烟草PR10蛋白生物活性及赤星病菌Alternaria alternata诱导下的表达分析

为深入研究植物PR10蛋白的生物学功能,以烟草PR10蛋白(NtPR10)为研究对象,采用冷休克蛋白表达载体p Cold II,构建烟草PR10融合蛋白原核表达系统,优化表达及纯化条件,获得高纯度NtPR10融合蛋白;分别采用底物法和滤纸片法体外分析其核酸酶活性及抑菌活性;并利用荧光定量PCR方法分析了烟草赤星病菌Alternaria alternata侵染下,NtPR10基因在抗、感烟草品种内不同时间点的表达差异。结果表明,15℃、0.1 mmol/L IPTG过夜条件下可诱导获得大量可溶性目的蛋白,50、100 mmol/L咪唑缓冲液洗脱能够获得较高纯度的目的蛋白;纯化后的NtPR10蛋白能够降解烟草总RNA,具有核酸酶活性,且1.0、0.5、0.25μg/μL的NtPR10蛋白溶液均对烟草赤星病菌的菌丝生长具有显著的抑制作用,但随着蛋白浓度的降低,抑菌作用减弱;荧光定量PCR结果显示,接种烟草赤星病菌后,NtPR10基因在感病品种和抗病品种中均显著上调表达,但其在抗病品种的响应速度和表达量显著高于感病品种,表明NtPR10应答了烟草赤星病菌的侵染过程。     

小RNA介导蜡质芽胞杆菌AR156激活MAPK通路诱导拟南芥系统抗病性研究

 蜡质芽胞杆菌AR156是一种根围促生细菌,可以诱导拟南芥产生对丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000,Pst DC3000)的系统抗性(Induced Systemic Resistance,ISR)。本研究发现,AR156预处理植物后接种病原菌Pst DC3000后的0 min~60 min内,能够迅速激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)MPK3和MPK6的表达。同时,AR156可诱导mpk3和mpk6单突变体对Pst DC3000的抗性,而在mpk3mpk6双突变体中则丧失诱导抗病的能力,表明MPK3和MPK6在AR156介导的诱导抗病中具有重要调控功能,且存在功能冗余。进一步研究发现,和对照相比,在接种72 h后,AR156可以诱导野生型拟南芥PR1蛋白的表达,但双突变体中并没有诱导作用。接种48 h后,过氧化氢的积累和胼胝质沉积也表现出相似结果。此外,通过对野生型和mpk3mpk6双突变体进行小RNA高通量测序发现,MAPK能够影响miRNA的表达,并通过qRT-PCR证实了部分小RNA的差异表达水平,表明MPK3/6可以调控植物miRNA的积累。研究表明MAPK在AR156激发ISR中发挥重要作用,并参与调控植物miRNA的表达水平。     

HarpinXooc蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性检测

采用PCR方法从水稻细菌性条斑病菌RS105菌株中扩增harpinXooc编码基因hrf2,将其克隆到酵母表达载体pPICZαA的分泌信号肽基因下游,获得重组表达质粒pPICZαA-hrf2。重组表达质粒线性化后电击转化至毕赤酵母宿主菌X-33,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后,得到重组酵母菌X-33/pPICZαA-hrf2。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵上清液经浓缩后进行SDS-PAGE电泳分析,在约18kD处有特异目标条带出现。Western blot检测表明表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明酵母重组表达蛋白harpinXooc能够诱导烟草产生过敏反应和促进烟草生长,活性高于在大肠杆菌中表达的harpinXooc。     

