线粒体羧酸盐转运蛋白BcMito-TTP参与灰葡萄孢致病、产孢及菌核发育的研究

 灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)可侵染1 400多种植物,给全世界农作物生产造成了严重的损害。BcMito-TTP蛋白是一种进化保守的线粒体羧酸盐转运蛋白,酿酒酵母中研究发现该羧酸盐转运蛋白主要负责催化柠檬酸盐通过线粒体内膜流出以交换羧酸盐H⁺离子等。本研究通过对BcMito-TTP基因进行敲除和功能互补发现,与原始菌株相比,敲除转化子生长速度没有差异,但产孢量有所降低,致病力明显减弱,菌核形成进程推迟。BcMito-TTP敲除转化子在添加CH₃COONa培养基中生长速度变慢且将BcMito-TTP基因互补可以恢复上述生物学性状。推测BcMito-TTP蛋白的缺失阻碍了CH₃COONa在灰葡萄孢体内的运输继而影响其孢子和菌核的形成,BcMito-TTP 基因参与灰葡萄孢致病力分子机制正在进一步研究之中。     

葡萄拟尾孢菌分生孢子萌发特性及病菌致死温度

葡萄拟尾菌分生孢子萌发适温为 15～35℃ ,最适25℃。分生孢子和菌丝高温致死温度分别为50℃10min和54℃ 10min。分生孢子对 pH适应范围较广 ,萌发适宜pH为5～9,在 pH 7时最佳。不同光照条件下 ,散射光对分生孢子萌发有明显的抑制作用 ,而荧光利于孢子萌发。分生孢子萌发对相对湿度的要求较高 ,RH低于93%不能萌发。在不同营养液里分生孢子均能萌发 ,其中葡萄叶汁对孢子萌发有促进作用 ,以 1%葡萄叶汁的刺激作用最强 ,孢子萌发率最高 ,萌发速度也最快 ,6h后萌发率即达82.00%。     

灰葡萄孢蛋白激发子BcGs1诱导番茄抗病性及功能结构域鉴定

病原菌与植物互作过程中分泌的细胞壁降解酶具有致病和激发植物免疫的双重功能。BcGs1是从灰葡萄孢菌代谢物中分离的葡聚糖-1,4-α糖苷酶,能激发番茄和烟草的免疫防御反应,提高抗病性。BcGs1包含糖苷水解酶家族15(GH15)和糖结合模块家族20(CBM20)两个结构域,其激发植物防御反应的作用方式及功能结构域尚不清楚。本文测定了BcGs1不同诱导时间对提高番茄抗灰葡萄孢菌的效果、体外糖苷酶活性,并比较了BcGs1不同结构域截短蛋白与全长蛋白引起细胞坏死活性的差异。结果表明,BcGs1蛋白诱导番茄72 h可将灰葡萄孢菌引起的病斑面积减少23.25%;BcGs1能水解淀粉和海带多糖,但不能水解羟甲基纤维素和微晶纤维素;BcGs1全长、GH15和CBM20截短蛋白均能在烟草细胞中正常瞬时表达,但表达GH15的烟草叶片枯斑面积明显小于表达全长蛋白BcGs1的枯斑面积,表达CBM20截短蛋白的叶片没有产生枯斑反应;为了进一步明确截短蛋白GH15和全长蛋白BcGs1激发烟草细胞坏死活性的差异,用大肠杆菌表达并获得了纯化的重组蛋白GH15,叶片浸润法测定结果表明,截断蛋白GH15的细胞坏死活性仍然低于BcGs1全长蛋白的坏死活性,说明BcGs1诱导烟草细胞坏死活性需要GH15和CBM20结构域的共同参与。本文研究结果为进一步探讨BcGs1诱导植物抗病机制奠定了基础。     

