枣疯病植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据枣疯病植原体16S rDNA基因保守区域设计、合成特异性引物和TaqMan探针, 以构建的重组质粒作为阳性标准品, 建立并优化了对枣疯病植原体的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。对优化后的方法进行灵敏度、特异性及稳定性评价, 制作了标准曲线。结果显示, 制作的标准曲线有极好的线性关系, 相关系数( r 2 )达到0.998, 建立的实时荧光定量PCR检测方法能够特异性地检测枣疯病植原体, 能检测到60拷贝的质粒DNA。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法灵敏度、特异性、重复性好, 不仅能够实现对枣疯病植原体的快速检测, 而且为实现从病原定量水平上对枣疯病病情分级奠定了基础。     

梨衰退植原体Cycleave 实时荧光PCR检测方法的建立

 根据植原体16S rDNA 保守区设计Cycling 探针LST2probe及引物,建立了梨衰退植原体Cycleave实时荧光PCR检测方法。结果表明,探针LST2probe 能特异的检测梨衰退植原体,供试同一组内不同亚组植原体及参试病原细菌均为阴性,检测灵敏度可达0.5 pg/μL。该Cycleave实时荧光PCR检测方法可用于梨衰退植原体的快速检测,并为其他有害生物鉴定提供借鉴依据。     

喜树丛枝植原体的分子鉴定及TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

 为确定在云南文山地区喜树上发生的疑似丛枝病的病原种类及快速检测喜树丛枝病,本研究利用植原体16S rDNA基因通用引物P1/P7和R16F2n/R16R2对感病喜树总DNA进行常规PCR和巢式PCR扩增、克隆和测序,通过系统进化分析,明确了喜树丛枝植原体属于16SrXXXII组。然后根据喜树丛枝病植原体16S rDNA基因保守区域设计并合成特异性引物和TaqMan探针,制备了喜树丛枝病植原体标准质粒,确定了最优引物浓度和最佳探针浓度,制作的标准曲线有极好的线性关系,决定系数(R²)达到0.999,建立的实时荧光定量PCR检测方法能够特异性地检测喜树丛枝植原体。本研究首次明确了喜树丛枝植原体的分类地位,优化和建立了喜树丛枝植原体TaqMan探针qPCR检测方法,为快速检测喜树丛枝病植原体提供参考。     

番茄褪绿病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法

 根据番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)热激蛋白70(Hsp70)的基因序列,设计ToCV实时荧光定量PCR特异引物。利用重组质粒ToCV-1为标准品建立SYBR Green I实时荧光定量方法。针对引物浓度、退火温度、特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行系列优化。结果表明,最适退火温度为63℃,最适引物浓度为0.3 μmol·L^-1。熔解曲线为特异性单峰,表明其特异性良好。建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR较常规PCR灵敏100倍,且具有良好的重复性和稳定性。基于SYBR Green I实时荧光定量PCR技术建立的ToCV检测方法,速度快、特异性强、灵敏度高、重复性好,可以用于ToCV的定量检测。     

植原体TaqMan探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

 本研究成功建立了植原体分类鉴定和检测的TaqMan探针实时荧光PCR方法,该方法根据植原体16S rDNA保守区设计了1个TaqMan广谱探针和3个植原体组间点突变特异性探针,并对9种植原体和5种细菌以及3个植物样本进行实时荧光PCR。结果表明,用广谱探针可检测到所有植原体产生荧光信号,而细菌不产生荧光信号。当用植原体组间特异性探针检测时,仅能检测到该组植原体产生荧光信号,检测的敏感性比常规的PCR-电泳检测高约100倍、检测速度有较大提高。由于PCR产物是荧光探针检测,本方法特异性强,并可以用组特异探针直接确定植原体种类。实验采用完全闭管检测,降低了污染机会。本研究为其它原核生物、特别是不能培养菌、难培养菌的检测鉴定和分类提供了新方法。     

甜瓜黄斑病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法

为建立检测甜瓜黄斑病毒(melon yellow spot virus, MYSV)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(qPCR)方法。基于MYSV核衣壳蛋白基因保守序列设计qPCR特异性引物对,针对引物退火温度、引物浓度、特异性和敏感性进行系列优化。结果显示,优化后的qPCR方法最适退火温度为61.3℃,最适引物浓度为0.65μmol·L^-1,特异性强,灵敏度高,比PCR高100倍。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的qPCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.999 7。实验样品验证表明建立的qPCR方法可用于MYSV的定量检测。     