烟草叶片接种野火病菌后蛋白质表达差异

为了解烟草受野火病菌侵染后蛋白质表达变化情况,探讨烟草品种的抗病机制,本研究对烟草抗病品种‘K346’叶片进行人工接种,在接种后0～72h内分9次在接种点周围取无病原菌叶片组织提取叶片总蛋白,利用双向电泳技术分析接种处理叶片与未处理叶片的蛋白质表达差异,并选取6个减量表达蛋白点和4个增量表达蛋白点进行MALDI-TOF-MS质谱分析及数据库搜索鉴定,结果表明,6个减量表达蛋白包括参与植物呼吸代谢途径的ATP合成酶CF1α亚基、ATP合成酶CF1α链以及参与植物能量代谢循环途径的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶相关蛋白;4个增量表达蛋白包括参与植物氨基酸代谢途径的谷氨酰胺合成酶、参与糖类和碳循环相关途径的高等植物光系统II氧复合物中Psbp A链蛋白、叶绿体景天庚酮糖-1,7-二磷酸酯酶和光捕获叶绿素a/b结合蛋白。经过蛋白质功能分析,推测烟草是通过加速植株生长、促进抗病相关糖和蛋白的表达、增强氨基酸代谢以及植株自身蛋白的修复等方式来提高抗病性。     

水稻条斑病菌hrpD5基因在致病性中的功能分析

水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)成功侵染水稻主要依靠其III型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)分泌的效应蛋白。T3SS由hrp-hrc-hpa基因编码,其中主要的hrp和hrc基因突变,病原菌将丧失在寄主水稻上的致病性和非寄主烟草上的过敏性反应(hypersensitive response,HR)。hrpD5基因位于hrp基因簇hrpD操纵单元的第5个基因,在致病性中的功能未知。本研究构建了Xoc的hrpD5缺失突变体RΔhrpD5。植物接种试验显示,RΔhrpD5丧失了对寄主水稻的致病性和在非寄主烟草上激发HR反应的能力;功能互补子虽然能够恢复这2种表型,但是,与野生型菌株相比,其在感病水稻上的毒性显著降低,在非寄主烟草上形成延迟的HR反应;荧光定量PCR结果显示:hrpD5缺失影响其下游hrpD操纵单元基因hrpD6、hrpE和hpaB以及HrpX操纵单元基因hrpF和hrpB1的表达;同时,hrpD5缺失降低了hrpX的mRNA水平,但是不影响hrpX的启动子活性;酵母双杂交结果显示,HrpD5蛋白能够与HrpF蛋白的N端互作。这些结果暗示在Xoc中hrpD5不仅为主要的致病相关基因,而且调控主要的hrp调节基因hrpX的表达。HrpD5新功能的鉴定将为解析T3SS在致病性中的功能提供线索。     

杧果与Fusarium mangiferae在转录水平上的互作机制

基于Illumina HiSeq~(TM)2000平台,对健康与感病杧果顶芽的转录组进行测序,采用BLAST软件将获得的Unigene与NCBI-nr、Swiss-Prot、KEGG和COG数据库进行比对,根据基因功能注释后分析杧果病健组织的差异表达基因(DEGs),并对DEGs进行GO和Pathway富集分析。结果表明:2个样品共获得119 815条Unigene,N50为1 546 bp,平均片段长度为880 bp;鉴定了29 878个DEGs,对随机挑选的11个差异表达基因进行了qRT-PCR验证,结果与转录组一致。以corrected P-value≤0.05为阈值的代谢途径有22条,其中大多数代谢途径与植物的抗逆响应密切相关;153个DEGs参与了淀粉和蔗糖代谢途径,DEGs主要是编码糖类异构酶、水解酶和转移酶等,参与葡萄糖水解、细胞碳水化合物、丙酮酸盐和核苷酸代谢等生物进程;在抗氧化生物过程中,编码活性氧代谢相关酶且log_2Ratio10或-10以上的DEGs有20个,14个属上调表达,表明活性氧代谢在杧果与病原互作过程中起到重要的调解作用;F.mangiferae侵染杧果后,以log_2Ratio10或-10为筛选条件,共获得酚类代谢相关差异表达基因53个,其中40个DEGs上调表达,推测杧果可能是通过合成加固细胞壁的木质素或生成抑菌作用的酚类化合物来提高对病原菌的抵抗能力;杧果与F.mangiferae互作过程中,钙信号传导、SA信号途径和丝裂原活化蛋白信号传导途径相关基因表达下调,造成了下游植物抗病基因RPM1的表达受到抑制,这可能是杧果畸形病的主要成因之一。     

