应用RT-PCR和dot-ELISA方法检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒

本文比较了RT-PCR和dot-ELISA两种方法对单头灰飞虱携带水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的检出率、检测灵敏度和检测成本。结果表明,两种方法均能检测到单头灰飞虱体内的RSV,RT-PCR检测单头灰飞虱体内RSV的阳性检出率比dot-ELISA方法低11.79%~15.77%,但RT-PCR的检测灵敏度比dot-ELISA高10倍,RT-PCR技术的检测成本比dot-ELISA的高。结果暗示,对于单头介体昆虫中的病毒检测,RT-PCR技术的检出率不一定比dot-ELISA的高。综合考虑后,如对室外大批量灰飞虱进行带毒率检测时可采用dot-ELISA方法,如需准确分析单头灰飞虱体内RSV时可采用RT-PCR方法。     

水稻条纹叶枯病防治技术优化

水稻条纹叶枯病是由灰飞虱带毒并传播引起的一种病毒病。东台白1998年零星发生以来，呈逐年加重趋势，2004年传毒昆虫灰飞虱发生量大，带毒率高，水稻条纹叶枯病呈大流行态势，我们在准确测报虫情的基础上，积极优化水稻条纹叶枯病的防治技术，在病害大发生之年，取得了全市大面积水稻安全过关的好实绩。     

首届中国植物保护学会科学技术奖获奖成果介绍 水稻条纹叶枯病与传毒媒介灰飞虱发生规律、监测预警与持续控制技术研究（一等奖）

首次测定了浙北地区近年暴发的水稻病毒病病原基因组全序列,明确该病害由水稻条纹叶枯病毒（RSV）引起;在RSV pcl蛋白的RdRp特征性区域内发现3个酶活性位点及其N-端存在一个OUT一结构域,在RSV及同属病毒基因组中发现一个保守并能形成茎环结构的新基序;建立了双抗夹心ELISA和RT—PCR方法,用于RSV及单头灰飞虱带毒率的快速检测和诊断;探明了RSV与灰飞虱田闻发生消长规律、暴发成灾成因,发现千金子和白顶早熟禾分别为RSV和灰飞虱新寄主;发明了具有自主知识产权的灰飞虱发生监测和采集仪器多项,     

灰飞虱携带水稻条纹叶枯病毒检测研究

采用斑点免疫结合(DIBA)与生物测定方法对采自浙江长兴和嘉兴两地的灰飞虱带(传)毒率进行了检测。结果发现,两地灰飞虱均有部分虫口携带水稻条纹叶枯病毒(RSV),平均带毒率为6.15%,传毒率为3.96%;斑点免疫结合(DIBA)测定的灰飞虱带毒率,均高于生物法测定的灰飞虱传毒率,两者之比为1:0.65。该检测结果为病害预测和防控提供了重要科学依据。     

灰飞虱传播水稻条纹病毒的研究综述

灰飞虱在水稻上传播水稻条纹病毒(RSV)造成水稻条纹叶枯病,严重影响水稻生产.笔者对灰飞虱传播水稻条纹病毒的途径与特性、影响传毒的生态因子以及可能的传毒机制等方面的研究进行了汇总,以期加深对水稻条纹叶枯病发生、流行的内在原因的认识,并为该病害的宏观控制提供理论参考.     

灰飞虱冠蛋白的基因克隆与表达分析

灰飞虱Laodelphax striatellus冠蛋白属于WD40重复超家族成员,主要通过结合肌动蛋白调控细胞骨架的动态聚合与解聚。本研究通过RT-PCR克隆并获得了灰飞虱3个冠蛋白coronin 1A、coronin 2B和coronin 7的基因CDS区。系统进化树分析显示,这3个冠蛋白分别属于3个分支,且与褐飞虱Nilaparvata lugens的3个冠蛋白同源性最高,氨基酸序列相似性分别为99.2%、88.2%和82.5%。荧光定量PCR检测结果显示,coronin 1A在成虫中的转录水平显著高于2龄、4龄若虫,coronin 2B在雄虫中的转录水平显著高于2龄、4龄若虫和雌虫,coronin 7在雌虫中的转录水平显著高于2龄、4龄若虫和雄虫。而3个冠蛋白基因在唾液腺中的转录水平都显著高于肠道。灰飞虱携带水稻条纹病毒(rice stripe tenuivirus, RSV)后体内3个冠蛋白基因的转录水平显著高于对照,说明冠蛋白可能在灰飞虱传播RSV过程中发挥一定作用,研究结果为深入探究冠蛋白的功能奠定了基础。     