SYBR Green实时荧光PCR快速鉴定辣椒实蝇

本文应用SYBRGreen实时荧光PCR技术,建立了SYBRGreen实时荧光PCR快速鉴定辣椒实蝇的方法。利用辣椒实蝇mtDNACOI基因序列,筛选出种特异引物lati1/lati2。引物的特异性分别用辣椒实蝇、橘小实蝇、木瓜实蝇、杨桃实蝇、菲律宾实蝇、芒果实蝇、番石榴实蝇、瓜实蝇和南瓜实蝇等9种果实蝇来验证。0.01ng,0.1ng,1ng,10ng,20ng,40ng和100ng等7个不同浓度系列的辣椒实蝇DNA模板用来检测SYBRGreenPCR实时荧光反应的灵敏度,结果表明,SYBRGreenPCR的检测限度达1pg以下,最适模板DNA浓度为1～20ng。成虫、幼虫和蛹等3种不同虫态的辣椒实蝇有一致的扩增曲线,熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳分别用来确认实时荧光PCR产物的特异性。其平均熔解温度为77.5℃±0.1℃。获得1段长为366bp的特异性目标片段,说明在辣椒实蝇成虫为模板基础上建立的SYBRGreen实时荧光PCR方法适于幼虫、蛹的快速鉴定。     

实时荧光定量PCR法检测十字花科细菌性黑斑病菌

为有效防控我国的检疫性有害生物十字花科细菌性黑斑病菌Pseudomonas syringae pv.maculicola在国内的传播与蔓延,通过设计1对特异性引物3539,利用132株靶标和非靶标菌为模板进行PCR扩增,建立了实时荧光定量PCR法,并进行了模拟种子带菌试验。结果显示,引物3539为只针对十字花科细菌性黑斑病菌扩增出的特异性产物;在模拟种子带菌检测中,常规PCR对菌悬液的检测限为10~5CFU/m L,实时荧光定量PCR的检测限为10~3CFU/m L,其中10~8CFU/m L菌液的Ct值最低,为22.90,10~3CFU/m L菌液的Ct值最高,为35.73,且不同浓度菌液间的Ct值均有显著差异;不同带菌率模拟种子的检测结果表明,常规PCR和实时荧光定量PCR能检测到的带菌率分别为0.5%和0.1%。研究表明,实时荧光定量PCR法不仅可用于病种的检测,也可用于病害的早期诊断。     

实时荧光定量PCR在植物病害流行学中的应用

实时荧光定量PCR广泛应用于植物病理学研究的各个领域。近年来已开始应用于植物病害流行学的定量研究中,本文对近年来实时荧光定量PCR技术在病菌初始菌源的定量分析、病害流行动态的监测、寄主抗病性的快速鉴定和植物病原菌的抗药性监测等方面的应用进行了综述。     

应用TaqMan探针实时荧光定量PCR技术早期检测稻瘟病

 稻瘟病是一种严重危害水稻生产的真菌病害,早期监测和防治是关键。温室接种大田主栽品种合系39和感病水稻蒙古稻,定时观察发病症状。提取水稻病样总DNA,根据稻瘟菌28S rDNA基因序列,设计特异引物和TaqMan探针,进行荧光定量PCR检测。结果表明稻瘟菌在蒙古稻和大田主栽品种合系39上症状最初出现时间为接种后72 h,蒙古稻典型症状出现时间为接种后168 h,在合系39上出现典型症状的时间为接种后190 h以后。利用TaqMan探针荧光定量PCR技术,在接种12 h的蒙古稻和合系39上均能检测到稻瘟菌DNA,接种48 h,菌量拷贝数达到最高峰,接种72 h,菌量拷贝数开始下降。不同品种中病原菌拷贝数存在差别,在接种12 h的蒙古稻中稻瘟菌含量为7.2×103个拷贝数,在合系39中为4.9×103个拷贝数。本研究结果表明,应用实时荧光定量PCR技术可以在接种后12 h症状未显现之前检测到稻瘟菌,为稻瘟病流行监测和早期防治提供了科学依据。     