不同渗透压及pH环境对烟草青枯病菌致病力的影响

为探究不同渗透压和pH环境对烟草青枯病菌Ralstonia solanacearum致病力的影响,用Biolog PM 9～10代谢板中96种渗透压和96种pH环境培养烟草青枯病菌,并采用穿刺法接种于烟草离体叶片,测定不同环境下烟草青枯病菌对烟草的致病情况。结果表明,烟草青枯病菌可致病的渗透压范围包括1%～2%氯化钠、2%～3%硫酸钠、5%～20%乙二醇、1%甲酸钠、2%尿素、1%乳酸钠、20～100 mmol/L磷酸钠、10～100 mmol/L硫酸铵、10～100 mmol/L硝酸钠及10～20 mmol/L亚硝酸钠。可致病pH范围为5.0～8.0;当pH 4.5时,烟草青枯病菌在分别与L-正缬氨酸和5-羟色氨酸共培养时均可致病,与其余33种氨基酸共培养时则均不能致病;当pH 9.5时,烟草青枯病菌在与所有35种供试氨基酸共培养时均不能致病;烟草青枯病菌在葡萄糖苷、辛酸盐、半乳糖苷等10种化合物培养下均可致病。表明渗透压和pH环境会严重影响烟草青枯病菌的生长和致病力。     

烟草立枯病病菌人工诱发病害效果比较初探

采用人工接种方法,将烟草立枯病病菌菌株TRs-5接种于烟草云烟87的不同部位,观察其发病效果。研究了菌株接种体在不同接种温度和培养时间对发病效果的影响,并比较了其与稻纹枯病病菌菌株RRs08-22-2接种于水稻品种中优679的致病效果。结果表明,菌株TRs-5既能侵染烟草幼苗近地表的茎基部,导致其发病,也能侵染烟草成株苗叶面形成坏死病斑。在温度28℃环境下接种比在20℃的导致发病更严重。用培养2 d的菌丝体接种比培养4 d的导致更大的病斑。在寄主烟草上,菌株TRs-5比菌株RRs08-22-2的致病力强,但在寄主水稻上,菌株TRs-5比菌株RRs08-22-2的致病力弱。初步发现这2个病菌与2个寄主之间存在致病专化现象。     

TasA抑菌蛋白对烟草黑胫病的防治效果研究

【目的】烟草黑胫病是烟草疫霉菌侵染形成的一种严重危害烟草根茎的土传性疾病,给全球烟草种植业造成严重的经济损失。研究通过构建TasA蛋白原核表达重组菌,研究TasA对烟草黑胫病的抑制效果;并通过改变TasA蛋白的异源表达水平,以期提高该蛋白对烟草黑胫病的抑制效果。【方法】通过PCR扩增技术获得枯草芽孢杆菌抑菌蛋白TasA基因,构建大肠杆菌重组菌;并以烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）为指示菌,研究TasA蛋白对烟草黑胫病的抑制效果。此外,通过改变克隆载体的拷贝数,研究TasA蛋白的表达量对其抑菌作用的影响。【结果】成功构建了三株大肠杆菌重组菌（pACYC-Tas A、pCDF-TasA及pT7473-TasA菌株）,且TasA蛋白在三株重组菌中都成功进行了异源表达,分子量为35 ku左右。pACYC-TasA菌株、pCDF-TasA菌株及pT7473-TasA菌株对烟草疫霉菌菌丝体均有抑制效果,抑制率分别为14.85%、25.55%及13.45%。【结论】抑菌蛋白TasA对烟草黑胫病具有显著抑制效果,且过表达pCDF-TasA重组质粒的工程菌对烟草黑胫病抑制效果...     

