浙江省铁皮石斛根腐病病原真菌的鉴定

为明确铁皮石斛根腐病病原真菌,于其主产地浙江省金华市武义县收集铁皮石斛根腐病病株,采用平板分离方法对病原真菌进行分离,使用镰刀菌种特异性引物并结合ITS和TEF序列分析及形态学鉴定确定该镰刀菌的分类地位。结果表明,共分离纯获得真菌117株,其中有105株镰刀菌;经分子生物学分析及形态学鉴定结果显示,分离出的镰刀菌为层出镰刀菌Fusarium prolife‐mum、茄病镰刀菌F. solani、尖孢镰刀菌F. oxysporum和厚垣镰刀菌F. chlamydosporum四个种,其中层出镰刀菌在数量上具有优势地位,占总镰刀菌数的44.8%;茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌、厚垣镰刀菌分别占总镰刀菌数的21.0%、15.2%和19.0%。在致病性测定中发现层出镰刀菌和茄病镰刀菌并不具备致病性,尖孢镰刀菌的致病性明显弱于厚垣镰刀菌,表明厚垣镰刀菌为浙江省金华市武义县铁皮石斛根腐病的主要致病菌。     

铁皮石斛黑斑病病原菌的鉴定和侵染过程的细胞学研究

 铁皮石斛(Denderobium andidium Wall. exLindl.)是名贵的中药材。随着大面积的人工栽培,石斛黑斑病在移植苗上普遍发生,已是石斛栽培中的一个重要病害。石斛黑斑病在义乌地区开始发生于4月下旬或5月初,主要为害移植苗的叶片,引起黑褐色病斑(图F)。     

石斛内生细菌DEB-2对5种辣椒病原真菌的抑制作用

为了探明石斛内生细菌DEB-2菌株对贵州辣椒病原真菌的抑制作用,采用生长速率法测定了菌株DEB-2发酵液对辣椒黑斑病病原菌Alternaria alternate、辣椒疫病病原菌Phytophthora capsici、辣椒黑点炭疽病病原菌Colletotrichum capsici、辣椒红色炭疽病病原菌Colletotrichum gloesporioide和辣椒早疫病病原菌Alternaria solani的毒力。结果显示,内生菌DEB-2菌株能显著抑制5种辣椒病原真菌菌丝生长和孢子萌发,菌丝尖端均有不同程度变粗、膨大、崩解或者菌丝分枝增多的现象;分生孢子及芽管产生畸形。DEB-2菌株发酵液对5种病原菌菌丝生长的抑制中浓度EC₅₀值分别是28.5、76.2、80.7、79.9、72.0 μL/mL;对辣椒疫病病原菌和早疫病病原菌分生孢子萌发的EC₅₀分别为73.5 μL/mL和68.7 μL/mL。研究表明,DEB-2菌株能有效地同时抑制5种辣椒病原真菌菌丝生长和孢子萌发,对该5种辣椒真菌病原菌具有一定的生防潜力,可作为生防菌进行开发和应用。     

1株枸骨内生真菌菌株的分类鉴定及其代谢产物的生防作用研究

 从浙江省天目山采集的枸骨中分离筛选到1株内生真菌菌株(编号为No.2),经形态特征、培养特性等方面研究,初步判定该菌株为木霉属真菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。该菌通过液体发酵能产生抗真菌活性的次级代谢产物Trichodermin,抑菌活性结果表明,Trichodermin对9种植物病原真菌菌丝生长和2种植物病原真菌孢子萌发均有不同程度的抑制作用。进一步研究发现,Trichodermin具有很高的热稳定性,在100℃以下抑菌活性趋于稳定。活体测定结果表明,Trichodermin对番茄灰霉病有较好的预防保护作用和治疗作用,在150 mg/L的剂量下对番茄灰霉病的保护效果为98.2%,治疗效果为97.4%。     

