百脉根小GTPase ROPs 基因反转座子插入突变体的分离和鉴定

为研究ROP(Rho-related GTPase of plants,ROP)在豆科植物共生固氮过程中的功能和作用机制,从百脉根逆转录转座子LORE1插入突变体库(http://www.kazusa.or.jp/lotus)中搜索到6个ROP相关基因突变体,通过分离和鉴定,得到不同突变体的M1代和M2代纯合体种子,对M2代进行表型鉴定及统计分析。结果表明:在早期共生表型的鉴定中,突变体与野生型植株相比,rop-like1植株的根瘤原基数明显下降,rop-like4植株的侵入线数和侵入线密度也明显下降;但仅rop-like1植株在接种14d后的结瘤数明显减少。     

百脉根LjSERKs基因家族在根瘤共生中的功能鉴定

为探索百脉根中的体细胞胚胎发生受体类蛋白激酶基因(somatic embryogenesis receptor-like kinases,SERKs)家族在根瘤共生过程中的功能和作用机制,根据拟南芥AtSERKs基因序列,从百脉根基因组中鉴定到8个同源基因(LjSERKs)。利用CRISPR-Cas9基因组编辑和毛根转化技术,分别敲除LjSERKs家族不同基因,观察并分析其对共生结瘤表型的影响。结果显示:敲除LjSERK2、LjSERK3、LjSERK6和LjSERK7后,其植株结瘤数与对照植株相比均无明显差异;敲除LjSERK8后,植株结瘤数显著减少。这些结果表明LjSERK8参与根瘤共生过程,而该家族其他基因间可能存在功能冗余现象。     

百脉根起始结瘤相关转录因子间相互作用的鉴定

以模式豆科植物百脉根为材料,利用酵母双杂交和双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation ,BiFC）技术,研究调控起始结瘤基因表达的转录因子IPN2、NSP2、CYCLOPS、DELLA间的相互作用。结果显示,百脉根IPN2与DELLA、NSP2与DELLA、CYCLOPS与DELLA均有相互作用。表明IPN2、DELLA可能参与并形成一个大的蛋白复合物,网络调控豆科植物起始结瘤基因的时空表达。     

百脉根根瘤菌nod-lacZ转录融合子构建及表达分析

根据Mesorhizobium loti基因组信息,克隆nodA、nodB、nodD等基因的启动子序列,分别与报告基因构建相应的转录融合子(nod-lacZ),并分别导入中慢生型百脉根根瘤菌MAFF303099和广谱根瘤菌NGR234(Rhizobium sp.)中,利用百脉根根的抽提物作为诱导物,检测结瘤基因的表达。结果表明:在MAFF303099菌株中,百脉根根抽提物不能诱导nodA的表达;能诱导nodB和nodD1的表达;nodD2呈组成型表达;供试的5种不同的类黄酮化合物都不能诱导nodA基因表达;在NGR234菌株中,毛地黄酮(Luteolin)能诱导nodA表达。     

百脉根泛素结合酶LjE2的表达及活性鉴定

为了研究泛素化作用在豆科植物共生固氮过程中的调控功能和作用机制,利用拟南芥泛素结合酶E2的序列,在百脉根基因组上鉴定得到14个编码E2(LjE2)的基因,从LjE2中克隆到11个基因并构建了融合表达载体pET-LjE2s:His。通过大肠杆菌表达系统,表达并纯化到10个LjE2:His融合蛋白。经体外泛素化及Western blot分析,在10个LjE2中有9个具有泛素结合酶活性,1个(LjE2-5)未检测到泛素结合酶活性。     

里奥百脉根的优点与利用评价

\t\t\t\t\t目的\t\t\t\t\t选育和推广适宜云南省高寒地区种植的百脉根品种。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t方法\t\t\t\t\t选取野生中甸百脉根和帝国百脉根为材料,对其在云南省迪庆州高寒地区的植株形态特征、生物量和生理指标进行了测定分析。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结果\t\t\t\t\t帝国百脉根自然高度、拉直高度、叶长、叶宽、地上部分以及地下部分的鲜重干重均显著高于中甸(P<0.05),而茎叶比显著低于中甸(P<0.05)。生理分析表明：帝国百脉根根部丙二醛、脯氨酸含量显著低于中甸(P<0.05),而根部可溶性糖含量、超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性显著高于中甸(P<0.05)。二者叶片中可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量以及相对电导率差异并不显著(P>0.05)。\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t结论\t\t\t\t\t综合分析认为帝国百脉根植株更高大,茎叶比小,牧用经济性高,适应性更强。在迪庆州香格里拉县试验基地或者在与其相似的地域和气候环境中种植,帝国百脉根的产量和适应性优于中甸百脉根。\t\t\t\t     

启动子Prd29A的克隆及在百脉根中的活性鉴定

利用PCR方法,从拟南芥中克隆了865bp的逆境诱导型启动子Prd29A.利用农杆菌介导的瞬时表达方法,结合GUS染色,在豆科植物百脉根的幼苗中进行活性鉴定.结果表明:启动子Prd29A在正常情况下不表现活性,而在逆境(高渗、高盐)和ABA诱导下活性很高,这为该启动子在百脉根等豆科植物中的应用提供了依据.     