浙江省水稻条纹叶枯病发生发展态势与防控对策措施

水稻条纹叶枯病[rice stripe Tenuivirus,(RSV)],是由灰飞虱[Laodelphax striatellus(Fallén)]为传毒媒介的病毒病,具有暴发性、间歇性和迁移性。其病原由灰飞虱以持久性方式传播。病毒可经卵传递。获毒灰飞虱在第6年的第40代仍有较高的传毒能力。带毒的灰飞虱在水稻上取食数分钟即能染病,经过13～17d的潜伏期后显症。得病早的病株全株枯死,得病迟的不易抽穗或抽出畸形穗,结实很少。该病一旦侵染,难以防治,具有毁灭性,因而被称为水稻上的癌症。1浙江省水稻条纹叶枯病的发生情况与发展态势近年来,由于耕种栽培制度改变等多种因素影响,水…     

水稻条纹病毒单克隆抗体的制备及检测应用

 用水稻条纹病毒(RSV)免疫的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得4株能稳定传代且分泌抗RSV单克隆抗体的杂交瘤细胞。各株单抗腹水的ELISA效价均在1:80000~1:5120000之间。Westernblot分析表明,4株单抗均与RSV的35kDa的外壳蛋白亚基有特异反应。建立了间接ELISA测定RSV的方法,4株单抗检测病汁液的稀释度能达到2560倍以上,与其它病毒无交叉反应。对江苏省部分县市的大田灰飞虱带毒率进行检测,结果显示灰飞虱的带毒率为12.5%~41.5%     

灰飞虱体内水稻条纹病毒的检测

为评价灰飞虱体内水稻条纹病毒检测方法的适用范围,利用已经制备的水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的多克隆抗体SV21和单克隆抗体3B9,采用多孔板间接ELISA、DIBA和Western blotting等三种方法进行单头灰飞虱Laodelphax striatellus Fallén(SBPH)体内RSV检测。结果表明,检测灵敏度以多孔板间接ELISA最高,其次为DIBA,Western blotting最低;用单克隆抗体3B9检测灵敏度高于多克隆抗体SV21。RT-PCR、IC-RT-PCR和DB-RT-PCR三种方法中,RT-PCR对单头灰飞虱稀释到400倍可检测到病毒;IC-RT-PCR在多克隆抗体SV21稀释浓度大于500倍时检测不出RSV,单克隆抗体3B9稀释浓度大于800倍时检测不到RSV;DB-RT-PCR检测结果显示,单头灰飞虱在稀释400倍后均无阳性反应。     

水稻条纹病毒胁迫对灰飞虱mucin基因表达量的影响

为分析灰飞虱mucin基因在水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)侵染过程中的作用,采用荧光定量PCR的方法分析了RSV 胁迫条件下灰飞虱mucin基因mRNA表达量的变化。饲喂RSV病叶1天和2天时灰飞虱mucin基因的表达量没有明显变化,而在3天和7天时灰飞虱mucin基因的表达量增加了3.60倍和1.97倍。饲喂健康水稻叶片1、2、3和7天后,灰飞虱mucin基因的表达量分别为饲喂前的1.07、1.12、0.78和0.34倍,而饲喂病叶1、2、3和7天后,mucin基因的表达量分别为饲喂前的1.15、1.19、3.19和1.01倍。结果表明,病毒胁迫使灰飞虱体内mucin基因的表达量增加,暗示mucin基因在RSV与灰飞虱互作过程中起着重要作用。     

水稻条纹病毒不同地区分离物的致病性研究

 利用36个粳稻品种对来自江苏、云南、河北、山东等地的22个水稻条纹病毒(RSV)分离物进行致病性测定,根据各分离物在36个品种上的平均发病率,将参试分离物划分为HV、SH、MV、SL和LV 5个致病类型,致病力强弱为HV > SH > MV > SL > LV,其中MV和SL型占77%,表明RSV对粳稻的致病力中等偏弱。各致病型在地区间和年度间呈随机分布状态,暗示自然条件下特定地区的RSV为混合致病群。根据致病性测定结果同时将36个粳稻品种划分为免疫、抗、中抗、中感、感和高感6个抗感类型,其中中感和感病类型占70%,无高感和免疫类型,显示粳稻对RSV比较敏感但有一定程度的耐受性。根据试验结果筛选出11个具有鉴别能力的水稻品种,可对RSV分离物进行致病型鉴定。研究发现部分抗病品种对一些分离物表现为中抗~中感类型,接种量加大时可转为感病类型,由此提示各地在应用抗病品种防治水稻条纹叶枯病时应根据当地RSV致病型的差异,针对性地选用抗病品种,当灰飞虱超量发生时需及时做好治虫控病工作,并随时监测当地RSV致病型的变化,警惕品种抗性丧失。     