保存时间对中华羊茅种子内生真菌活力的影响

以分别保存于2004-2006年的带Epichloë内生真菌(E＋)中华羊茅Festuca sinensis为研究对象,探讨了随着保存时间的延长,内生真菌活力的变化。结果表明,随着保存时间的延长,中华羊茅种子带菌率、幼苗带菌率以及种子的发芽率、发芽指数、根长、苗长均有降低的趋势,同一年种子带菌率均高于幼苗带菌率,2006年带菌率最高,种子为95.80%,幼苗为93.10%;以3个年份的(E＋)中华羊茅草粉浸提液对细交链孢Alternaria alternata、燕麦镰孢Fusarium avenaceum和绿色木霉Trichoderma viride的抑菌活性研究表明,3个年份的带菌草粉浸提液对3种菌的菌落生长和孢子萌发均有一定的抑制作用,但保存时间越长,其抑菌能力越弱,2006年的抑菌率为63.51%,2004年为25.49%,而2006年的抑制产孢能力为69.25%,2004年仅为26.34%。同时,从不同保存年份分离到的内生真菌在相同条件下再培养结果显示,保存时间越长的内生真菌生长越缓慢,产孢能力越弱,2006年的菌落直径为26.4 mm,而2004年仅为17.4 mm。说明随着保存时间的延长,内生真菌活力在逐渐下降,导致自身生长以及促进种子生长,抑制真菌的活性也开始减弱。     

七株黄瓜内生真菌对南方根结线虫二龄幼虫的不同作用

本文研究了7株黄瓜内生真菌对南方根结线虫Meloidogyne incognita的不同作用方式。结果表明,枝顶孢Acremonium sp.菌株Ac985、毛壳菌Chaetomium sp.菌株Ch1001和拟青霉Paecilomyces sp.菌株Pa972的PDB培养滤液对南方根结线虫J2具有致死作用,48h暴露后致死率分别达到100%、98.5%和100%;叶点霉Phyllosticta sp.菌株Ph511培养滤液对J2具有击倒作用,但击倒的虫体在清水中能恢复活性。木霉Trichoderma sp.菌株Tr882和菌株Ac985、Ch1001的培养滤液对J2的活动有趋避作用。镰刀菌Fusarium spp.菌株Fu234、Fu654和菌株Pa972、Ch1001、Ph511的菌丝可以穿透J2体壁并消化虫体。Ch1001、Fu654、Ph511三菌株孢子悬浮液处理黄瓜种子后,能诱导黄瓜萌发的主根对J2从其根尖伸长区穿透的抗性。     

禾草内生真菌与丛枝菌根互作对多年生黑麦草生长及叶斑病的影响

为明确禾草内生真菌和丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)互作对多年生黑麦草Lolium perenne生长发育及叶斑病的影响,设置禾草内生真菌处理(由带有和不带禾草内生真菌种子建立)、AMF(幼套球囊霉Claroideoglomus etunicatum和根内球囊霉Rhizophagus intraradices)单独接种和混合接种处理及不接菌处理(对照),并在植物生长6周后接种或不接种多年生黑麦草叶斑病病原菌根腐离蠕孢Bipolaris sorokiniana,测定各处理多年生黑麦草的发病率、叶绿素含量、净光合速率、水分利用效率、AMF侵染率、P含量和生物量。结果表明:接种病原菌2周后,多年生黑麦草叶斑病的发病率为25.00%～38.75%,禾草内生真菌和幼套球囊霉均在一定程度上降低了多年生黑麦草的发病率,二者共同作用时发病率显著降低了35.48%。禾草内生真菌与AMF互作能在一定程度上提高植物叶绿素含量,促进光合作用,并促进P吸收和植物生长,二者的互作效应因禾草内生真菌与AMF组合而异,但均优于二者单独使用时的效应,其中禾草内生真菌与幼套球囊霉互作对多年生黑麦草生长及叶斑病防治的效果最好。     

宁夏地区苦豆子内生真菌的分离与初步鉴定

为了探讨宁夏地区苦豆子内生真菌类群的多样性,以宁夏地区苦豆子草为试验材料,采用组织分离法从其根、茎、叶中分离内生真菌,依据形态进行初步鉴定。结果表明,从宁夏地区苦豆子875个表面消毒的根、茎、叶组织块中,共分离出内生真菌115株。其中根中分离出18株,占15.7%,茎中分离出41株,占35.7%,叶中分离出56株,占48.6%,分布规律为叶、茎、根依次递减,叶组织中的内生真菌多样性较高。对产孢的113株进行初步鉴定,分类为2纲3目5科7属,其中青霉属(Penicillium)3株,占2.6%,黑葱花霉属(Periconia)4株,占3.6%;链格孢属(Alternaria)45株,占39.1%;镰孢霉属(Fusarium)9株,占7.8%,曲霉属(Aspergillus)10株,占8.7%,枝梗茎点霉属(Dendrophoma)30株,占26.1%,根霉属(Rhizopus)9株,占7.8%;其中链格孢属(Alternaria),枝梗茎点霉属(Dendrophoma)为优势种群。宁夏地区苦豆子内生真菌多样性丰富,同时不同部位内生菌的数量、种类及分布存在差异。     

