国牙鲆抗病群体、从日本和韩国引进的牙鲆群体以及2007年和2009年从大量牙鲆家系中选留的优良家系为亲本, 通过巢式杂交、三元杂交及雌核发育等方法, 分别于2009年和2012年建成牙鲆家系43个和65个, 选取2009年的33个家系和2012年的43个家系进行鳗弧菌感染实验, 共筛选出13个抗病家系, 其中3个家系的存活率极显著高于对照组(P<0.01), 另外10个家系的存活率显著高于对照组(P<0.05), 这13个家系包含F3家系、雌核发育一代和二代家系各1个, F2家系3个, 在以上6个家系中,除了1个F2家系, 其他家系的亲本均来自于抗病家系且鳗弧菌感染存活率的变异系数都低于10%。对连续三代抗病家系进行分析, 发现在上述13个抗病家系和2007年筛选出的3个抗病家系共16个抗病家系中有13个家系来自于中国牙鲆抗病群体相关, 结果表明, 部分F1、F2、F3和雌核发育家系较好地遗传了其亲本的抗病性能, 抗病性能稳定, 为培育抗鳗弧菌病的牙鲆品系或品种奠定了基础。

     

牙鲆仔鱼肠道白浊病病原菌的分离鉴定

对工厂化育苗中患肠道白浊病的牙鲆仔鱼进行了病原菌的分离与特性鉴定,从众多患病仔鱼的肠 道中均分离到几乎纯一的细菌,并对仔鱼的分离培养物进行形态特征检查及理化特性鉴定,结果初步表明所 分离鉴定的病原菌为鳗弧菌(Vibrio anguillarum),为牙鲆仔鱼肠道白浊病的致病菌,测定了对常用抗菌类药 物的敏感性,结果表明分离菌株对环丙沙星等11种药物高度敏感,对林可霉素等4种药物中度敏感,对利福 平等3种药物耐药。     

不同模型估计牙鲆家系间生长性状遗传参数的比较分析

利用中国水产科学研究院北戴河中心实验站2006~2009年间牙鲆选育家系240日龄生长性状的测定记录,对4种不同动物模型估计的生长性状遗传参数进行了比较分析。不同模型分别包括了加性遗传效应、母体遗传效应和全同胞效应。利用MTDFREML程序采用非求导约束极大似然法(DFREML)估计各模型中的方差组分。用似然比检验对不同模型的差异进行检验。结果显示,对于牙鲆240日龄体重、体长和体高,母体遗传效应和全同胞效应都有显著的影响,应用模型Ⅳ进行分析,体重、体长和体高的遗传力分别为0.30、0.32和0.39。体重与体长、体高的正向遗传相关分别为0.93和0.95;体长与体高的正向遗传相关为0.90。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus)家系生长性状遗传效应分析

牙鲆(Paralichthys olivaceus)优良养殖新品种培育是防止其品种退化和提高经济效益的主要途径,数量性状遗传评估是牙鲆育种的主要方法之一.本研究利用已建立的牙鲆核心群体建立42个牙鲆家系,分别测量140、170、200、380日龄各家系生长相关性状(体重、全长和体宽),通过MINQUE、REML和BLUP方法对其进行数量遗传分析.结果显示,不同时期生长性状的变异系数为10.56％-38.62％,其中,体重的变异系数最大,全长和体宽的变异系数都较小,不同性状的变异系数均随着日龄的增加而减小.3个性状的加性方差分量比率为(0.13±0.01)-(0.29±0.06),随机方差分量比率为(0.71±0.06)-(0.87±0.01),狭义遗传力为(0.13±0.01)-(0.29±0.06),广义遗传力为(0.15±0.01)-(0.54±0.06),以上遗传参数均达极显著性水平(P＜0.01).综合比较3个性状在不同时期的遗传效应,结果发现,F0990、F1005、KS和F0719这4个群体亲本都为极显著正向效应,F0751、F0768、F0780、F09121、F0927和RS这6个群体亲本都为极显著负向效应(P＜0.01),其余的亲本均为一般效应.表型相关系数在0.82-0.96之间,遗传相关系数在0.72-0.97之间.利用BLUP方法对380日龄测量的数据进行育种值估算,结果发现,亲鱼体重育种值为14.63-100.05,其中,体重育种值最高的亲鱼个体为F1005-8、F09119-11、F09125-4、F0915-57、F09104-12、F1264、F0908-38、F0927-20、F1005-53、F0990-6、F09125-7、F0751-14和F1005-42.家系平均体重育种值为20.87-35.60,其中,平均体重育种值最高的家系为F1416、F1428、F1442、F1418、F1427、F1408、F1402、F1412和F1446.以体重育种值为依据选留的家系育种值与根据表型值选留的家系育种值比较可得:体重育种值选择比其表型值的选择效率高81.91％,育种值选育更好.本研究为牙鲆优良家系的建立及新品种的培育筛选出了性状优良的亲本和家系,同时为牙鲆育种计划的制定提供了重要理论依据.     

