甘薯褪绿斑病毒外壳蛋白的分子变异及其特异抗血清制备

 甘薯褪绿斑病毒(Sweet potato chlorotic fleck virus,SPCFV)是侵染甘薯的主要病毒之一。本研究利用RT-PCR方法克隆了SPCFV中国4个分离物的外壳蛋白(CP)基因。序列分析表明,cp基因全长900 bp,编码299个氨基酸残基。4个分离物cp基因的核苷酸序列一致性为78.3%～89.9%,推导的氨基酸序列一致性为91.3%～95.7%,存在较大的分子变异。不同分离物CP氨基酸序列N末端的第3-32位氨基酸为多变区。将四川分离物的cp基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,cp基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原免疫家兔,制备了SPCFV CP的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清效价达1∶128 000,可用于田间甘薯样品的检测。     

百合斑驳病毒云南分离物 全基因组序列分析及CP结构预测

 对云南嵩明百合上发生的百合斑驳病毒(Lily mottle virus, LMoV)进行全基因组序列测定及分析,并对LMoV嵩明分离物(LMoV-SMi1、LMoV-SMi2)和玉溪分离物(LMoV-YXi1、LMoV-YXi2)外壳蛋白(coat protein,CP)基因进行序列比较,发现云南的LMoV分为2个类群,玉溪分离物属于种群I,嵩明分离物属于种群II。2个类群间的核苷酸和氨基酸同源性分别为86.7%~89.5%、90.1%~92.7%,玉溪分离物和嵩明分离物相比,cp基因发生了3个核苷酸的缺失。对国内外LMoV所有分离物的cp基因氨基酸序列进行系统进化分析,结果表明所有LMoV分离物可划分为2个种群,种群I分离物较种群II分离物几乎均存在1个苏氨酸缺失的差异。此外,对LMoV-SMi2的CP相关特性和空间结构进行了初步预测,认为该蛋白为球状,具有较强的表面可能性,不存在跨膜区域,大多数区域能够形成主要的抗原决定簇,主要集中在aa12-22、aa31-42、aa83-99、aa179-191、aa215-223、aa249-259区段,可作为制备抗血清选择抗原的参考。LMoV-SMi2和LMoV-YXi1在二级结构和三级结构上存在一定的差异,但总体空间结构差异不大。     

云南省烟草上双生病毒的发生与分布

 已报道云南省烟草曲叶病(Tobacco leaf curl disease, TLCD)由3种菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)的双生病毒引起。它们是烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus, TbCSV)、云南烟草曲叶病毒(Tobacco leaf curl Yunnan virus, TbLCYNV)和中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)。为了了解这3种病毒的分布, 2000~2005年, 从云南省4个市(州)采集了109个烟草曲叶病样品, 利用3种病毒的特异引物对采集样品进行了PCR检测。从保山市的烟草曲叶病样品中检测到3种病毒, 并且存在TbCSV+TbLCYNV、TbCSV+TYLCCNV和TbCSV+TbLYNV+TYLCCNV的复合侵染, 从大理州、文山州和红河州的烟草曲叶病样品中仅检测到TYLCCNV。对39个分离物部分序列的系统进化分析结果表明, 病毒分离物依据病毒种类和地理位置聚成几簇。对烟草曲叶病的流行和病害控制策略进行了讨论。     

我国灰比诺葡萄病毒分离物检测及基因序列分析

 灰比诺葡萄病毒(Grapevine Pinot gris virus, GPGV)是国内新近报道的葡萄病毒,能引起葡萄叶片褪绿斑驳、皱缩及变形等症状,严重影响葡萄长势。为明确我国GPGV的发生及基因序列变异情况,本研究采用RT-PCR方法对采自我国15个省(市)自治区的195个葡萄样品进行检测,其中55个葡萄样品检测出GPGV。对49个GPGV阳性分离物的外壳蛋白(coat protein, cp)和运动蛋白(movement protein, mp)基因进行克隆、测序, 序列分析结果显示:来源于国内外的GPGV分离物cp基因和mp基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为85.30%~100%和95.00%~100%、85.73%~99.87%和95.58%~100%。基于cp和mp基因序列构建的进化树,将GPGV分离物划分为3个明显的组群。其中,大部分GPGV分离物被划分在组群1内,其它中国GPGV分离物形成2个新的组群2和3。本研究是关于中国GPGV分离物基因序列变异的初次报道,可为进一步开展GPGV分子检测的技术研发及不同变种的致病性研究提供依据。     