土槿皮乙酸对胶孢炭疽菌分生孢子萌发过程中核分裂的影响

为探究天然抑菌成分土槿皮乙酸对胶孢炭疽菌有丝分裂的影响,以多菌灵为药剂对照,以其亚致死剂量(EC30)处理了胶孢炭疽菌分生孢子,通过DAPI荧光染料染色观察了孢子萌发过程中的核相变化。结果表明,胶孢炭疽菌分生孢子在正常萌发过程的0~4 h,发生2次核分裂,之后菌体核分裂为1次/h,至12 h时共发生了10次核分裂;10 mg/L多菌灵处理胶孢炭疽菌12 h,菌体共发生了4次或5次核分裂,自第2次核分裂起,每次细胞核分裂的时间较未经药剂处理延迟5 h左右;5 mg/L土槿皮乙酸处理条件下,菌体12 h内共发生了7次核分裂,且自第3次核分裂后,每次核相发生变化的时间较未经药剂处理延迟3 h左右。可见,土槿皮乙酸能够抑制胶孢炭疽菌分生孢子萌发过程中细胞核的分裂,这可能与其抑制孢子萌发、芽管伸长及导致菌丝异常生长的作用有关。     

灰葡萄孢拮抗细菌的筛选

采集扬州、淮阴两地１６种常见植物根部土壤、根和叶片样本１８２份,分离纯化后得到细菌６３２株,抑菌圈法测定对灰葡萄孢有拮抗性的５８株,拮抗性稳定的１３株。其中拮抗性最强的Ｙ２－１１－１菌株为芽孢杆菌,抑菌圈直径达２９．７ｍｍ。接种试验表明,Ｙ２－１１－１以番茄叶片和果实灰霉病的防效分别达６８．７％和７５．０％。部分菌株对其他重要植物病原真菌也有一定的拮抗作用。     

异辛醇对灰葡萄孢的抑菌作用及转录组分析

为探究异辛醇对灰葡萄孢Botrytis cinerea的抑制机理,采用双皿对扣法测定了异辛醇对灰葡萄孢的抑菌效果,利用扫描电镜技术观察了异辛醇处理后灰葡萄孢菌丝的形态变化,测定异辛醇对灰葡萄孢细胞膜胞外电导率和麦角甾醇合成的影响,并基于转录组测序技术（RNA sequencing,RNA-Seq）分析了异辛醇处理对灰葡萄孢的影响。结果表明：异辛醇对灰葡萄孢菌丝的抑菌率为67.92%。经异辛醇处理后,灰葡萄孢菌丝出现大量畸形、不规则变形扭曲,细胞膜通透性增加。异辛醇处理4、5和6 d后,细胞膜麦角甾醇的含量分别降低44.35%、38.82%和42.43%;蛋白质浓度分别降低65.70%、77.93%和58.57%。转录组测序共得到577个差异表达基因（DEGs）,其中312个基因表达量上调,265个基因表达量下调。通过同源蛋白簇（COG）、基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）功能分析,发现参与膜整体组分、麦角甾醇生物合成途径、氨基酸代谢和核糖体生物发生通路中的DEGs均显著下调,表明异辛醇可能通过影响灰葡萄孢的麦角甾醇含量、能量的产生和核糖体结构,从而起到对灰葡萄孢的...     

辽细辛提取物对灰葡萄孢菌的抑制效果

采用生长速率法和孢子萌发法测定了辽细辛根的不同溶剂(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇)粗提取物和精油对引起黄瓜灰霉病的灰葡萄孢菌菌丝生长和孢子萌发的作用。结果表明,细辛不同溶剂提取物和精油对灰葡萄孢菌的菌丝生长和孢子萌发均有一定的抑制作用,且对孢子萌发的抑制效果好于对其菌丝生长的抑制效果;石油醚提取物和精油的抑菌效果较好,对菌丝生长的EC₅₀分别为177.44 mg/L和159.98 mg/L,对孢子萌发的EC₅₀分别为173.23 mg/L和125.29 mg/L;试验还显示细辛所含的主要抑菌活性成分易被极性小的有机溶剂所提取。     