牙鲆家系亲权鉴定的微卫星DNA标记分析

为准确进行不同家系的亲权鉴定,筛选具有高亲本排除概率的微卫星DNA标记,从牙鲆选育基础群体中挑选性腺发育良好的雌雄亲本各10尾建立全同胞家系10个,从独立饲养的每个家系中随机选取30尾个体组成系谱结构已知的家系群体,从混合培育的子代群体中随机选取200尾个体组成系谱结构未知的混合群体。48个微卫星DNA标记选自牙鲆第二代遗传连锁图谱,且均匀分布于24个连锁群上,每个连锁群2个标记。家系群体的遗传分析结果发现,10个拥有丰富遗传多态性的微卫星DNA标记表现出高的亲本排除概率,其Excl1和Excl2的范围分别为0.655~0.719和0.792~0.837。随鉴定所用微卫星DNA标记数目的增加,累计排除概率逐步升高。当使用8个微卫星DNA标记鉴定时,累计排除概率达到100%。利用这些标记开展混合群体的亲权鉴定,显示共有13个雌雄个体参与繁殖过程,不同亲本配组产生的后代数量存在差异,亲本与后代群体之间的各项遗传学统计指标不存在明显差异。研究表明,筛选出具有高亲本排除概率的微卫星DNA标记能够有效进行牙鲆家系的亲权鉴定,可以作为今后开展家系选育与DNA分子标记联合育种的候选标记。     

抗迟缓爱德华氏菌病牙鲆家系的筛选与分析

牙鲆(Paralichthys olivaceus)养殖病害日益严重,迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是牙鲆养殖中的主要致病菌,带来了极大的经济损失,为了培育出对该病抵抗能力强的牙鲆新品种,2014年4–6月间,利用我们长期以来建立和筛选出来的牙鲆抗病群体和家系的亲鱼,通过杂交,自交,雌核发育建立47个家系,9–10月间,对其中39个家系进行感染实验,先用少量鱼进行预实验摸索出半致死浓度,然后再进行正式感染实验,感染数量为每个家系80尾。各家系的存活率范围为1.19%~51.19%,最终平均存活率为20.29%,认为存活率高于30%的7个家系为抗病力强家系,存活率在20.29%~30%的9个家系为抗病力一般家系,平均存活率以下的23个家系为抗病力弱家系。1406#家系抗病力最强,它为1005#家系的自交后代,而其他抗病力强家系也大多是1005#、09104#、0915#的后代。而09104#为0768#的后代,并且0768#抗鳗弧菌病能力强。1005#为韩国群体自交后代,0915#为韩国群体和日本群体杂交后代。这些抗病力强的牙鲆可以作为新品系进行推广养殖,可望减少牙鲆腹水病发生。     