来源于桃和苹果的苹果褪绿叶斑病毒的部分分子生物学特性和cp基因的原核表达

 从桃和苹果上分离得到苹果褪绿叶斑病毒ACLSV-HBP和ACLSV-C2个分离物,采用RT-PCR法进行扩增,所获扩增片段经序列测定,其全长分别为1768nt(ACLSV-HBP)和1751nt(ACLSV-C)。这2个分离物扩增片段全长的同源性为83%,mp基因片段核苷酸和推导编码氨基酸序列同源性分别为82.6%和87.1%;cp基因均由582nt组成,其核苷酸和推导编码氨基酸序列同源性分别为87.8%和95.9%。将2个分离物的cp基因与已报道ACLSV分离物进行序列同源性比较,结果显示ACLSV-HBP与SX/2的cp基因核苷酸序列及推导编码氨基酸序列同源性最高,分别为94.0%和96.4%。将ACLSV-HBP分离物的cp基因克隆到原核表达载体pGEX-KG,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小约为46kDa。Western-blot分析表明,该基因在大肠杆菌内得到高效表达,融合蛋白具有抗原性。     

辽中地区西瓜花叶病病原的分子鉴定

 利用ELISA和RT-PCR方法对采自我国辽中地区的西瓜花叶病样品进行检测,表明其病原为黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)。将此分离物(CGMMV-Wcn)的外壳蛋白基因克隆后进行序列分析,结果表明其cp基因由486个碱基组成,编码161个氨基酸,与已报道的其它分离物一致;CGMMV-Wcn所致症状与西瓜株系(CGMMV-W)相同,且二者cp基因的氨基酸序列完全一致,因此该分离物应为CGMMV-W。     

内质网应激因子NAC089突变体的创建及其对病毒侵染胁迫的响应

 有研究表明烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)或黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)侵染烟草能够激活转录因子NbNAC089,从ER膜移至细胞核。为进一步阐释内质网应激因子NbNAC089对病毒侵染胁迫的响应机制,利用CRISPR/Cas9技术构建敲除载体,经烟草遗传转染获得NbNAC089基因突变植株。植株接种病毒后采用qRT-PCR检测病毒CP基因和寄主UPR基因的表达。结果表明:CRISPR/Cas9系统定点敲除NbNAC089基因后,目的基因靶位点序列有碱基的置换与缺失。正常生长条件下,转基因植株与野生型无差异。植株接种TMV-GFP后24~96 h,突变体中UPR基因(BiP、bZIP28、bZIP60)的表达量显著高于野生型;接种TMV-GFP后2~6 d突变体中病毒的积累量和扩展速度显著高于野生型。表明NbNAC089为UPR的抑制因子,对病毒增殖具有负调控作用。     

甘薯潜隐病毒外壳蛋白基因的克隆、表达及其抗血清的制备

 根据已报道的甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)外壳蛋白(CP)基因的核苷酸序列合成引物,利用RT-PCR方法克隆了SPLV河南分离物(SPLV-HN)的CP基因及部分3'端非编码区序列,序列分析表明,SPLV-HN CP基因由879个核苷酸组成(GenBank登录号为DQ399862),编码293个氨基酸残基。与GenBank中SPLV-CH(X84011)和SPLV-T(X84012)分离物的核苷酸序列相似性分别为96.8%和93.0%;与日本分离物(E15420)的核苷酸序列相似性为83.6%。将CP基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPLV外壳蛋白的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甘薯样品的检测。     

油菜花叶病毒武汉株系基因组全序列分析

 油菜花叶病毒(Oilseed rape mosaic virus,ORMV)武汉株系(Wh)基因组全序列分析表明,该株系基因组全长6301nt,与烟草花叶病毒属(Tobamovirus)亚组Ⅲ病毒基因组结构相似,含4个开放阅读框架(open reading frame,ORF),ORF2与ORF3有77nt的重叠区。与该属其他病毒对应ORF的核苷酸及编码蛋白氨基酸序列比对,ORMV-Wh与亚组Ⅲ的ORMV、车前草花叶病毒上海株系(Ribgrass mosaic virus,RMV-Sh)、车前草花叶病毒凤仙花株系(RMV-Imp)和烟草花叶病毒十字花科和大蒜株系(Tobacco mosaic virus,TMV-Cg)一致性最高,均超过95%。4种蛋白的氨基酸序列系统进化树构建将Tobamovirus亚组Ⅲ株系分为3个群,ORMV-Wh归为ORMV代表的株系群。     

