一种高效构建多位点突变重组质粒的方法（英文）

定点突变技术是蛋白质结构与功能研究的必要手段之一,随着蛋白质结构生物学深入发展,研究中要同时构建多位点、批量表达载体,研究者基于重叠延伸PCR和双接头PCR方法,优化建立一种高效构建多位点突变重组表达质粒的方法。     

苏云金芽孢杆菌cry218基因改造

通过合成特异性的寡核苷酸，利用定点突变和ＰＣＲ扩增技术，在苏云金芽孢杆菌ｃｒｙ２１８杀虫晶体蛋白基因的编码区上游－１４４ｂｐ和下游２４２ｂｐ处分别引入ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ位点，以利于该基因克隆到其它表达载体中。当修饰后的ｃｒｙ２１８基因克隆到表达载体和穿梭载体后，均能表达出对小菜蛾有毒的１３０ｋＤａ蛋白质     

番茄抗枯萎病I2基因的SNP分型

利用直接测序方法检测番茄抗感品种I-2基因的DNA序列,发现了2个SNPs。以其为3′端,设计等位基因特异引物及其互补引物,研究了特异引物3′端碱基错配类型和位置对等位基因特异PCR的影响,并对52份种质资源进行了SNP分型。结果表明在下游引物3′末端第1、2位引入错配碱基可以提高反应的准确性;引入C-T碱基错配的引物,退火温度在58℃时能把I-2基因的突变位点和感病品种的对应位点区分开来,为番茄抗枯萎病辅助育种提供了有力工具。     

绿针假单胞菌YL-1抗细菌活性相关基因的克隆和分析

绿针假单胞菌YL-1对植物多种重要病原细菌和病原真菌有较强的抑制作用。采用转座子插入突变技术电转化绿针假单胞菌YL-1,构建随机插入突变体库。通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对3种病原细菌荚壳伯克霍尔德菌Burkholderia glumae、解淀粉欧文氏菌Erwinia amylovora和胡萝卜果胶杆菌Pectobacterium carotovora抑菌效果显著下降的突变体,并采用PCR和Southern Blot验证转座子是否成功插入到YL-1染色体基因组上。利用质粒拯救技术克隆转座子插入位点基因、测序和生物信息学分析。结果表明:本研究成功构建了绿针假单胞菌YL-1随机插入突变体库,筛选出7株对3种病原细菌抑制效果明显下降的突变体,但其对立枯丝核菌的抑制效果与野生型菌株YL-1相同;PCR和Southern Blot试验结果表明绿针假单胞菌YL-1的7株突变体均是单拷贝;克隆到7个突变体插入位点的基因序列并测序,生物信息学分析结果表明其中6个突变位点是嗜铁素合成基因簇,1个突变位点是蛋白分泌基因sec Y。     

苏云金芽胞杆菌Cry1Ba3 蛋白定点突变对杀小菜蛾活性的影响

Cry1Ba3是由本实验室发掘的对小菜蛾有高毒力的杀虫晶体蛋白。为了寻找对杀虫活性有重要影响的氨基酸,为杀虫机理研究和改造杀虫蛋白提供理论依据,本研究利用Ple Bio Informatique Lyonnais数据库对Cry1Ba3的二级结构进行模拟;采用BioEdit软件分析Cry1Ba3的疏水区;将Cry1Ba3与Cry1Aa1、Cry2Aa1、Cry3Aa1以及Cry4Ba1进行多序列比对,从而确定了20个氨基酸突变位点。利用半重叠引物PCR的方法对Cry1Ba3进行定点突变,将突变体在大肠杆菌BL21中进行诱导表达。通过浸叶法对各个突变蛋白杀小菜蛾的生物活性进行测定。获得的20个Cry1Ba3突变体均能在大肠杆菌BL21中表达,并以包涵体形式存在。杀虫活性测定结果表明M6(R192L)、M10(W303A)、M19(H485G)对小菜蛾的活性明显降低,二级结构预测表明活性降低的突变蛋白的构象均发生明显变化,其余17种突变蛋白的活性和二级结构都没有明显变化。说明第192位的精氨酸、第303位的色氨酸和第485位的组氨酸对Cry1Ba3的杀小菜蛾活性有重要影响,上述3个位点氨基酸突变引起的蛋白活性减低可能与毒素的空间结构变化有关。     

Taqman-MGB探针在毒麦鉴定上的应用

本研究对毒麦及其近似种的ITS2序列进行扩增测序,根据序列比对得到的多态性位点设计特异性引物及Taqman-MGB探针,建立Real-time PCR检测毒麦的方法;同时对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评估。结果表明:该方法检测灵敏度能达到5×10-3 ng/μL,对其他黑麦草属样品检测结果均为阴性。本研究为毒麦样品的快速、准确检测奠定了基础。     