牙鲆抗迟缓爱德华氏菌病家系的继代选育与早期速生家系筛选

迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是牙鲆(Paralichthys olivaceus)的主要致病菌之一,严重影响牙鲆养殖业的可持续发展。本研究主要以2012、2013和2014年选育的优质抗病牙鲆家系为亲本,于2016年建立和培育了28个牙鲆家系,包括F3代家系4个、F_4代家系23个和对照家系1个。经过60 d的鱼苗早期生长性能测定和迟缓爱德华氏菌人工攻毒感染实验,筛选得到7个高抗病力(攻毒感染存活率66%)的家系,包括1个高抗病、速生家系(F1639),攻毒存活率达77.23%,比28个家系的平均值高32.75%,全长日增长率达到0.174 cm/d,比28个家系的均值高0.023 cm/d。该家系亲本源自2007年[F0750,抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)病家系]、2009年(F0927,抗鳗弧菌病家系)和2014年(F1421,抗迟缓爱德华氏菌家系)选育的抗病力强家系。历代攻毒感染实验的结果显示,选育的牙鲆家系抗病力逐代提高,说明通过家系选育(同胞选择),能够有效提高选育后代的抗病力。本研究进一步证明,家系选育是培育鱼类抗病优良品种的有效途径,为进一步培育出生长更快、抗病力更强的牙鲆新品种奠定了良好的基础,也为牙鲆对爱德华氏菌抗病性能的遗传解析和抗病机理研究提供了良好的遗传材料,对其他鱼类抗病良种选育具有重要指导作用和应用价值。     

牙鲆体质量与形态性状的异速生长分析

为分析牙鲆（Paralichthys olivaceus）体质量与形态性状之间异速生长的遗传规律,通过人工受精的方法建立牙鲆19个全同胞家系,测量了牙鲆不同日龄的体质量和形态性状。采用逐步回归方法建立最优联合异速生长模型,将此模型镶嵌到体质量动物模型的每个遗传和环境效应中,进一步分析对多个形态性状异速生长遗传规律。静态异速生长分析表明：体质量与全长之间存在最大异速生长指数（1.415 5）,表现为正异速生长,剩余形态性状与体质量之间的异速生长指数为0.061 5~0.718 0,皆表现为负异速生长。全长与尾柄高之间异速生长指数的正遗传相关最大（0.907 8）;全长与尾柄长之间的负遗传相关最大（0.946 8）。不同模型通过统计标准比较,确定模型Ⅰ为进行牙鲆动态异速生长分析的最优随机回归模型。     

牙鲆主要生长性状与体质量的灰色关联度分析

采用灰色关联分析方法对牙鲆(Paralichthys olivaceus)10个选育家系的9个生长性状与体质量的关联度进行分析和评价。首先对体质量与生长性况进行数列无量纲化处理,计算出每个生长性状与体质量的关联系数和关联度,根据灰色关联度构建两两比较判断矩阵定量分析各生长性状对体质量的影响度。结果显示,每个生长性状与体质量的关联度由大到小依次为:全长(0.875 8)、体长(0.859 3)、尾柄高(0.830 7)、躯干长(0.827 7)、头长(0.803 5)、尾长(0.781 2)、体高(0.740 2)、吻长(0.665 7)和尾柄长(0.654 0)。体质量的主控因素为:全长、体长、尾柄高和躯干长4个性状,影响度分别为:28.51%、21.62%、16.41%和11.69%,四者的影响度总和达到78.23%。分析表明,与体质量关联度最大的分别是全长、体长、尾柄高和躯干长,且它们对体质量的影响度最高,可以将其作为培育高产牙鲆的重要评价指标,以提高选择效率。本研究旨在为制定理想的牙鲆选育目标、提高育种效率提供理论依据,同时拓展灰色关联度方法在水产动物育种研究中的应用。     

牙鲜幼鱼能量代谢的初步研究

对个体重２．５～８７．６ｇ的牙鲆幼鱼的代谢进行测试。结果表明：温度和体重对牙鲆幼鱼的耗氧率及二氧化碳排出率有明显的影响;牙鲆幼鱼的呼吸商为０．８２±０．０８,氧氮比为２３．８±６．６,其能源物质以蛋白质和脂肪为主;牙鲆在盐度为３０、２５、２０和１５的水中,平均代谢率分别为３．０８、３．０７、３．８７和３．２８Ｊ／ｇ·ｈ,说明牙鲆幼鱼适盐较广,在本实验盐度阈值内,对鱼体代谢基本没影响。     