松材线虫fem-1基因的克隆与表达特性研究

 松材线虫病是世界性的检疫病害,严重威胁松林等森林资源和生态安全。有研究表明,Feminization(fem)基因家族在秀丽隐杆线虫中参与性别决定和分化。本研究克隆了松材线虫fem-1基因,并对其表达特征和调控功能进行研究。结果表明,该基因cDNA全长为856 bp,包含681 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸,进化分析显示与秀丽隐杆线虫位于同一进化分支。荧光定量PCR以及原位杂交结果显示, fem-1基因在松材线虫各个发育阶段均有表达,其中在2龄虫期表达水平最高;在卵期至3龄虫期阶段于虫体中后部表达,而发育后期,多位于皮下细胞中表达,肠道、性腺等部位极少出现杂交反应。利用RNA干扰技术沉默fem-1基因后,线虫种群雌雄比例出现下降,说明fem-1基因可能参与松材线虫性别分化和决定过程。研究结果有助于了解松材线虫性别决定相关基因表达特性与功能,为深入研究松材线虫发育生物学提供一定的理论依据。     

PstVosA1转录因子基因在调控小麦条锈菌耐高温反应中的生物学功能分析

 小麦条锈病是典型的冷凉生态区气传真菌病害,病原菌在越夏易变区(即秋季菌源基地)的越夏情况决定了冬季繁殖区条锈菌的初侵染菌源。小麦条锈病的发生流行极易受到温湿度关键气象因子的影响。近年来的调查研究发现,我国小麦条锈菌越夏海拔下限逐年下降,且越夏区范围进一步扩大,说明条锈菌耐高温胁迫能力增强,给未来小麦条锈病流行规律研究及制定防治策略带来了全新挑战。真菌特有的Velvet转录因子家族中VosA基因参与了真菌生长发育和次生代谢的调控,但关于该转录因子在条锈菌耐高温性中的作用却知之甚少。实时荧光定量PCR分析发现,温度敏感菌系蓬9和耐高温菌系A4在侵染寄主过程中PstVosA1基因均受高温胁迫诱导表达,但耐高温菌系PstVosA1相对表达水平明显高于温度敏感菌系蓬9。利用寄主诱导的基因沉默技术(HIGS)沉默小麦条锈菌耐高温菌系A4中的PstVosA1基因能显著降低在高温(21℃)接种条件下的平均发病严重度、孢子堆密度和生物量。研究结果说明PstVosA1基因正调控小麦条锈菌耐高温胁迫反应过程,增加该基因的表达水平,有利于增强小麦条锈菌耐高温性。     

江苏省水稻条纹叶枯病上升原因及防治对策

分析了江苏省近年来水稻条纹叶枯病的上升原因,主要与感病品种面积扩大,灰飞虱发生量逐年加大等因素有关。在此基础上,结合本省各地防治实践,初步提出了控制条纹叶枯病综合防治措施,即坚持以“治虫防病”为主,结合推广有效农业措施,如种植抗性品种,以及肥床旱育、小苗抛栽等有利于推迟播期,避开灰飞虱迁移传毒高峰的轻型栽培技术。     

甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

 甘蔗宿根矮化病是由Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx)引起的一种世界性甘蔗细菌病害。根据Lxx的Pat1基因保守序列,设计并合成了一对特异性引物Pat1F (5′-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3′)/Pat1R(5′-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3′),和一条TaqMan探针(FAM-5′-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3′-TAMRA),建立了一种特异性强、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR方法,对Lxx的检测最低下限为10² copies·μL^-1。应用实时荧光定量PCR与常规PCR方法对14个甘蔗品种进行Lxx检测,阳性检出率分别为86%和43%,表明实时荧光定量PCR比常规PCR检测方法具有更高的灵敏度。研究结果为甘蔗宿根矮化病的诊断、田间发生动态监测、脱毒健康种苗检测及品种/材料交换检疫检测提供了新技术支撑。     