烟草赤星病菌拮抗菌解淀粉芽胞杆菌YW-2-6鉴定及生防效果

为获得有效拮抗烟草赤星病菌的生防资源,采用稀释分离法和平板对峙法从烟草根际土壤中分离筛选烟草赤星病菌拮抗菌株。通过形态学观察、生理生化特征和16S rDNA序列分析进行鉴定,并测定其对烟株的促生作用,验证菌株的产IAA能力,评价生防菌发酵液对烟草赤星病的田间防效。结果表明,从分离的65株细菌菌株中筛选到5株烟草赤星病拮抗细菌,其中菌株YW-2-6对烟草赤星病菌拮抗效果最好,抑制率为71.32%,初步鉴定菌株YW-2-6为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens。菌株YW-2-6对小麦赤霉病菌、辣椒疫霉病菌、烟草靶斑病菌等病原菌具有显著的拮抗作用。YW-2-6发酵液对烟草赤星病防效为56.93%,且菌株YW-2-6对烟株有明显的促生作用。菌株YW-2-6具有良好的生防潜力和开发前景。     

葡萄VvSUC12基因启动子的克隆及上游调控因子鉴定

枝干病害葡萄溃疡病近年来严重限制了葡萄产业发展。研究表明葡萄蔗糖转运蛋白参与寄主植物和病原菌的互作过程。为解析蔗糖转运蛋白VvSUC12在葡萄免疫反应过程中的功能,本研究克隆了VvSUC12基因翻译起始位点上游1 500 bp的启动子区,通过生物信息学分析发现该区域包含4个Dof转录因子结合序列(A/TAAAG)及多种激素调节与防御相关的顺式元件。实时荧光定量分析显示,接种可可毛色二孢菌显著诱导VvSUC12和VvDof19基因的表达。通过酵母单杂交实验筛选得到与VvSUC12启动子互作的转录因子VvDof19。酵母双杂交实验证实VvDof19具有自激活活性;进一步通过烟草瞬时表达发现Dof19-GFP的相对GUS活性约为对照GFP的9倍,表明转录因子VvDof19能够激活VvSUC12基因的表达。研究结果为深入研究蔗糖转运蛋白在葡萄免疫反应中的功能奠定基础。     

油菜花叶病毒15号和菸花叶病毒间干扰作用的研究

 TMV与YMV₁₅在系统感染寄主——菸(Nicotiana tabacum)上的相互干扰作用是很微弱的。同时接种二病毒时,在感染的早期(接种后2-3天) YMV₁₅占优势,在此时间以后TMV的浓度就超过YMV₁₅。二病毒以相同的侵染力同时接种心叶菸(Nicotiana glutinosa)时,则大部分的局部斑点是由YMV₁₅形成的。上述结果表明,YMV₁₅竞争侵染点的能力较TMV为大。试验并证明完整的YMV₁₅及其蛋白都能干扰TMV侵染菜豆(Phaseoluss vulgaris),因而这种干扰似决定于病毒蛋白质部分对于侵染点附着的特异性。     

番茄抗病毒基因Tm-2~2及其等位基因tm-2氨基酸差异分析

番茄抗病蛋白Tm-2~2与其等位感病蛋白tm-2在序列上相对保守但也有一定的差异性,研究这些差异对于了解Tm-2~2抗病蛋白的结构和功能起着重要作用。本研究构建了不同的Tm-2~2/tm-2置换突变体,在本生烟草上利用农杆菌注射法共表达突变体及其效应因子MP或TMV-GFP载体。通过对植物坏死表型以及病毒量变化的观察,发现当Tm-2~2ARC结构域中RNBS-D保守基序中的第413位甘氨酸突变成tm-2中的丝氨酸后,Tm-2~2介导的对烟草花叶病毒属病毒的抗性减弱。这说明RNBS-D保守基序对于Tm-2~2行使其抗病功能是至关重要的。     