基于RNA高通量测序分析灰葡萄孢侵染垫形成相关基因

 灰葡萄孢产生功能上类似附着胞的侵染垫来侵染寄主植物,但目前对于侵染垫形成的分子机制尚不明确。本文利用高通量测序技术对菌株CanBC-1(弱毒,不形成侵染垫)和CanBC-1c-66(强毒,正常形成侵染垫)进行了转录水平比较。结果表明:在菌株CanBC-1中共检测到2 333个差异表达基因(与菌株CanBC-1c-66相比较),其中1 425个基因表达上调,908个基因表达下调。对差异表达基因进行功能注释(GO)分析发现,在细胞组分(Cellular component)中细胞(Cell)和细胞部分(Cell part)这2个亚类所占比例较大, 在分子功能(Molecular function)中结合活性(Binding)和催化活性(Catalytic)这2个亚类所占比例较大。这些结果暗示差异基因主要参与细胞、代谢和发育等生物学过程。筛选得到12个与真菌致病相关的基因,其中BC1G_03994和BC1G_01012与稻瘟病菌侵染相关的classⅡ疏水蛋白基因Mhp1同源。RT-PCR检测发现这2个基因在弱毒菌株CanBC-1中表达下调,同时该菌株疏水性降低,推测它们可能参与灰葡萄孢侵染垫形成。这些差异基因的获得为揭示灰葡萄孢侵染形成的分子机制奠定了基础。     

丁香酚对灰葡萄孢的抑制作用研究

丁香酚是从植物中提取的天然化合物。采用菌丝生长速率法测定了其对多种植物病原真菌的抑制作用以及田间分离得到的7株灰葡萄孢Botrytis cinerea对丁香酚的敏感性,同时测定了丁香酚对B.cinerea 03 孢子和菌核的抑制活性。结果显示,丁香酚对多种植物病原真菌均有不同程度的抑制作用;灰葡萄孢不同菌株对丁香酚的敏感性不同,EC50值在29.97 ~83.62 μg/mL之间;丁香酚可抑制灰葡萄孢产孢,但对孢子萌发无影响,可抑制其菌核的产生和萌发。荧光染色结果表明丁香酚能破坏灰葡萄孢菌丝细胞膜。利用原子吸收光谱法和紫外分光光度法分别测定丁香酚处理前后菌丝培养液中K+浓度和OD260值变化,结果显示处理后K+浓度和OD260值均升高。综上所述,细胞膜可能是丁香酚对灰葡萄孢菌丝的作用位点。     

环境条件对灰葡萄孢菌菌核萌发的影响

<正>灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病可导致植物幼苗猝倒或花朵和果实腐烂,多在冬春季节发生,是保护地蔬菜、水果和花卉生产或储藏过程中一类重要的病原菌。灰霉菌的初侵染主要由菌核或病残体在适宜温湿度时萌发产生的菌丝或孢子侵染植物,关于灰葡萄孢菌的菌丝、分生孢     

番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性

2001年从辽宁省不同地区的保护地中采集番茄灰霉病果或病叶，经单孢分离共获得番茄灰霉病菌70株。采用菌丝生长速率法测定了其对嘧霉胺的敏感性。结果表明，番茄灰霉病菌已对嘧霉胺产生中等水平抗药性，抗性频率为20．0％。经室内药剂诱导获得了高抗菌株，抗性倍数最高达35．7倍。嘧霉胺与多菌灵及嘧霉胺与速克灵间不存在交互抗药性。野生抗性菌株具有较好的遗传稳定性，连续转接9次后抗药性无明显下降。不同菌株的菌丝生长速度、鲜重和渗透敏感性存在显著差异，但该差异与灰霉病菌对嘧霉胺的敏感性无相关性。抗性菌株与敏感菌株具有同样的致病能力。     

Cloning and Selective Toxicant-induced Expression of BMR1 and BMR3, Novel ABC Transporter Genes in Botrytis cinerea

Two genes, BMR1 and BMR3, encoding new members of the ABC superfamily in Botrytis cinerea, were cloned and characterized. The topologies of the encoded proteins, BMR1 and BMR3, were both (NBF-TMD₆)₂, similar to most of the toxicant-efflux ABC transporters. These genes had different induced expression patterns after treatment with various toxicants, suggesting they may have different roles in toxicant-resistance. Received 24 September 2002/ Accepted in revised form 2 December 2002     