百脉根无效根瘤突变体的生物量及无效根瘤的电镜观察分析

百脉根是研究豆科植物根瘤形成和共生固氮分子机理的一种重要模式植物.为探索百脉根根瘤的形成机制,以EMS诱导野生MG-20突变并筛选的No.1006,No.486和No.2568等3种无效根瘤突变体为材料,测定其突变体植株生物量、根瘤数及固氮能,并对无效根瘤中根瘤菌感染的细胞进行电镜观察.结果表明:No.1006是根瘤原基突变体,No.486是白色无效根瘤突变体,No.2568是绿色无效根瘤突变体;这3种无效根瘤突变体植株生长至30d时,根瘤数和固氮能以及株高、地上部干质量、根干质量和根长等生物量与MG-20野生株差异无统计学意义(p0.05),但生长至40d开始均显著低于野生株(p0.05).No.486的白色无效根瘤和No.2568的绿色无效根瘤,经切片后在电镜下观察,无效根瘤细胞均存在不同程度的破坏;其中No.2568的绿色无效根瘤的细胞和由根瘤菌转化来的类菌体的破坏程度远大于No.486的白色根瘤.     

百脉根半胱氨酸蛋白酶基因在根瘤衰老过程中的表达分析

为明确半胱氨酸蛋白酶与定型根瘤衰老的相关性,通过与已鉴定的紫云英半胱氨酸蛋白酶AsNODf32进行序列比对分析,从百脉根中鉴定出2个与根瘤衰老相关的蛋白酶基因LjCyp1和LjCyp5。蛋白序列及结构分析表明,LjCyp1和LjCyp5同源性高达96.2%,均含有2个典型的半胱氨酸蛋白酶结构域和液泡定位信号肽,属于木瓜蛋白酶家族。体外酶活检测显示,2个蛋白都具有半胱氨酸蛋白酶活性。通过Realtime PCR和组织化学定位分析表明,2个蛋白酶基因主要在成熟和衰老的根瘤中表达。结果表明LjCyp1和LjCyp5可能在百脉根根瘤衰老过程中发挥重要作用。     

菌株对百脉根及百脉根促生效果测定的研究

以贵州黔南地区百脉根为研究材料,接种不同复合菌株处理(溶磷菌剂、固氮菌剂和溶磷+固氮混合)与对照相比,百脉根株高及地上生物量提高明显。无论第一茬还是第二茬,溶磷+固氮混合处理的株高均较对照显著提高超过20.00%,地上生物量较对照增加均超过100.00%。     

百脉根结瘤信号通道蛋白NSP1和NSP2的相互作用

豆科植物百脉根是研究共生固氮体系的模式植物之一,对其根瘤菌共生信号转导途径和作用机制的研究,有助于揭示根瘤菌与豆科植物共生关系建立和共生体形成的奥秘.本研究利用酵母双杂交系统和体外蛋白质相互作用技术,证明百脉根GARS类家族转录因子结瘤信号通道蛋白NSPI和NSP2在体外体内均可以相互作用,并将相互作用的位点定位在NSPl的GRAS结构域的LHRⅡ区域和NSP2的LHRI区内.     

百脉根离子通道蛋白Pollux与翻译延伸因子EF1A的相互作用

利用酵母双杂交技术,以百脉根离子通道蛋白Pollux胞内结构域为诱饵,从百脉根AD-cDNA文库中筛选到与Pollux相互作用的多个阳性克隆,经DNA序列测定及NCBI数据库BLAST分析,其中有6个阳性克隆编码翻译延伸因子EF1A。进一步在大肠杆菌中表达与纯化Pollux和EF1A融合蛋白,通过Pull-down及Western杂交证实Pollux胞内结构域与EF1A的C-末端相互作用。     