小麦凝集素类受体激酶TaLecRLK1的鉴定及抗锈病功能分析

凝集素类受体激酶(lectin receptor-like kinase, LecRLKs)是一类在植物应答多种生物/非生物胁迫中发挥重要作用的类受体激酶。本研究在小麦与条锈菌互作的转录组中筛选到1个在小麦与条锈菌非亲和互作中显著上调表达的LecRLKs基因TaLecRLK1。该基因全长2 292 bp,编码蛋白含有1个胞外信号肽、B-lectin结构域、PAN＿AP结构域、跨膜域和胞内酪氨酸激酶域。qRT-PCR分析表明：TaLecRLK1在小麦与条锈菌非亲和互作早期诱导表达,在烟草及小麦原生质体中瞬时表达,TaLecRLK1-GFP定位在细胞膜上。利用大麦条纹花叶病毒介导的基因沉默技术(BSMV-VIGS)沉默TaLecRLK1,接种无毒性条锈菌小种CYR23后,沉默叶片表面产生少量夏孢子堆,组织学观察发现沉默植株中条锈菌菌丝长度增长、侵染点附近活性氧积累面积减少;TaPR1、TaPR2、TaPR5的表达受到抑制,TaCAT和TaSOD则被迅速诱导表达。综上所述,TaLecRLK1对小麦抗条锈病起到正调控作用。     

KMnO4和H2O2刺激掘氏疫霉卵孢子萌发对单卵孢株生物学性状的影响

 本文对经KMnO₄、H₂O₂刺激掘氏疫霉(Phytophthora drechsleri)卵孢子萌发建立的单卵孢株群体应用于掘氏疫霉遗传研究的可行性做了研究。2个掘氏疫霉菌株(A₁、A₂交配型各1株)经聚碳膜间隔配对产生的卵孢子用KMnO₄、H₂O₂以及不用上述氧化剂处理分别建立K、H、C 3个单卵孢株群体(卵孢子萌发率8-16%)。在群体水平上对来自同一亲本的上述3个群体生物学性状比较结果表明,H₂O₂处理刺激卵孢子萌发不影响生长速度、菌落形态、耐35℃高温生长、致病力及交配型的遗传稳定性,所建立的单卵孢株群体可用于上述性状的遗传研究;KMnO₄处理导致掘氏疫霉A₁和A₂交配型在自交后代各自分离为A₁、A₂、A₁A₂和A₂、A₁A₂,但不影响其他生物学性状的遗传稳定性,所建立的单卵孢株群体可用于除交配型性状以外的其他生物学性状的遗传研究,不宜用于交配型正常遗传规律的研究。用KMnO₄处理掘氏疫霉A₁或A₂交配型菌株单株自交产生的卵孢子,从A₁菌株自交后代获得A₂和A₁A₂以及从A₂菌株自交后代获得A₁A₂交配型单卵孢株的结果说明,掘氏疫霉异宗配合菌株体内可能同时包含控制A₁和A₂交配型的遗传因子,在正常条件下有1种交配型遗传因子不表达。KMnO₄处理可望作为揭示交配型遗传本质的有用试验手段。     

欧美杨细菌性溃疡病菌双组份系统反应调节基因LqRR2的功能研究

由Lonsdalea quercina subsp.populi引起的欧美杨溃疡病于2006年在国内首次发现,不同于其它病原菌造成的杨树溃疡病,该病害对欧美杨速生林的生长造成毁灭性破坏,已造成了严重的经济损失,该病原菌的致病分子机制尚不清楚。双组分系统是细菌重要的信号传递通路,在细菌的生长繁殖、逆境胁迫应答、环境适应以及病原菌致病过程中发挥重要作用。开展双组份系统研究将有助于解析欧美杨细菌性溃疡病菌的致病机制。本研究鉴定了欧美杨细菌性溃疡病菌L.quercina双组份孤儿反应调节基因LqRR2,并对其生物学功能进行了研究。通过同源重组获得了LqRR2基因的缺失突变体△LqRR2。表型测定结果显示,与野生型菌株相比,突变体△LqRR2在半固体培养基上的游动能力显著减弱,对欧美杨‘107杨’枝干的毒性也显著降低。但是,突变体的生长速率、生物膜形成能力以及胞外多糖产量较野生型无显著差别。此外,荧光定量PCR分析结果显示,游动性相关基因flg B、flg C和flg E的表达量在突变体中明显降低。综上所述,双组份调节蛋白编码基因LqRR2是欧美杨细菌性溃疡病菌L.quercina维持病原菌游动性和全毒性所必需的。     