玉米内生真菌对草地贪夜蛾生长发育的影响

为探明玉米内生真菌对草地贪夜蛾生长发育的影响,寻求草地贪夜蛾绿色防控新方法,本文将玉米内生真菌白僵菌YC1和链格孢菌GX5处理的玉米种子种植于田间,常规管理,取其鲜玉米籽粒饲喂草地贪夜蛾初孵幼虫,测定了草地贪夜蛾幼虫发育历期、化蛹率、蛹期、蛹重、羽化率、成虫重等指标。结果表明,玉米内生真菌YC1处理组草地贪夜蛾幼虫发育历期较对照显著延长,比对照增加69.36%,蛹期和化蛹率略有降低,羽化率和对照组(65.08%)相比明显降低,仅有3.33%;GX5处理组草地贪夜蛾的幼虫发育历期较对照显著延长,化蛹率(16.67%)和羽化率(8.33%)也明显降低。蛹重、成虫重、翅展以及翅长在处理间及处理和对照间没有明显的差异。从试验结果来看,玉米内生真菌YC1和GX5均对草地贪夜蛾生长发育不利,可大大降低其繁殖率,在可持续控制草地贪夜蛾方面具有较大的应用潜力。     

内生真菌对青贮玉米幼苗抗旱性的影响

为了研究干旱胁迫下内生真菌对青贮玉米幼苗生长的影响并筛选可以提高青贮玉米幼苗抗旱性的菌株,开展盆栽试验,将分离自西鄂尔多斯荒漠强旱生孑遗植物四合木、沙冬青、绵刺等植物根系的8株内生真菌和1株内生真菌模式种印度梨形孢,以灌根的方式分别接种到青贮玉米幼苗根系,镜检侵染率后,采用PEG6000模拟重度干旱胁迫培养2周,测定青贮玉米幼苗生理生化指标并计算抗旱系数,利用主成分分析法综合评价内生真菌对青贮玉米幼苗抗旱性的影响。结果表明：所有菌株均能侵入青贮玉米根系形成共生,但侵染率存在差异;在未接菌（E-）组的非胁迫和胁迫植株之间,地上部分鲜重、叶相对含水量、叶绿素含量、根体积、根表面积、根鲜重、根干重、根干物质含量、Pro含量、MDA含量、CAT活性、SOD活性、POD活性等13个指标存在显著差异,基于13个生理指标的主成分分析表明,只有Am04、Tm36、Tm02、印度梨形孢等4株内生真菌可提高青贮玉米幼苗抗旱性,并以菌株Am04最优;而Pm53、Tm30、Pm38、Pm06、Pm57等5株内生真菌并未提高青贮玉米幼苗抗旱性;且侵染率和大多数抗旱性生理指标之间无相关性。因此,不同内生真菌对青贮玉米幼苗抗旱性具有不同程度影响,其中菌株Am04较其他菌株更有利于提高青贮玉米幼苗抗旱能力。     

手掌参内生真菌及根际土壤真菌的群落组成

为筛选促生菌,采用高通量测序技术对手掌参茎、叶、果荚和根4种组织内生真菌及根际土壤真菌的群落组成进行分析。结果表明:从手掌参所有组织样品及根际土壤中共获得4 192个操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU),其中茎中OTU数量最多,为1 096个,其次为根际土壤和叶中,分别为1 048个和983个,根中最少,为397个。所有样品中OTU注释后隶属于4门15纲,优势菌群为子囊菌门,相对丰度为47.25%～81.58%。属水平上主要菌群为枝孢霉属Cladosporium、粉褶蕈属Entoloma、背芽突霉属Cadophora和赤霉菌属Gibberella,分别为果荚、土壤、根、叶和茎中优势菌群。多样性指数表明茎中真菌群落的丰富度及多样性最高,而根部最低,不同样品之间真菌群落的多样性和丰富度差异显著。热图分析和主坐标分析均表明茎、叶和果荚中内生真菌的群落组成较相似,但与根部内生真菌和土壤中真菌的群落组成存在一定差异。     