牙鲆淋巴囊肿病的病理和病原分离

应用常规显微和亚显微技术观察和分析患淋巴囊肿病养殖牙鲆(Paralichthys olioaceus)的病理学变化，利用差速离心和蔗糖密度梯度离心技术分离其病原——淋巴囊肿病毒，并利用牙鲆细组织细胞系FG—9307为感染基质，观察淋巴囊肿病毒引起的细胞病理变化。结果表明，患病牙鲆的囊肿组织是一些淋巴囊肿细胞的集合体，这些囊肿细胞排列紧密，直径为10—100μm，细胞近圆形，细胞质内散布有大量的嗜碱性包涵体，且多数集中在细胞的边缘部分；囊肿细胞内含有大量病毒粒子，其衣壳外形呈六角或五角形，直径为150—230nm，大多数病毒粒子中央有一致密的核，核外周包围着一双层核衣壳，核衣壳的表面可见一圈把手样亚单位。以患病牙鲆囊肿物制备的上清液接种细胞，7d内未见细胞异常，经盲传2—3代后，细胞出现较明显的细胞病变效应。     

温度对牙鲆皮肤黏液抗体产生的影响

在9℃、15℃、21℃和26℃4种不同水温下,用淋巴囊肿病毒(LCDV)灭活疫苗腹腔注射牙鲆,应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)研究了其皮肤黏液中特异性抗体水平的变化,以分析温度对牙鲆皮肤黏液抗体产生的影响.ELISA结果表明,9℃和15℃水温下牙鲆黏液OD值分别在注射LCDV后第9周和第7周达到峰值(9℃:OD=0.179; 15℃:OD=0.233); 21℃水温下OD值上升最快,5周达到峰值(0.316); 26℃水温下OD值较21℃无显著差异,也于5周达到峰值(0.295).采用硫酸铵分步盐析等技术粗提不同温度下OD值最高时的牙鲆皮肤黏液中的免疫球蛋白(Ig),SDS-PAGE检测发现,各温度组黏液蛋白中均含有72 kD和26 kD蛋白条带.Western blotting结果显示,抗牙鲆血清Ig重链的单克隆抗体只与黏液蛋白中72 kD条带发生反应,确定为牙鲆皮肤黏液Ig重链.综上结果表明,牙鲆在最适生活温度(21℃)下,抗体应答强度最大.牙鲆粗提黏液蛋白中Ig的初步确定,为探索牙鲆黏液免疫机制提供了材料.     

牙鲆经注射和浸泡免疫鳗弧菌灭活疫苗后7种免疫相关基因表达的变化

  制备鳗弧菌(Vibrio anguillarum)全菌灭活疫苗, 采用腹腔注射和浸泡两种方式分别免疫牙鲆(Paralichthys olivaceus), 于免疫后0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、7 d、14 d分别取牙鲆脾、头肾、鳃3种组织, 提取mRNA, 应用实时荧光定量PCR法检测3种组织中白介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)α、主要组织相容性复合体(MHC)MCHⅠ、MHCⅡ、T细胞表面受体CD4、T细胞表面受体CD8、 免疫球蛋白(Ig)M 7种免疫相关基因的表达。结果显示, 两种方式免疫后各基因表达量均出现显著上调。注射组3种组织中, IL-1β、TNFα基因的表达高峰出现时间在12~24 h, MHCⅠ、MHCⅡ、CD4、CD8的表达高峰出现在48~72 h, IgM的表达高峰出现在免疫后7 d, 各基因表达量最高值是对照组的2~70倍; 浸泡组3种组织中, IL-1β、TNFα基因的表达高峰出现在免疫后12~48 h, MHCⅠ、MHCⅡ、CD8表达高峰出现在48~96 h, 但CD4在头肾和鳃中表达高峰出现在72 h, 在脾中表达高峰出现在7 d, IgM在鳃中表达高峰出现在96 h, 在脾和头肾中表达量在14 d内逐渐上升, 各基因表达最高值是对照组的2~20倍。结果表明, 注射组各组织基因的转录水平均高于浸泡组, 且脾、头肾中表达量最高值出现时间早于浸泡组, 但鳃中各基因峰值出现时间晚于浸泡组。研究结果为疫苗的免疫途径及免疫效果评价提供了基础数据。