解淀粉芽孢杆菌LJ02对黄瓜抗灰霉病菌的生防效果及其诱导抗性机理的初步研究

 为了解生防解淀粉芽孢杆菌LJ02诱导黄瓜抗灰霉病菌的防治效果和作用机制,分别测量了LJ02的发酵上清液和菌体悬浮液的诱导持效期、最适使用浓度以及最佳施用方法,并采用荧光定量PCR的方法法测定了LJ02诱导处理后黄瓜根部和叶部组织中分别表达PR1a蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、过氧化物酶的抗性基因PR-1、PR-2、PR-3、PR-9的相对表达量。结果表明,LJ02诱导黄瓜抗灰霉病菌的持效期在7 d左右,且原液与100倍稀释液效果最好,灌根施用效果最佳。LJ02发酵上清液可诱导PR-1、PR-3、PR-9的表达,LJ02菌体悬浮液可诱导PR-1、PR-2、PR-3的表达。     

樱桃灰霉病菌LFD-RPA快速检测方法的建立

 灰霉病是樱桃的主要病害,由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染所致。该病菌可为害樱桃的花、叶、果实等多个部位,尤其在樱桃生长中后期及贮藏期发病率极高,危害严重。依据樱桃灰霉病菌内转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立了樱桃灰霉病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。结果表明,该方法检测条件为37℃扩增30 min,能特异性地检测灰葡萄孢,灵敏度为100 fg·μL^-1,略低于常规PCR(10 fg·μL^-1)和荧光定量PCR(7.43 fg·μL^-1);检测方法用时短,PRA扩增仅需30 min,LFD检测仅需10 min。本研究建立的快速检测方法可用于樱桃灰霉病菌的实时监测及病害的田间快速诊断。     

解淀粉芽孢杆菌LJ02对黄瓜抗灰霉病菌的生防效果及其诱导抗性机理的初步研究

 为了解生防解淀粉芽孢杆菌LJ02诱导黄瓜抗灰霉病菌的防治效果和作用机制,分别测量了LJ02的发酵上清液和菌体悬浮液的诱导持效期、最适使用浓度以及最佳施用方法,并采用荧光定量PCR的方法法测定了LJ02诱导处理后黄瓜根部和叶部组织中分别表达PR1a蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、过氧化物酶的抗性基因PR-1、PR-2、PR-3、PR-9的相对表达量。结果表明,LJ02诱导黄瓜抗灰霉病菌的持效期在7 d左右,且原液与100倍稀释液效果最好,灌根施用效果最佳。LJ02发酵上清液可诱导PR-1、PR-3、PR-9的表达,LJ02菌体悬浮液可诱导PR-1、PR-2、PR-3的表达。     

空气湿度对灰霉菌侵染番茄叶片组织结构分析及抗氧化系统的影响

空气湿度对番茄灰霉病的发生有显著性影响。为了探明空气湿度对灰霉菌侵染番茄叶片的过程与机理,本研究以‘金棚14-6’番茄为材料,观察分析了高空气相对湿度(80%～95%)和低空气相对湿度(65%～80%)对灰霉菌侵染番茄叶片表型变化、细胞学差异、形态结构变化、活性氧含量和抗氧化酶的影响。结果表明：高湿接种60 h大量芽管伸长出现在叶片下表皮细胞并分化菌丝,叶肉细胞间隙分布了大量的菌丝并伴随病斑出现,灰霉菌在60 h完成侵染;低湿接种108 h芽管伸长出现在叶片下表皮并分化菌丝,叶肉细胞间隙有少量菌丝分布,没有明显病斑出现。随着灰霉菌的侵染,低湿与高湿相比栅栏组织和海绵组织结构从整齐紧密变为排列疏松的时间滞后;高湿和低湿处理的叶片厚度、栅栏组织和海绵组织厚度均呈先上升后下降的变化趋势,侵染后期低湿处理的叶片组织结构厚度显著高于高湿。随着接菌时间延长,高湿和低湿的活性氧含量和抗氧化酶活性处于相对活跃的调整、适应的变化过程,大致呈先上升后下降趋势,而对照和接菌相比无显著差异,变化趋势维持在基本的振幅上。研究显示灰霉菌发生的环境条件：湿度80%～95%和侵染完成时间60 h,即控制高空气湿度的持...