2012年-2022年TBTV、TVDV、TBTVsatRNA和TVDVaRNA在云南主要烟区的发生与分布

烟草丛顶病(tobacco bushy top disease,TBTD)是一种由烟草丛顶病毒(tobacco bushy top virus,TBTV)及其卫星RNA(tobacco bushy top virus satellite RNA,TBTVsatRNA)和烟草扭脉病毒(tobacco vein distorting virus,TVDV)及其伴随RNA(tobacco vein distorting virus associated RNA,TVDVaRNA)共同侵染引起的危险性病害,曾在云南很多烟区造成严重损失。本研究对烟草丛顶病及其相关病原物在云南烟草上的发生情况进行了多年的调查研究,力图对烟草丛顶病及其相关病原物的发生与分布进行追踪和分析。结果表明,2012年-2022年,烟草丛顶病在云南各大烟区仅零星发生,2019年以来已很难发现。烟草丛顶病的相关病原物主要在曾经暴发流行过病害的楚雄、保山和大理发现,且TBTV、TVDV、TBTVsatRNA和TVDVaRNA在烟草上并不总是同时被检出,其中引起烟草丛顶病典型症状的TBTV+TVDV+TBTVsatRNA+TVDVaRNA检出率在5%以下,TVDV的检出率最高,达30.44%,TBTVsatRNA的检出率最低,为7.68%。TBTV、TVDV、TBTVsatRNA和TVDVaRNA不能同时感染同一烟株可能是当前烟草丛顶病很少发生的主要原因。     

烟草脉带花叶病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

 利用马铃薯Y病毒属病毒的简并引物, 通过RT-PCR技术获得了云南烟草病毒分离物YND的3'端约1.7 kb片段, 序列分析证明该分离物为烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV)。将TVBMVcp基因克隆到表达载体pET-22b (+)上, 在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出分子量为35.0 kD的融合蛋白。利用该融合蛋白制备了TVBMV的多克隆抗体, ELISA测定抗血清效价为1/4 096。Western blotting和DIBA分析结果表明, 获得的抗血清和原核表达的病毒蛋白及植物病汁液中的病毒均有特异性反应, 可用于TVBMV的快速检测。     

烟草丛顶病毒RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)介导的体外复制体系

通过重叠PCR扩增得到烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)中国分离物RdRp的编码序列,构建以pMALC2X为基础载体的原核表达载体pMAL-TB-RdRp。0.5 mM IPTG诱导可特异性表达分子量约为120 kDa的MBP-RdRp融合蛋白。温度梯度实验显示,18℃下诱导表达的MBP-RdRp融合蛋白的可溶性比例较高,约17%;经亲和层析纯化的MBPRdRp可特异性识别TBTV正链和负链的3'末端序列,催化体外复制;对正负链的3'末端的体外复制效率存在差别,识别负链3'末端的体外复制效率明显高于正链3'末端。本研究创建的TBTV RdRp介导的体外复制体系为进一步研究TBTV基因组复制调控奠定了基础。     

烟草丛顶病毒ORF1蛋白的多克隆抗体制备及应用

PCR扩增烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)的ORF1序列并克隆到原核表达载体pEHISTEV中,转化大肠杆菌Rosetta菌株经IPTG诱导表达TBTV ORF1蛋白。利用切胶纯化的ORF1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备并获得抗血清,间接ELISA检测效价为1:24 3000。经抗原亲和纯化从抗血清中得到特异性和灵敏度俱佳的ORF1多克隆抗体。Western blot分析显示,TBTV ORF1多克隆抗体既可以检测田间发病的烟草丛顶病样品中ORF1蛋白,也可检测在体内和体外翻译体系中的TBTV ORF1蛋白的表达。另外发现ORF2蛋白以ORF1延长蛋白的形式存在,根据ORF1和ORF2的重叠情况及潜在的七核苷酸滑动序列和下游的稳定二级结构,推测此ORF1延长蛋白是移码翻译产物。     

