肺炎克雷伯菌环介导等温扩增技术检测方法的建立

本研究旨在建立一种环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测食品中的肺炎克雷伯菌。选取肺炎克雷伯菌特有的毒力基因区域，设计2对引物（1对内引物、1对外引物），进行体外恒温扩增反应。对反应体系内的甜菜碱、核酸原料（dNTPs）、内外引物比例、Mg²⁺浓度、反应时间和温度进行优化和选择，并进行特异性和灵敏性试验检测。应用建立的LAMP方法对灭菌鸡肉人工污染加标样品进行检测。结果表明，通过优化试验，筛选到最优反应体系和反应条件；应用优化后的LAMP反应体系对包括肺炎克雷伯菌在内的18种常见微生物进行特异性检测试验，特异性良好。肺炎克雷伯菌LAMP反应体系对基因组的最低检测限是0.875 pg/μL，比传统PCR方法灵敏性高100倍。对人工鸡肉阳性样品进行检测，检测限为30 CFU/mL。本试验成功建立了一种能检测食物中致病肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法，该方法利用2对引物针对肺炎克雷伯菌目的基因6个区域进行体外恒温核酸阶梯性扩增，灵敏性更高，反应时间更短，检测成本更低。     

副鸡禽杆菌LAMP检测方法的建立

应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了快速特异的检测副鸡禽杆菌的方法。利用在线引物设计软件Primer Explorer Version 4.0,针对副鸡禽杆菌16SRNA基因序列设计两组LAMP引物,并对副鸡禽杆菌特异性DNA的扩增条件进行优化,评价所建立LAMP的特异性和灵敏性。结果显示,优化后的反应条件为65℃恒温反应60min,内引物1.60pmol/μL、外引物0.20pmol/μL。该LAMP对13株副鸡禽杆菌均发生了扩增反应,而对大肠埃希菌、禽多杀性巴氏杆菌、空肠弯曲杆菌等14株其他病原微生物没有扩增反应;该LAMP最低检出量为0.17pg/反应,敏感性远高于常规PCR的56pg/反应。结果表明,所建立的副鸡禽杆菌LAMP具有快速、高效、方便操作等特点,适用于基层兽医部门进行副鸡禽杆菌的快速检测。     

兔源性肺炎克雷伯氏菌PCR检测方法的建立

试验拟通过建立兔源性肺炎克雷伯氏菌的PCR检测方法,为规模化兔场肺炎克雷伯氏菌的检测提供理论依据。以肺炎克雷伯氏菌的保守序列khe基因设计特异性引物,建立PCR反应体系,并对反应条件进行优化。选择不同菌株进行PCR扩增来检测该方法的特异性。接着对不同浓度的肺炎克雷伯氏菌DNA进行PCR扩增,以检测该方法的敏感性。对PCR反应体系和反应条件进行优化,结果显示当引物浓度为50μmol/L,退火温度为52℃时,特异性条带最亮。特异性试验结果显示只有肺炎克雷伯氏菌有特异性条带出现。敏感性试验结果显示建立的PCR检测方法能检测出的DNA最低浓度为1.83 ng/μL。研究所建立的PCR检测方法具有良好的敏感性和特异性,适合肺炎克雷伯氏菌的检测。     

大肠埃希菌ETT2毒力岛ECs3703基因和HPI毒力岛irp2基因双重LAMP检测方法的建立

根据GenBank中大肠埃希菌ETT2毒力岛保守基因ECs3703和HPI毒力岛的保守基因irp2分别设计一套LAMP引物,在同一体系中进行LAMP扩增,通过对体系Mg2+、dNTP、内引物及反应温度和反应时间等进行优化,建立了在60℃恒温下对大肠埃希菌ETT2和HPI毒力岛进行同步检测的LAMP方法,并进行了特异性和灵敏性试验。结果显示,所建立的双重LAMP检测方法同时检测ETT2和HPI毒力岛大肠埃希菌检测限均可达到100fg,比常规PCR灵敏度高100倍。利用该方法对8株非大肠埃希菌进行LAMP扩增,结果均为阴性。用该方法对采集的20份临床样品进行检测,与双重PCR检测结果一致。结果显示,该双重LAMP方法可用于大肠埃希菌ETT2和HPI毒力岛的同步快速检测,可作为临床疫病诊断的有效手段。     