水稻抗白叶枯病基因Xa47(t) a的敲除及抗性鉴定

为鉴定水稻Xa47(t)a基因对白叶枯病的抗性,以水稻种质L214为材料,通过构建针对Xa47(t)a基因的Xa47(t)a-Cas9敲除载体来获得敲除突变体,利用生物信息学技术对突变的Xa47(t)a基因进行突变类型分析,同时采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术分析突变体中Xa47(t)a及病程相关基因的表达情况,并于水稻孕穗期对突变体及其野生型植株接种11株白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae菌株进行抗性鉴定。结果表明,在Xa47(t)a基因的第2外显子区域进行基因编辑后成功获得25株T₀代突变体株系;测序分析发现T₀代突变体株系中有13种不同的突变体类型,其中纯合突变体有3种类型,且突变位点均在靶标位点的11位碱基处缺失1～4个A碱基;氨基酸序列分析发现大部分突变体中Xa47a编码的蛋白翻译会提前终止,由原来的803个氨基酸变为144～166个氨基酸;qPCR分析结果表明突变体中Xa47(t)a及大部分病程相关基因的表达水平显著低于野生型株系;抗性鉴...     

大丽轮枝菌外切葡聚糖酶VdCBH1在毕赤酵母中的表达与酶活分析

 为了探究大丽轮枝菌外切葡聚糖酶VdCBH1(exoglucanase)的酶活与催化机理,本研究在生物信息学分析的基础上,以大丽轮枝菌V991菌株为材料克隆了VdCBH1基因,进一步构建了pPIC9-VdCBH1重组质粒并转入毕赤酵母中进行表达,测定了重组VdCBH1蛋白的外切葡聚糖酶活性;将预测的VdCBH1催化残基位点进行突变,随后通过SDS-PAGE分析了重组VdCBH1蛋白及其催化残基位点突变蛋白的表达情况,并检测了VdCBH1催化残基位点突变前后的酶活变化。结果表明,VdCBH1基因编码区全长1 356 bp,编码451个氨基酸,蛋白理论分子量大小为48.574 kDa,理论等电点为4.29,N端前17个氨基酸为信号肽序列。保守结构域和进化树分析表明,VdCBH1蛋白含有GH7_CBH_EG保守结构域,该结构域是糖基水解酶7家族(Glycosyl hydrolase family 7,GH7)所特有的,与尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiospermum)的外切葡聚糖酶蛋白亲缘关系最近。重组VdCBH1蛋白具有典型的外切葡聚糖酶活性,而Glu233催化残基单突变与Glu228、Asp230和Glu233催化残基三突变蛋白的酶活明显下降。这表明催化残基Glu233在外切葡聚糖酶活性中发挥更为重要的作用,Glu228、Asp230则可能在其中起协同作用。本研究为进一步揭示VdCBH1蛋白的催化机制奠定了理论基础。     

利用转座子Tn5诱变植物青枯菌获得胞外蛋白输出功能丧失突变体

 通过Tn5诱变技术,分离了植物青枯菌生理小种1号、3号的胞外蛋白输出功能丧失突变体。由于Tn5在其基因组单一的eep位点的插入,突变体失去了向培养滤液分泌产生胞外酶和胞外蛋白质的能力。用碱性磷酸酯酶基因PhoA作为报导基因,研究这些胞外蛋白穿越突变体细胞内膜,结果表明,这些胞外蛋白质可以穿过其内膜,但失去了穿越其外膜的能力。胞外多糖在植物体内和体外的产生没有受到eep基因位点突变的影响。该突变体失去了对番茄植株的致萎能力。     

油桐尺蠖核型多角体病毒 p35基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR技术从油桐尺蠖核型多角体病毒基因组中扩增得到p35基因的DNA序列，把PCR产物克隆到pMD-18载体上，核苷酸序列测定表明此片段与AcNPVp35基因同源性为100％，继而构建了表达质粒pGBp35，诱导后经SDS-PAGE检测表明获得了BsNPVp35基因在大肠杆菌BL21中包涵体形式的特异表达。     