实时荧光定量PCR在植物害虫研究中的应用

实时荧光定量PCR技术作为一项新兴技术,以快速、准确定量、便捷等优点广泛应用于科学研究各个领域,越来越受到人们的重视。近年来,随着实时荧光定量PCR技术的发展和深入,大大提高了植物害虫的研究水平。本文结合了最近几年来应用于鉴定和研究植物害虫的情况,同时也介绍了在植物病原线虫和害螨研究中的应用,综合论述了实时荧光定量PCR技术在植物害虫研究中的应用。     

茄匍柄霉菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了准确检测病残体内茄匍柄霉菌(Stemphylium solani)DNA含量在土壤内的动态变化,本研究根据三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因序列,设计并筛选特异性引物Stem-g7F/Stem-g7R,能从靶标基因组DNA中特异性扩增出大小为150 bp的目的片段.建立的Stemphylium solani实时荧...     

利用常规PCR和实时荧光定量PCR检测杨梅凋萎病菌

凋萎病是近年来危害杨梅的主要病害。为了快速灵敏的检测杨梅凋萎病菌(Pestalotiopsis versicolor和P.microspora),本研究开发了常规PCR和SYBR Green实时荧光定量PCR技术各一套。利用P.versicolor(JN861773)和P.microspora(JN861776)的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列的相同部分设计引物对(Pvm1L/Pvm1R)。该引物对利用常规PCR技术能特异性扩增出杨梅凋萎病菌188 bp的目标产物而对照菌株则呈阴性。该常规PCR体系能够检测人工接种后21 d和田间自然发病的有病症杨梅组织中的凋萎病菌,检测下限是0.6×10~5拷贝数。利用Pvm1L/Pvm1R进行SYBR Green实时荧光定量PCR,检测灵敏度是常规PCR的100倍,检测下限是0.6×10~3拷贝数,能够检测出人工接种及田间已经感染但尚未表现症状的杨梅组织中的凋萎病菌。这两项技术简单、快速、灵敏特异性强,可以应用于杨梅凋萎病的诊断和苗木检疫。     

实时荧光定量PCR技术在湖南油菜根肿病菌检测中的应用

为完善湖南油菜根肿病的监测预警体系, 分析油菜根肿病的发生与芸薹根肿菌休眠孢子量的关系, 防止湖南油菜根肿病进一步蔓延?本研究依据芸薹根肿菌ITS序列设计了一对特异性引物, 通过制备标准质粒构建了快速?精准的实时荧光定量PCR检测方法?其检测灵敏度为3×10-10 μg/μL, 比常规PCR 高100 倍; 利用建立的方法检测了来自湖南各地土壤样品中芸薹根肿菌的休眠孢子数量, 64份土样中的休眠孢子含量基本大于104个/g, 所检测的土样中孢子含量最高为2.22×107个/g?据实地调查, 当土壤中休眠孢子数量大于 104个/g 时, 油菜发生根肿病的风险较大, 休眠孢子含量较高的田块其发病程度也较为严重?结果表明, 建立的实时荧光定量PCR检测方法能对油菜根肿病进行早期诊断, 为湖南油菜根肿病发生的监测预警提供有效技术参考?     

甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

 甘蔗宿根矮化病是由Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx)引起的一种世界性甘蔗细菌病害。根据Lxx的Pat1基因保守序列,设计并合成了一对特异性引物Pat1F (5′-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3′)/Pat1R(5′-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3′),和一条TaqMan探针(FAM-5′-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3′-TAMRA),建立了一种特异性强、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR方法,对Lxx的检测最低下限为10² copies·μL^-1。应用实时荧光定量PCR与常规PCR方法对14个甘蔗品种进行Lxx检测,阳性检出率分别为86%和43%,表明实时荧光定量PCR比常规PCR检测方法具有更高的灵敏度。研究结果为甘蔗宿根矮化病的诊断、田间发生动态监测、脱毒健康种苗检测及品种/材料交换检疫检测提供了新技术支撑。     

稻粒黑粉病菌实时荧光定量PCR内参基因筛选

 实时荧光定量PCR是一种被广泛应用于基因表达研究的分子技术,内参基因的选择对试验结果的可靠性起重要作用。稻粒黑粉病是一种全球性水稻真菌病害,目前没有关于稻粒黑粉病菌内参基因的报道。本文选择6个常用内参基因,对其在稻粒黑粉病菌不同菌株、不同生活史阶段和不同浓度Basta处理3组生物学样本中的稳定性进行比较分析。经geNorm3.5、NormFinder0.953及BestKeeper1.0软件综合评价,结果显示在不同菌株、不同生活史阶段、不同浓度Basta处理生物学样本中,最稳定的内参基因分别为UBQ、GAPDH和EF1α,最优组合分别为UBQ/GAPDH、UBQ/GAPDH和EF1α/GAPDH。本研究结果为稻粒黑粉病菌基因表达研究奠定了基础,同时对其他真菌内参基因的选择提供了参考。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光定量PCR检测体系的建立