H5亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测技术

根据GenBank中H5N1亚型流感病毒HA基因保守区的序列,设计1组对应HA序列6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增,建立RT-LAMP反应体系,优化LAMP反应条件,最佳等温扩增反应条件为65℃保温60min。扩增后产物加入核酸染色剂SYBRⅠ和4 mmol/L Mg2+,结果可视。扩增产物可用特异性内切酶KpnⅠ进行酶切鉴定。用已建立的RT-LAMP技术检测临床样品,检测结果与RT-PCR方法一致。RT-LAMP技术整个检测过程只需1~2 h,不需要PCR仪和成像系统,仅需要一恒温水浴锅即可完成试验。通过特异性、敏感性试验,验证了建立的RT-LAMP技术可以作为一种操作简单,灵敏性、特异性高的检测H5亚型禽流感病毒的方法。     

LAMP技术快速检测食源性沙门菌hisJ基因方法的建立

为建立一种快速检测食源性沙门菌的环介导等温扩增(LAMP)方法,依据Gen Bank公布的沙门菌属hisJ基因序列,利用Primer Explorer软件设计LAMP扩增所需引物,通过LAMP反应条件的优化,建立沙门菌LAMP快速检测方法。选取鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌、伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌及其他6种常见食源性细菌进行特异性试验,并对其灵敏性进行了评价。针对hisJ基因建立的LAMP方法,在63℃水浴1 h便可完成沙门菌的有效扩增,该方法的灵敏度达到102cfu/mL,高于PCR方法 100倍,特异性试验结果显示只有沙门菌LAMP扩增结果呈阳性。本研究建立的沙门菌hisJ基因LAMP检测方法具有较强的特异性及灵敏性,可用于食品中沙门菌的快速检测。     

宠物食品中肉毒杆菌LAMP检测方法的研究

为研究宠物食品中肉毒杆菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法,本试验根据肉毒杆菌特异性基因片段(Ntn H)设计1组引物,应用LMAP技术,通过扩增肉毒杆菌和14种非肉毒杆菌基因片段,对建立的LAMP反应体系进行最佳温度及反应时间筛选试验、采用浊度法和染色法进行特异性试验以及与PCR对比的敏感性试验。结果表明:建立的LAMP反应体系只扩增肉毒杆菌基因,特异性良好;体系最佳反应温度为64℃,最佳反应时间为60 min;最低检测浓度为0.0001 pg/μL,比PCR高出10倍。本试验所建立的方法特异性好、灵敏度高,反应时间短,适用于宠物食品中肉毒杆菌的检测。     

沙门菌LAMP可视化检测方法的建立与应用

建立沙门菌病原体的一种可目视化环介导等温扩增技术(LAMP),实现对沙门菌的高效快捷检测。针对沙门菌的invA基因的高度保守区域,设计一套特异性引物,优化LAMP扩增反应体系和条件,并对该方法的特异性、灵敏性和人工污染样品以及临床样品分别进行检测。与传统的细菌分离与鉴定、PCR和real-time PCR方法进行敏感性比较。该方法优化后的最佳反应体系为内外引物浓度比例为3∶1,dNTPs为2.5μL,MgSO_4为1.5μL,2.5μL甜菜碱(10mol/L),1μL Bst 2.0DNA聚合酶,在62℃恒温条件下反应50min,可以特异性检出沙门菌,而对其他非沙门菌病原的检测结果为阴性。该方法的最低检测线为1.0×10~2 CFU/mL,灵敏度是常规PCR检测方法的1 000倍,与real-time PCR方法的灵敏度基本接近;针对人工污染沙门菌的鱼粉其检测灵敏度为5.0×10~2 CFU/mL;对临床样品的检出率为65.4%,与传统检测方法的检出率一致。本研究建立的LAMP检测沙门菌的方法特异性强、灵敏度高、操作简便、效能高和可视化,为基层监管部门和畜牧兽医工作者对于沙门菌病原的监控和初步筛选提供了技术保障。     

生鲜乳中金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的建立

针对金黄色葡萄球菌的TRAP基因设计LAMP引物,建立了金黄色葡萄球菌环介导等温扩增(LAMP)方法,进行了特异性和灵敏性试验,并对临床乳样进行初步检测。结果显示,建立的LAMP检测方法特异性良好,与生鲜乳中常见的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、无乳链球菌、粪肠球菌无交叉反应,灵敏度为10CFU/mL。分别用传统分离鉴定法与LAMP法对50个乳腺炎乳样进行检测,传统方法分离得到S.aureus 14株,LAMP法检测得到S.aureus 14株,符合率100%,阳性检出率均为28%。结果表明,成功建立了生鲜乳中金黄色葡萄球菌的快速检测方法,该方法无需特殊的仪器,有利于在临床和基层进行推广。     