西瓜噬酸菌MarR家族转录因子Aave_3922的功能研究

 MarR(Multiple antibiotic resistance regulator)家族转录因子是一种广泛存在于细菌及古细菌中的转录抑制子。MarR可通过调控毒力因子的表达来影响病原细菌的致病性,其调控机制独特,在不同菌中存在不同的调控网络。为明确其在西瓜噬酸菌中的功能及信号通路,以西瓜噬酸菌Aac5菌株为研究对象,构建MarR转录因子Aave_3922的缺失突变株及互补菌株,通过对表型及转录水平的测定,初步探究西瓜噬酸菌中MarR转录因子的功能及可能的调控网络。结果显示,与野生型Aac5菌株相比,突变菌株致病能力、生物膜形成能力、体内生长能力均显著下降,互补菌株有所恢复。同时,基因Aave_3922的缺失会显著影响三型分泌系统关键基因hrpX及hrcJ、毒性相关基因trbC、鞭毛及趋化性相关基因fliC及cheA、生物膜相关基因Aave_2620在西瓜噬酸菌中的表达量;与WT-hrpXpGUS相比,ΔAave_3922-hrpXpGUS的启动子活性显著减弱。以上结果表明Aave_3922基因可能通过参与hrpX的转录调控,以及调控生物膜形成来影响西瓜噬酸菌的致病能力。     

十字花科黑腐病菌hrp基因致病功能分析

通过对Xcc 8004菌株的hrp基因进行逐一敲除,系统研究单个hrp基因对Xcc致病性的贡献。结果表明,9个hrc(hypersensitive response and conserved)基因单独突变后在满身红萝卜上的致病性和在辣椒ECW-10R上激发HR的能力完全丧失;9个hrp基因中,hrpW突变后在辣椒ECW-10R上仍能产生HR,满身红萝卜上致病性减弱,其余hrp基因突变后致病性和过敏反应均丧失;4个hpa(hrp associated protein)基因突变后,hpaA和hpaB突变体完全丧失在满身红萝卜上的毒性也不能在辣椒ECW-10R上引起HR,hpa1和hpaP突变后致病性和HR显著减弱。另外,通过RT-PCR对Xcc 8004 hrp基因簇的每个基因受hrpX和hrpG的调控情况进行分析,结果表明所有hrp基因在不同程度上都受到hrpG、hrpX的正向调控。     

小麦抗条锈病已知基因对中国当前流行小种的有效性分析

 小麦条锈病是危害我国小麦生产最为严重的病害之一,评价已知抗条锈病基因相对于当前主要流行小种的抗病性对开展预见性抗病育种工作具有重要的指导意义。本研究利用当前流行频率最高的2个小种(CYR32、CYR33)和1个对Yr26基因有毒性的新菌系V26/CM42对已知抗条锈病(Yr)基因的小麦材料分别进行苗期小种抗病性鉴定和成株期病圃抗病性调查,以评估各已知Yr基因在中国抗病育种中的有效性。结果表明,只有3个Yr基因(Yr5、Yr15和Yr61)对当前流行小种和贵22新菌系表现为全生育期抗病性;3个Yr基因(Yr32、YrTr1和YrTye)具有成株期抗病性;此外,Mega、Ibis、Hyak、Maris Huntsman、Hobbit、CarstensV、Express、Lee和Compair等9个含多个Yr基因组合的抗源品种表现出良好的成株期抗条锈性。     

小檗公式在小麦条锈菌侵染过程中的表达特征

 小檗是小麦条锈菌的转主寄主,自然条件下在小檗上进行有性生殖不仅是条锈菌毒性变异的重要途径,也为病害的流行提供了初侵染源。目前条锈菌与小麦互作已经有较为细致深入的研究,而条锈菌与小檗分子互作的研究未见报道。NPR1是植物调控防卫反应的一个关键基因,本研究克隆得到小檗NPR1基因(BhNPR1),并对BhNPR1及其下游病程相关基因的表达模式进行了分析。与小麦NPR1基因受条锈菌夏孢子侵染诱导不同,BhNPR1的表达水平在条锈菌担孢子侵染小檗过程中保持稳定。另外,条锈菌侵染小檗过程中NPR1下游的病程相关基因BhPR5和BvPDF1.2a的表达量变化也不明显,而BhPR1和BhPR2则显著上调表达。这些结果表明BhNPR1及多个病程相关基因不参与对条锈菌的防卫反应,这可能是导致小檗先天免疫缺陷而成为多种锈菌共同的转主寄主。