表达aiiA基因多黏芽胞杆菌工程菌构建与功能分析

AiiA蛋白能够专一性地水解革兰氏阴性菌分泌的信号分子,从而抑制其致病基因的表达,减弱致病性。根据NCBI上公布的蜡状芽胞杆菌ATCC14579的aiiA序列设计引物,从苏云金芽胞杆菌Bacillusthuringiensis NBIN-861中扩增得到aiiA基因（GenBank登录号：MG704113）,全长基因约750 bp。将aiiA基因插入大肠杆菌表达载体pET-28a和芽胞杆菌表达载体pBMB1A中,构建重组表达载体pETaiiA和pBMaiiA,pETaiiA转化大肠杆菌BL21（DE3）,pBMaiiA转化多黏类芽胞杆菌NR1,获得重组工程菌BLaiiA和BPaiiA。SDS-PAGE和蛋白质谱鉴定表明AiiA蛋白均成功表达,利用指示菌紫色杆菌CV026检测发现目的蛋白具有水解N-酰基高丝氨酸内酯活性。其中纯化的AiiA蛋白（1.13 mg/mL）和重组菌BPaiiA浓缩的发酵上清液中的AiiA蛋白活性较高（透明圈直径分别为16和18 mm）,马铃薯致病性试验和抑菌试验结果表明该蛋白对胡萝卜欧文氏菌具有一定的抗病活性,但不具有抑菌活性。多黏芽胞杆菌NR1和重组菌BPaiiA发酵产生的抑菌物质含量均为1.2%～1.3%,具有良好的抑菌效果。本研究为构建更有效的生物防治菌株奠定了理论基础。     

表达的hrmA蛋白质具有诱导水稻细胞产生防卫反应的活性

 将丁香假单胞菌hrmA基因构建到原核表达载体pET 29中,得到重组载体pET hrmA。将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,获得了以包含体形式存在的融合蛋白。复性的融合蛋白能诱导水稻悬浮细胞的活性氧迸发,处理20min后达到峰值。Northern杂交结果表明hrmA蛋白能显著地诱导PBZ1基因在水稻悬浮细胞中表达,在所观察的时间内PBZ1基因表达丰度随处理时间延长而增加,用hrmA处理水稻植株,诱导了PAL基因的表达。实验结果表明hrmA融合蛋白具有激活水稻细胞防卫反应的活性。     

绿木霉Sm1基因的克隆、原核表达及蛋白纯化

木霉菌(Trichoderma spp.)是土壤内普遍存在的习居菌,具有多种生物防治功能,其中诱导植物免疫反应是重要的生物防治功能之一[1].木霉菌Sm1蛋白(small one protein)是从绿木霉(Trichoderma virens)中分离得到的一种低分子量、富含半胱氨酸的疏水性蛋白,属于蛋白类激发子,与Cerato-platanin基因家族有很高的同源性,具有诱导植物免疫抗性的作用[2].     

小麦矮缩病毒外壳蛋白基因的原核表达、抗体制备及应用

 小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV)引起的小麦矮缩病是近年来我国小麦生产中的一种重要病毒病害,急需研发快速精准的检测技术用于预测预报和病毒-介体相互作用的研究。本研究应用Gateway重组技术构建了外壳蛋白基因(Coat protein, CP)的原核表达载体,将重组表达载体转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导获得CP基因原核表达蛋白。以重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备得到了相应的抗体,Western blot检测表明制备的抗体能与CP重组蛋白、感病小麦和带毒叶蝉特异性结合,说明获得的抗体特异性高。用获得的抗体进行免疫荧光标记,观察到病毒分布在介体叶蝉的前中肠和中中肠部位,为WDV的预测预报和介体条沙叶蝉传毒机制的研究奠定了基础。     

番茄黄化曲叶病毒V 2基因原核表达及多克隆抗体制备

 通过PCR的方法,从番茄黄化曲叶病毒江苏分离物DNA中扩增到V2基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果显示其与报道的XH2分离物序列完全一致,核苷酸序列全长351 bp,编码115个氨基酸,推测分子量约13 kD。将该V2基因亚克隆到原核表达载体PET32a中获得重组表达载体PET32a-V2,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG可诱导1个分子量约为32 kDa的融合蛋白（含His标签）表达,经Ni⁺ NTA亲和柱纯化,获得纯化的重组蛋白,免疫家兔制备TYLCV-V2蛋白的多克隆抗体Anti-V2,间接ELISA测定Anti-V2的效价达1∶655 360,Western blot及DIBA分析结果表明Anti-V2可与V2蛋白发生特异血清反应,可为进一步研究V2蛋白的功能提供参考。     