肺炎克雷伯氏菌PCR检测方法的建立

依据GenBank中肺炎克雷伯氏菌的部分已知序列,利用Primer Premier 5设计两对引物,通过优化反应条件,建立一种检测肺炎克雷伯氏菌的诊断方法。特异性和敏感性试验显示,该方法能特异地检测肺炎克雷伯氏菌,其最低能检测的细菌浓度为1×10~(-4)Mcf,整个检测扩增在3h内完成。该结果表明本试验所建立的PCR方法的灵敏度及特异性均较好,可用于快速检测肺炎克雷伯氏菌。     

虾肝肠胞虫LAMP检测技术的建立与应用

本试验根据虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)18S的保守序列设计4套环介导等温扩增(LAMP)引物,从中筛选出一套引物对LAMP反应体系(Bst DNA聚合酶浓度、内外引物浓度比、dNTP浓度、Mg~(2+)浓度)和反应条件(温度)进行优化。并对优化后的LAMP反应体系和条件进行特异性、灵敏度及精密度验证。特异性试验表明,该方法能特异性检测虾肝肠胞虫,而与其他病害的核酸没有交叉反应;灵敏度试验表明,可检测浓度为10 fg/μL的质粒DNA,制作的标准曲线可对虾肝肠胞虫进行定量分析。重复性试验结果表明,该方法Ct值的变异系数为2.88%～3.02%,具有良好的稳定性。而对于人工侵染的虾肝肠胞虫样品,LAMP方法可检测低至0.44 pg/μL。应用建立的LAMP方法对3个不同地区的120份凡纳滨对虾样品进行检测,检测结果表明,EHP阳性样品数为43,与qPCR检测结果符合率达97%。本试验所建立的LAMP方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,并能在30 min内完成样品的检测,是快速、定量检测虾肝肠胞虫的有效手段。     

鸭瘟病毒环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法的建立与应用

为建立一种简便、快速、灵敏、特异的鸭瘟病毒(DPV)检测方法,本研究根据GenBank中登录的DPV基因组序列,设计3对特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,经优化反应体系,建立了LAMP快速检测方法.结果表明,LAMP方法能够在63℃恒温下,1h内实现目的核酸的大量扩增.结果判定时只需要在扩增产物中加入SYBRGreen Ⅰ染料,就可以直接在可见光或紫外光下观察颜色变化.该方法敏感性可达0.245 μg/L,比普通PCR灵敏性高10倍;对鸭病毒性肝炎病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭副黏病毒、鸭源偏肺病毒等的核酸无交叉反应;利用建立的LAMP检测方法对40份临床样品的阳性检出率为30％.该方法简便快捷,省时省力,是一种适用于基层实验室快速、准确检测DPV的方法.     

小反刍兽疫病毒RT-LAMP检测方法的建立

利用逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)建立了小反刍兽疫病毒快速检测方法,同时评价了该方法的灵敏性和特异性。结果表明,根据小反刍兽疫病毒N基因保守区域设计的LAMP引物能够在63℃恒温下,1小时内实现目的核酸的大量扩增,由于在检测前加入荧光指示试剂,检测结果可以直接用肉眼判断,避免了由于开盖检验带来的扩增产物污染导致的假阳性。该检测体系具有较高的特异性,只能特异性地检测目的病毒,与其他同属的病毒或类似病毒等无交叉反应;具有较高的检测灵敏度,比普通RT-PCR灵敏性高10倍,与荧光RT-PCR的灵敏度相当。     

牛源性成分LAMP检测方法的建立

根据牛cytB基因设计3对特异性引物,运用GenieⅡ等温扩增荧光检测系统,以环介导等温扩增(LAMP)荧光检测方法为基础,建立了牛源性成分LAMP检测方法,并对该方法进行了反应体系和条件的优化。试验结果表明:该方法操作简单、特异性好;灵敏度比普通PCR方法高100倍,达到5.408×10~(-2)μg/μL;反应时间短,最快的10分钟内即可完成反应。     

番鸭细小病毒LAMP检测方法的建立

本研究根据GenBank中登录的番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)VP3基因的高度保守序列,设计特异性引物,通过对反应体系及反应条件的优化,建立了MDPV的体外环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测方法。敏感性和特异性试验结果显示,建立的LAMP检测方法的灵敏性与常规PCR一致,全部反应可以在1.5 h内完成,对其他鸭常见病原体检测结果全部为阴性。该方法的建立为研制番鸭细小病毒的LAMP快速检测试剂盒奠定了基础。     