为灵敏、快速地检测西瓜种子和果实中的黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV),根据该病毒的衣壳蛋白(coat protein,CP)序列设计特异性引物,建立基于SYBR Green Ⅰ染料的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)技术,并对采集的12份不同发育期西瓜果实样品进行检测。结果表明,建立的RT-qPCR检测技术可对西瓜种子中的CGMMV含量进行精确检测,检测下限为3.35×10~2 copies/μL。采集的12份不同发育期西瓜果实样品中有10份被检测出携带CGMMV,病毒含量范围为1.00×10~4～4.80×10~6 copies/μL。随着果实发育,由CGMMV引起的果实倒瓤症状愈加明显,果实中CGMMV的积累量也明显增加。授粉后25 d西瓜果实中CGMMV的含量是授粉后10 d时的30倍,表明病毒在果实中的积累可能受生长发育期的影响且果实倒瓤症状的形成与病毒积累量呈正相关。     

SYBR Green I实时定量RT-PCR技术在甜樱桃病毒定量分析中的应用

为了探讨SYBRGreenI实时定量RT—PCR技术在甜樱桃病毒粒子定量分析中的应用前景,以复合感染李属坏死环斑病毒（Prunusnecrotic ringspot virus,PNRSV）、李矮缩病毒（Prune Dwarf vi—rus,PDV）、樱桃病毒A（CherryvirusA,CVA）、樱桃小果病毒一2（Little cherry virus一2,LChV－2）的甜樱桃“红灯”PrunusaviumCV．RedLamp植株为研究对象,采用相对定量方法,分析各病毒的外壳蛋白基因的表达,用以指示病毒的增殖量。在花、幼叶、功能叶、衰老叶中均能检测到4个基因,但各基因表达量在各器官中存在差异。PNRSV-CP与CVA—CP表达模式相似,功能叶中明显高于其它器官,衰老叶中急剧降低。PDV-CP与LChV2一卯表达模式类似,幼叶中的表达量较高,功能叶片中较低。PNRSV-CP在花、功能叶中的表达显著高于其它3个病毒基因。LChV2一cP在各器官中的表达量均低于其余3个基因。该方法适用于植物组织内多种甜樱桃病毒增殖量的分析。     

葡萄根瘤蚜TaqMan-MGB实时荧光定量检测方法的研究

为建立葡萄根瘤蚜实时荧光定量PCR的检测方法,参考Karen Herbert等设计的特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,构建以标准阳性质粒作为标准品制作标准曲线,并经优化反应条件,建立葡萄根瘤蚜的实时荧光PCR绝对定量检测方法,进行敏感性和重复性试验,并对受葡萄根瘤蚜为害的葡萄根际土壤进行初步定性检测.结果表明:该方法的灵敏度可达1.625拷贝/μL,3次重复检测的变异系数均小于5％.提取0.25g含有10头葡萄根瘤蚜若虫土壤的DNA,并将其梯度稀释,用建立的荧光定量PCR进行检测,将DNA稀释103倍后,仍能检测出阳性结果.对受害葡萄根际土壤检测结果为阳性.葡萄根瘤蚜TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术具有特异性强,敏感性高,易操作等优点,有很好的应用前景和研究价值.     

利用实时荧光定量PCR 技术检测油菜菌核病菌

 采用高通量实时荧光定量PCR 技术建立检测和监测油菜菌核病菌群体数量的方法。利用油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)的茁-微管蛋白基因内含子序列的特异性,设计引物对SclSF (5'-CTCAAATCTCCGAAAGTT -3') / SclAF (5'-TGCAGACGGGTAATATG -3'),建立和优化了SYBR Green 玉实时荧光定量PCR 检测体系。结果表明,该引物对能够从8种所测试的十字花科植物常见病原真菌中特异性扩增出油菜菌核病菌;所建立的实时定量PCR 技术可应用于油菜病叶和病茎中菌核病菌的早期检测及菌核病的预测预报。