毕赤酵母Mut+和Muts重组子表达美洲商陆抗病毒蛋白基因的比较

 将N末端信号肽和C末端毒性区域缺失突变的美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein,PAP)基因表达载体pPIC9KP酶切线性化后,通过电击转化整合到巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115菌株细胞中,PCR筛选出表型为利用甲醇快速型(Mut⁺)的重组子。在相同培养条件下比较Mut⁺重组子和利用甲醇缓慢型(Mut^s)重组子在表达缺失突变型PAP方面的异同。结果表明,诱导培养48 h后,Mut⁺重组子表达产物在SDS-PAGE胶上可见清晰目的带,而Mut^s重组子培养72 h才能见到微弱的目的带。抗病毒活性实验表明Mut⁺重组子和Mut^s重组子的表达产物均对TMV病毒侵染有明显的抑制作用,它们的抗病毒活性没有显著的差异。     

草莓镶脉病毒ORF I基因的克隆、原核表达及抗血清制备

The total DNA was extracted from strawberry leaves infected with Strawberry vein banding virus (SVBV) by CTAB method. Specific primer pairs were designed to amplify the gene ORF I of SVBV-Shenyang isolate by PCR, gene ORF I was cloned into modified prokaryotic expression vector pET-32a (+)-GST, the recombinant plasmid pET-ORF I was transformed into E. coli DH5α, then the positive clones were screened and sequenced. The recombinant plasmid was extracted and transformed into Escherichia coli BL2l (DE3), the fusion protein with an approximate molecular weight of 56 kDa was obtained with IPTG induction and Ni²⁺-NTA affinity column purification. The purified fusion protein was used to immunize the rabbits to prepare the specific antiserum. The result of ELISA showed that the titer of the prepared antiserum is up to 1:520 000, Western blot analysis indicated that the prepared antiserum could reacted specifically with purified recombinant fusion protein. Not only the expression of P1 protein in SVBV infected-strawberry leaves, but also the expression of P1 protein in P1-infiltrated Nicotiana benthamiana leaves could be detected, using 2 000 times diluted antiserum.     

草莓镶脉病毒ORF I基因的克隆、原核表达及抗血清制备

The total DNA was extracted from strawberry leaves infected with Strawberry vein banding virus (SVBV) by CTAB method. Specific primer pairs were designed to amplify the gene ORF I of SVBV-Shenyang isolate by PCR, gene ORF I was cloned into modified prokaryotic expression vector pET-32a (+)-GST, the recombinant plasmid pET-ORF I was transformed into E. coli DH5α, then the positive clones were screened and sequenced. The recombinant plasmid was extracted and transformed into Escherichia coli BL2l (DE3), the fusion protein with an approximate molecular weight of 56 kDa was obtained with IPTG induction and Ni²⁺-NTA affinity column purification. The purified fusion protein was used to immunize the rabbits to prepare the specific antiserum. The result of ELISA showed that the titer of the prepared antiserum is up to 1:520 000, Western blot analysis indicated that the prepared antiserum could reacted specifically with purified recombinant fusion protein. Not only the expression of P1 protein in SVBV infected-strawberry leaves, but also the expression of P1 protein in P1-infiltrated Nicotiana benthamiana leaves could be detected, using 2 000 times diluted antiserum.     

水稻条纹病毒NS2基因原核表达产物多克隆抗体制备及受侵染水稻和灰飞虱体内NS2检测

 The NS2 gene of Rice stripe virus (RSV) was amplified by RT-PCR, cloned into pGEM-T vector and sequenced. The NS2 gene was inserted into prokaryotic expression vector pET32a to produce recombinant plasmid pET32a-NS2. The recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli strain BL21 (DE3) pLysS. SDS-PAGE and Western blot analysis confirmed that NS2 fusion protein was expressed after induction by IPTG. The recombinant NS2 protein was purified with Ni²⁺-NTA agarose affinity chromatography and the polyclonal antibody against NS2 protein was raised in rabbit. NS2 protein was successfully detected in small brown planthopper (Laodelphax striatellus) at 1:1 600 dilution of the total protein of single planthopper and in infected rice (Oryza sativa) at 1:800 dilution of 10 mg leave by dot immunobinding assay using the polyclonal antibody.     

李属坏死环斑病毒CP基因在大肠杆菌中的表达及其抗血清制备

本实验用RT—PCR的方法获得李属坏死环斑病毒的印基因，并将其连接到表达载体pET-22b（＋）上，得到重组质粒pET—PNRSVCP，转化大肠杆菌BL21（DE3）后，用IPTG进行诱导表达。SDSPAGE和Westernblot分析结果表明，印基因在大肠杆菌中获得了高效表达，获得的融合蛋白分子量约为29．0kDa。将该融合蛋白免疫兔子，获得PNRSV特异性抗血清。酶联法（ELISA）测定的效价为1／1024。为用血清学方法检测该病毒提供了基础条件。