环介导恒温扩增技术快速检测非洲猪瘟病毒

以人工合成的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72全长基因为模板,利用在线软件Primer Explorer4设计环介导恒温扩增(LAMP)的内、外引物,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了ASFV的LAMP检测方法,同时进行了敏感性和特异性试验。结果表明,所建立的LAMP检测方法最低检测限可达10拷贝质粒DNA,且具有良好的特异性,LAMP产物的酶切鉴定也验证了反应的特异性。对凝胶电泳后紫外观察、肉眼观察颜色变化、生成沉淀观察以及实时荧光PCR扩增曲线Ct值判定等不同判定方法进行比较表明,以上结果判定方法各有其优缺点,其中荧光PCR的敏感性最高,染色法相对较方便直观,电泳法敏感性稍低。     

聚合酶螺旋反应（PSR）在病原微生物快速检测中的研究进展

聚合酶螺旋反应（polymerase spiral reaction,PSR）是基于环介导等温扩增技术（LAMP）和聚合酶链式反应（PCR）建立的一种新型恒温体外核酸扩增技术,其利用混合引物的设计思路和BstDNA聚合酶的链置换活性,实现了在体外等温条件下的核酸扩增,表现出灵敏性及特异性较PCR显著提高,引物设计较LAMP简单等优点,在保证检测灵敏、特异的同时,耗时相对较短,且操作简便,对仪器设备要求低,可肉眼直观判定结果,特别适用于公共卫生、动物健康、食品安全和生物防御等领域的快速诊断。本文介绍了PSR技术的原理及其在病原微生物检测方面的应用,以期为相关领域的检测技术研究提供参考。     

山羊痘病毒LAMP检测方法的建立

为了建立适用于基层养殖场快速、可视化的山羊痘病毒(GTPV)环介导等温扩增技术(LAMP)检测方法,根据GenBank公布的GTPV ORF103保守区核苷酸序列为靶序列,设计并合成一组特异性LAMP引物,优化反应条件(时间、温度)和反应体系(dNTP、内外引物浓度比),并进行特异性和灵敏度试验。结果表明,所建立的LAMP方法在65℃时反应50 min即可获得清晰的梯状条带;扩增物经10×SYBR GreenⅠ荧光染料染色,紫外线照射或日光下即可直接判定结果;灵敏度试验结果表明,该方法能够检出的GTPV核酸最低浓度为1.287 ng/mL,与常规PCR方法相比,灵敏度增高100倍;该方法特异性良好,与小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊支原体(Mccp)、羊口疮病毒(ORFV)均无交叉反应;对10份临床样品检测结果显示,该方法与传统PCR检测结果一致。建立的LAMP检测方法可用于临床山羊痘病毒的检测。     

环介导等温扩增技术检测产气荚膜梭菌α毒素方法的建立及应用

建立快速检测产气荚膜梭菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。针对GenBank发布的产气荚膜梭菌α毒素基因序列,应用Primer explorer V5软件在线设计了LAMP引物。通过对扩增条件包括反应时间、反应温度、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、内外引物浓度比、Bst DNA聚合酶浓度进行优化,建立了产气荚膜梭菌LAMP检测方法。特异性试验显示除产气荚膜梭菌外其他细菌检测结果均为阴性,灵敏度试验显示LAMP方法对该菌DNA最低检测量为10 ng/L,菌液的最低检出量为3.7×10~1 CFU/mL,分别是PCR方法的100倍和10倍。用建立的LAMP方法对牛粪便、饲料和饮水共计102份样品进行检测,产气荚膜梭菌阳性率为19.61%(20/102),与PCR检测及细菌分离鉴定结果一致,且样品增菌时间缩短2～4 h。本试验成功建立了快速、灵敏、特异、操作简便和结果可视的产气荚膜梭菌的LAMP检测方法。     

小反刍兽疫病毒环介导等温扩增检测方法的建立

为了建立适用于基层养殖场快速、可视化的小反刍兽疫病毒(PPRV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法,根据GenBank公布的PPRV F基因保守区核苷酸序列为靶序列,设计一组特异性LAMP引物,优化反应条件(时间、温度)和反应体系(dNTP、Mg2+、甜菜碱浓度),并进行特异性和灵敏性试验,最后用建立的方法对临床样品RNA进行检测。结果表明,所建立的方法在65℃时反应45min即可获得清晰的梯状条带;扩增物经10×SYBR GreenⅠ荧光染料染色,紫外线照射之后即可直接判定结果;灵敏性试验表明,该方法能够检出的PPRV核酸的最低浓度为8.63ng/mL,与常规RT-PCR方法相比,灵敏度增高100倍;该方法特异性良好,与山羊痘病毒(GTPV)、羊支原体(Mccp)、羊口疮病毒(ORFV)均无交叉反应;对16份临床样品RNA检测结果显示,该方法与传统RT-PCR检测结果一致。建立的LAMP检测方法的特异性、灵敏度均好,可用于临床小反刍兽疫病毒的检测。