氯虫苯甲酰胺和吡唑醚菌酯在铁皮石斛中的残留及消解动态

建立了QuEChERS-液相色谱-质谱联用 (LC-MS/MS) 同时测定铁皮石斛茎和叶中氯虫苯甲酰胺和吡唑醚菌酯残留量的分析方法,并采用该方法研究了这2种农药在铁皮石斛中的消解动态及最终残留量。样品经乙腈提取,用N-丙基乙二胺 (PSA)、C₁₈和石墨化碳 (PC) 净化。正离子电离,多反应监测模式,LC-MS/MS测定,外标法定量。结果表明:在0.10~60 mg/kg添加水平下,氯虫苯甲酰胺在铁皮石斛茎和叶中的平均回收率为74%~90%,相对标准偏差 (RSD) 为3.2%~4.1%;吡唑醚菌酯在铁皮石斛茎和叶中的平均回收率为75%~104%, RSD为1.7%~4.4%。样品中氯虫苯甲酰胺和吡唑醚菌酯的定量限 (LOQ) 均为 0.1 mg/kg。氯虫苯甲酰胺和吡唑醚菌酯在铁皮石斛中消解较慢,120 d时,氯虫苯甲酰胺在铁皮石斛茎和叶中的降解率分别为40%和72%,吡唑醚菌酯在铁皮石斛茎和叶中的降解率分别为80%和94%。吡唑醚菌酯在铁皮石斛叶中的消解半衰期为38.1 d。5%氯虫苯甲酰胺悬浮剂按有效成分37.5 g/hm2施药1~2次,施药间隔为7 d,当采收间隔期为30 d时,氯虫苯甲酰胺在茎和叶中的残留量均小于3 mg/kg。25%吡唑醚菌酯水分散粒剂按有效成分187.5 g/hm2施药2~3次,施药间隔为7 d,当采收间隔期为90 d时,吡唑醚菌酯在茎和叶中的残留量均小于8 mg/kg。     

一株银杏内生真菌代谢产物抗菌活性初步研究

从浙江长兴采集的银杏茎中分离到一株内生真菌,编号为1028。本文对其产生的代谢产物进行了抑菌活性的初步研究,生测结果表明:离体条件下发酵液对番茄早疫病菌、黄瓜枯萎病菌、菜豆炭疽病菌、葡萄炭疽病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜立枯病菌均有较强的抑制作用,对不同病原菌的抑制率分别为:66.7%、48.3%、64.6%、36.5%、57.1%、23.0%。抑菌活性成分在80℃以下趋于稳定,pH为7～8时抑菌效果最强。     

铁皮石斛轮纹病病原菌鉴定及其防治药剂筛选

为明确近年来在铁皮石斛Dendrobium officinale叶片及茎秆上出现的一种新病害—轮纹病的病原菌及筛选其有效防治药剂,通过分离物致病性测定、形态学观察和rDNA-ITS序列分析对病原菌进行鉴定,同时测定了11种药剂对病原菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑菌效果。结果表明,从铁皮石斛病样中分离到的菌株TPLW01在致病性试验中表现出的症状与其田间自然感病症状一致,证明菌株TPLW01为铁皮石斛轮纹病的致病菌。该病原菌菌落在PDA培养基上初期为白色、绒毛状,后期菌落上长出同心环状排列的暗绿色至黑色的分生孢子座;分生孢子梗无色,圆柱形,有3~5轮分枝;分生孢子无色、单胞、杆状两端钝圆,大小为5.0~7.5μm×1.5~2.5μm;形态特征与露湿漆斑菌Myrothecium roridum一致。该菌rDNA-ITS序列的Gen Bank登录号为MF939638,与露湿漆斑菌(登录号KX421205.1)同源性为100.0%,分子鉴定结果与形态鉴定结果一致,确定引起该病的病原菌为露湿漆斑菌。6%春雷霉素可湿性粉剂1 000倍液、42.8%氟菌肟菌酯悬浮剂3 500倍液、29%吡萘嘧菌酯悬浮剂1 500倍液、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂1 000倍液对该菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制效果均达到100.0%,表明这4种药剂可用于铁皮石斛轮纹病的田间防治。     