侵染百合的黄瓜花叶病毒亚组Ⅱ分离物cp基因克隆和序列分析

 从云南大理的东方型百合上得到黄瓜花叶病毒分离物(CMV-DL), ELISA检测初步确定为CMV亚组Ⅱ分离物, 设计并合成CMV亚组Ⅱ的特异引物, RT-PCR扩增得到1条约800 nt的特异片段, 经克隆及序列测定, 该片段长828 nt, 包含的外壳蛋白(CP)基因由657 nt组成。将该分离物的cp基因与其它14个CMV分离物进行同源性比较, 在核苷酸水平上与CMV亚组I和亚组Ⅱ的同源性分别为76.8%~78.1%和98.6%~99.2%;在氨基酸水平上与CMV亚组I和亚组Ⅱ的同源性分别为82.0%~84.3%和95.9%~100.0%。结果表明CMV-DL为CMV亚组Ⅱ成员。     

融合海肾荧光素酶的重组病毒在移码和通读研究中的应用初探

<正>海肾荧光素酶(Renilla Luciferase,Rluc)可催化腔肠素(coelenterazine)氧化产生高能量中间产物,氧化过程同时发出蓝色生物荧光,最强荧光波长465 nm。鉴于荧光素酶生物发光的高灵敏度检测特性,由海肾荧光素酶和另一种萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase,Fluc)组成的单报告和双报告基因检测系统广泛应用于生命科学研究领域,如遗传毒性检测、信号通路研究和某些顺式作用元件的     

一种侵染滇重楼的Potexvirus病毒分离物分子鉴定及其3'末端序列分析

 从云南武定的滇重楼上得到一个病毒分离物Paris-YN,病毒粒体为弯曲线状。利用RT-PCR扩增获得一条1074bp的片段,序列比较分析发现其与马铃薯X病毒属(Potexvirus)病毒3'末端的结构最为相似,且与属内的白三叶草花叶病毒等20个不同分离物3'末端有36.7%~58.9%的同源性;该病毒cp基因长639个核苷酸,编码212个氨基酸(22.8kDa),与20个Potexvirus病毒分离物的CP氨基酸序列比较发现,Paris-YN与白三叶草花叶病毒的CP氨基酸同源性最高(60.1%)。证据表明,该分离物可能为Potexvirus的新成员,暂命名为重楼X病毒(Paris polyphylla virus X)。     

中国番木瓜曲叶病毒南宁分离物的基因组结构特征

 从广西南宁田间表现曲叶症状的番木瓜植株上分离到病毒分离物G4,经三抗体夹心ELISA (TAS-ELISA)检测,G4与粉虱传双生病毒的抗体呈阳性反应。对G4 DNA-A全序列测定和分析表明,G4 DNA-A全长2 748个核苷酸,共编码6个ORFs。同源性比较及系统进化关系分析表明,G4 DNA-A与在亚洲发现的粉虱传双生病毒关系较近,其中与我国报道的中国番木瓜曲叶病毒(PaLCuCNV)同源性最高,达到98.0%。进一步比较发现,G4 DNA-A编码的AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4与PaLCuCNV相应ORFs的氨基酸同源性分别为98.4%、95.7%、97.5%、97.8%、94.1%和94.6%,表明G4应属于PaLCuCNV的一个分离物。G4编码的ORFs与中国胜红蓟黄脉病毒(AYVCNV)、辣椒曲叶病毒(PepLCV)及烟草曲茎病毒(TbCSV)有较高的氨基酸同源性,可能起源于共同的祖先。利用DNA-B及卫星DNAβ的保守引物均未能从G4分离物中扩增出相应的组分。     

烟草花叶病毒丁香分离物的分离与鉴定

 从表现花叶症状的丁香病株上获得一病毒分离物,其在电镜下为约300 nm×18nm的杆状粒子;电泳分析表明感病组织中ds RNA大约为6.4kbp,而其外壳蛋白分子量约为17.6k Da。以上实验结果初步将该病毒分离物鉴定为烟草花叶病毒属(Tobamovirus)。根据该属病毒复制酶基因序列设计通用引物,进行RT-PCR检测,扩增出约1000 bp的预期特异片段(Gen Bank AY566703)。将PCR产物克隆后测序,序列分析表明,与从蚕豆中分离的TMV-B株系序列(Gen Bank AJ011933.1)同源性为99.90%。根据烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的RNA CP基因序列设计引物,进行RT-PCR,扩增出约800 bp的预期特异片段(Gen Bank AY56672),序列分析表明,与TMV-B株系序列(Gen Bank AJ011933.1)同源性达99%,上述实验结果表明,该病毒分离物为TMV。由于该分离物与TMV-B在指示植物上的症状存在明显差异,所以,作者把该分离物暂命名为TMV-S。