南瓜莲藕复合果蔬汁制作工艺研究

[目的]探讨制作南瓜莲藕复合果蔬汁的最佳配方。[方法]在不添加任何添加剂条件下,以南瓜汁和莲藕汁为主要原料,同时添加少量的苹果汁和菠萝汁,运用Mixture-D-optimal设计,以感官评定为响应值,研究南瓜汁、莲藕汁、苹果汁和菠萝汁复合的果蔬汁制作工艺及其体态稳定性。[结果]通过回归方程确定复合果蔬汁最优配方为：南瓜原汁40％、莲藕原汁30％、苹果汁17％和菠萝汁13％,此时感官评定值为6．18,口感易为消费者接受。在南瓜莲藕复合果蔬汁中加入0．02％黄原胶和0．06％果胶,均质后,产品均匀稳定,储藏30d后,产品无分层现象。[结论]通过研究制得营养全面和风味独特的复合果蔬汁。     

马铃薯、莲藕加工过程中的褐变控制

针对马铃薯、莲藕等蔬菜加工过程中存在的鲜切组织褐变现象,采用二次回归通用旋转设计方法,研究了VC,VE,柠檬酸,苹果酸和硼酸对马铃薯和莲藕褐变强度的影响作用。结果表明:①使用由上述物质组成的多元组分,可有效控制马铃薯、莲藕加工过程中出现的鲜切组织褐变现象;②因蔬菜种类的差异,各组分控制褐变的强度、方向及多元组分的具体组成不同;③按照系统学理论和方法,通过对数学模型的定量分析,可得出用于控制马铃薯、莲藕褐变的优化方案。     

莲中总酚含量与分布研究

[目的]研究不同品种莲藕中总酚的含量和分布。[方法]以鄂莲系列莲藕为材料,采用分光光度法测定其总酚含量并分析总酚含量分布。[结果]荷叶的总酚含量明显高于其他部位,莲不同部位的总酚含量顺序为：荷叶〉荷花〉荷梗〉地下茎。荷叶中总酚含量是地下茎的12倍左右。12个品种荷叶中的总酚含量差异显著,其荷梗中的总酚含量差异不显著。4个品种花蕾中的总酚含量差异不显著。莲藕藕节中的总酚含量明显高于其他部位,其不同部位的总酚含量依次为：藕节〉藕尾〉藕头〉藕中。鄂莲一号、鄂莲二号、鄂莲三号、鄂莲四号和鄂莲五号的莲藕总酚含量差异显著。同一品种莲藕不同部位的总酚含量差异显著。[结论]该研究为莲藕资源的开发利用提供了理论依据。     

百脉根LjIPT3启动子的克隆及表达载体的构建

[目的]为深入研究LjIPT3的表达调控和功能奠定基础。[方法]利用TAIL-PCR技术克隆百脉根IPT基因LjIPT3起始密码子的上游序列,利用生物信息学手段对其序列特征和潜在的调控元件进行分析,并构建启动子表达载体。[结果]利用TAIL-PCR技术成功克隆了LjIPT3基因5′端上游调控序列。将目的片段连接到pMD18-T载体上,获长度为1 910 bp序列,其3′端有部分序列与LjIPT3的5′端相同,证明克隆的片段为LjIPT3起始密码子ATG的上游区域。该序列含有1个TATA-box和3个CAAT-box,还包含光响应元件、MYB结合位点、不同的激素反应元件以及各种胁迫元件,说明该基因的表达可能受多种因素的调控。成功构建了驱动报告基因GUS的植物表达载体。[结论]该研究为研究植物细胞分裂素的合成代谢和植物生长发育的调控奠定了基础。     

莲藕多酚薄层层析分离鉴定研究

[目的]为分离和鉴定莲藕中的多酚奠定基础。[方法]利用薄层层析色谱法,以硅胶G60为固定相,以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸为流动相,以儿茶素为对照品,用FeCl3-K3Fe(CN)6为显色剂,对莲藕多酚酯相组分中酚类物质进行分离和鉴定,并分析不同的展开剂对组分分离的影响。[结果]莲藕多酚酯相展开的第2个斑点与标准品儿茶素所对应的斑点Rf值相同,初步确定莲藕多酚酯相中有儿茶素成分。薄层层析利用所选的6种展开剂均得到很好的分离效果,其Rf值在0.49~0.61范围内,符合薄层层析中Rf值定性的要求。[结论]薄层色谱高效、灵敏、快速,为初步鉴定莲藕中的儿茶素化合物提供了较好的检测方法。     

百脉根组氨酸蛋白激酶LHK1的表达及活性鉴定

为研究LHK1蛋白的功能,构建了pPub-LHK1∶AG-GFP和pFastBac-LHK1表达载体,分别在烟草叶肉细胞和昆虫细胞表达百脉根组氨酸蛋白激酶LHK1跨膜蛋白。结果表明:在烟草和昆虫细胞中LHK1蛋白都能表达,且表达的蛋白在体外都能磷酸化底物(组氨酸转移酶HP1蛋白),具有组氨酸蛋白激酶活性。