野生药用植物内生真菌的分离及拮抗菌株筛选

为挖掘生防新资源,采用组织分离法从21种野生药用植物不同组织部位分离纯化内生真菌,以6种植物病原菌为靶标菌筛选拮抗菌株,并根据形态学及分子生物学对菌株进行鉴定,在此基础上研究了高效拮抗菌株对靶标菌菌丝生长及孢子萌发的影响。结果表明:从分离纯化的478株内生真菌中筛选出11株高活性拮抗菌株,分属于青霉属Penicillium、平脐蠕孢属Bipolaris、棘壳孢属Pyrenochaeta、镰孢属Fusarium、粒毛盘菌属Lachnum、垫壳孢属Coniella和Neonectria 7个属,其中青霉属占比最高,达36.36%。平皿对峙试验表明, 棘壳孢菌12-R-5对灰葡萄孢表现出高效性和专一性,其对菌丝抑制率达66.67%。含药平皿试验表明,菌株12-R-5发酵滤液10倍稀释液对灰葡萄孢菌丝生长抑制率达100%,与其他处理差异显著。菌株12-R-5 10倍发酵滤液处理灰葡萄孢10 h,孢子不萌发;100倍稀释液处理对孢子萌发抑制率为91.01%。显微镜观察发现,棘壳孢菌使灰葡萄孢菌丝扭曲变形,膨大肿胀及断裂,部分菌丝发生抑缩、消融现象。说明棘壳孢菌12-R-5菌株具有很好的生防潜力及应用前景。     

枸杞内生真菌对胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的拮抗作用及生防潜力

为了明确枸杞内生真菌对胶孢炭疽菌的抑制作用,通过室内抑菌试验和离体试验测定了内生真菌对胶孢炭疽菌的抑制作用及对枸杞炭疽病的防治效果。结果表明,镰刀菌属Fusarium菌株NQ8GII4、NQ8GII7、NQ7GII4和篮状菌属Talaromyces菌株NQ6GIII11对胶孢炭疽菌有明显的拮抗作用。平板对峙试验显示,上述4株枸杞内生真菌具有较强的营养和空间竞争能力,菌株NQ8GII4对病原菌的抑制率高达93.43%。显微观察发现,枸杞内生真菌能缠绕并穿透胶孢炭疽菌菌丝,使胶孢炭疽菌菌丝膨胀崩解。菌株NQ7GII4的培养滤液在浓度为15%时对病原菌菌丝的抑制率达到70.75%,菌株NQ8GII7产生的挥发性物质对胶孢炭疽菌抑制率高达83.44%。离体生防试验结果表明,用拮抗性内生真菌预先占位接种枸杞嫩果及叶片,能有效抑制枸杞炭疽病菌的侵入和病斑的扩展,菌株NQ8GII4 10%培养滤液对枸杞炭疽病的防治效果最强,防效达到了92.54%和95.57%,说明枸杞内生真菌具有很好的生防潜力和应用前景。     

东省不同地区玉米内生真菌的群落组成和多样性分析

为探究山东省玉米内生真菌的资源分布、群落组成及多样性,采用叶片组织分离法对山东省52个市县的玉米内生真菌进行分离纯化,通过内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列分析技术进行内生真菌的种属鉴定,并分析内生真菌的群落组成和多样性。结果表明,共分离到857株内生真菌,隶属25个属,其中链格孢属Alternaria的菌株数量最多,为583株,占总菌株数的68.03%,其次为镰刀菌属Fusarium有71株,占总菌株数的8.28%;大部分地区的优势属为链格孢属,少数地区的优势属为镰刀菌属、炭疽菌属Colletotrichum和弯孢属Curvularia。不同地区的内生真菌定殖率变化很大,在12.50%~100.00%之间,平均定殖率为76.15%;陵城的多样性指数和均匀度指数最高,分别为1.74和0.97;莱芜的丰富度指数最高为2.22。山东省玉米内生真菌可以分为5个类群,其中黄河流域地区内生真菌定殖率相对较高。表明山东省玉米内生真菌种类丰富,不同地区间多样性水平存在差异。