Cutting weeds with a CO2 laser

Stems of Chenopodium album . and Sinapis arvensis . and leaves of Lolium perenne . were cut with a CO₂ laser or with a pair of scissors. Treatments were carried out on greenhouse-grown pot plants at three different growth stages and at two heights. Plant dry matter was measured 2 to 5 weeks after treatment. The relationship between dry weight and laser energy was analysed using a non-linear dose–response regression model. The regression parameters differed significantly between the weed species. At all growth stages and heights S. arvensis was more difficult to cut with a CO₂ laser than C. album . When stems were cut below the meristems, 0.9 and 2.3 J mm⁻¹ of CO₂ laser energy dose was sufficient to reduce by 90% the biomass of C. album and S. arvensis respectively. Regrowth appeared when dicotyledonous plant stems were cut above meristems, indicating that it is important to cut close to the soil surface to obtain a significant effect. When cutting L. perenne plants with 2-true leaves at a height of 2 cm from the soil surface with a laser, the biomass decreased significantly compared with plants cut by scissors, indicating a delay in regrowth. This delay was not observed for the dicotyledonous plants nor for the other growth stages of L. perenne .     

HarpinXoo诱发烟草过敏反应早期H2O2变化及有关基因表达

 Harpin_Xoo是水稻黄单胞细菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)产生的蛋白类激发子,用harpin_Xoo注射烟草最早在处理后20h出现肉眼可见的细胞死亡(macro-HR),分别经埃文斯蓝(Evans blue)和台盼兰(Trypan blue)染色观察,发现诱导后4-8h即开始有少量细胞死亡,表明在macro-HR发生前烟草细胞已陆续发生微细胞死亡(micro-HR);对二氨基联苯胺(diamino benzidine,DAB)染色显示,在烟草细胞死亡早期,伴有H₂O₂的明显积累;定量RT-PCR法对H₂O₂代谢相关基因的表达进行了分析,发现harpin_Xoo诱导后1h编码NADPH氧化酶的基因rboh即开始表达,3~7h表达较强,10h开始减弱,表达趋势与H₂O₂积累趋势一致;编码交替氧化酶的基因aoxl表达较迟,sodA基因则在诱导后表达减弱。这些基因的不同表达模式说明,它们在harpin_Xoo诱导的H₂O₂代谢过程中可能具有不同的作用。     

菰黑粉菌MAPK同源基因UeKss1的克隆及表达

菰黑粉菌作为茭白植株体内的内生真菌,其二型态转换与茭白孕茭密切相关,而MAPK途径在真菌二型态转换中具有重要调控作用。本研究在菰黑粉菌中克隆得到了一个MAPK基因UeKss1,通过与酵母菌中的MAPK途径蛋白进行聚类分析表明其属于Kss1的同源蛋白。进一步的系统进化分析表明,UeKss1与黑粉菌属真菌的Kss1同源性最高,达80%以上,且它的丝/苏氨酸双特异性蛋白激酶催化结构域高度保守。不同碳源诱导下菰黑粉菌的生长特征及UeKss1表达分析发现,只有蔗糖培养基能诱导菰黑粉菌菌丝形成,而在PDA、葡萄糖和麦芽糖培养基中,该菌都保持酵母型生长;UeKss1基因的表达量在PDA和葡萄糖培养基中变化不显著,但在麦芽糖培养基中,该基因的表达随着培养时间的延长持续上调表达,而在蔗糖培养基中,UeKss1的表达量虽然也呈现上升趋势,但是远小于麦芽糖的诱导表达量。对UeKss1进行的原核表达纯化,经Western blot验证得到纯度较高的UeKss1蛋白。研究结果可为UeKss1基因的功能研究,阐明其在菰黑粉菌二型态转换中的作用机制提供帮助。