多菌灵、三环唑对大丽轮枝菌微菌核、黑色素形成及致病力的影响

 在离体和活体条件下测定了多菌灵、三环唑对大丽轮枝菌的微菌核黑色素形成的影响,以及经2种杀菌剂处理产生的形态变异菌株对棉苗的致病力。结果表明:多菌灵在培养基内含量超过0.1μg/ml时,即可抑制大丽轮枝菌微菌核的形成,随着培养基内多菌灵浓度的增加,微菌核形成时间逐渐延长,形成量逐渐减少;三环唑浓度为0.5μg/ml时,可抑制微菌核的黑色素形成,微菌核从黑色变为浅红至红褐色。三环唑对微菌核黑色素形成呈可逆抑制,变色的微菌核菌落移入不含药的培养基后,大多可恢复形成黑色素。培养基内三环唑浓度的提高,也可抑制大丽轮枝菌微菌核的形成;因2种杀菌剂的抑制而丧失形成微菌核的白色菌丝体移入不含药的培养基,微菌核形成能力也不能恢复。多菌灵和三环唑经棉株吸收后均能抑制植株内大丽轮枝菌微菌核的形成,但对微菌核色素的形成未见有明显影响。2种杀菌剂处理产生的形态变异菌株的致病力与野生型菌株致病力差异不显著。     

白头翁叶斑病菌黑色素的理化性质及其生物合成途径初步研究

对白头翁叶斑病菌胞壁结合黑色素和胞外黑色素进行了理化性质和红外光谱扫描测定, 结果表明两者具有相似的理化性质, 均易溶于KOH、H2O2和NaClO, 不溶于水、乙醇和丙酮。红外光谱分析表明, 白头翁叶斑病菌YS-24菌株的胞壁结合黑色素与胞外黑色素为同一种类型的黑色素。DHN黑色素的特异性抑制剂—三环唑, 对白头翁叶斑病菌黑色素的产生有明显的抑制作用; 以白头翁叶斑病菌基因组DNA为模板, 通过PCR扩增, 得到了聚酮体合成酶基因的同源片段 AaPKS , 初步推断白头翁叶斑病菌黑色素合成属于DHN途径。     

桑椹菌核病菌实时荧光定量PCR检测体系的建立和应用

为及时高效地鉴别桑椹菌核病的病原菌桑实杯盘菌Ciboria shiraiana和肉阜状杯盘菌C. carunculoides,根据RPB2基因序列设计引物并验证其特异性,建立这2种病原菌的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,q PCR)检测体系,运用该体系对抗、感果桑品种不同时间点芽(果)内的2种病原菌进行检测。结果表明,设计的2对引物特异性强,qPCR检测灵敏度均为10^-4ng/μL,均为常规PCR灵敏度的10~5倍,建立的桑实杯盘菌和肉阜状杯盘菌qPCR标准曲线的扩增效率分别为104.89%和95.30%。利用所建方法成功从采集的果桑样品中检测出病原菌主要为肉阜状杯盘菌,且感病品种中肉阜状杯盘菌的含量随着时间不断增加,在将要显症时激增。表明所建qPCR体系适用于桑椹菌核病早期无症状芽(果)的检测,可通过监测其病原菌类型和含量为该病害的预测预报及早期防治提供依据。     

玉米大斑病菌黑色素合成酶基因4HNR的克隆及其启动子预测

 4HNR (1,3,6,8-tetra-HN reductase) gene of melanin biosynthesis in Setosphaeria turcica had been cloned successfully by RT-PCR in this study. Both sequences of DNA and cDNA of 4HNR were 807 bp and there was no intron in the sequences. This gene only had single copy in genome through Southern blotting analysis. A 2 285 bp for the flanking sequence of 5' had been obtained and it had promoter structure through the software analysis.     

FoAP1基因在香蕉枯萎病菌致病过程中的功能分析

 为了探究AP1转录因子在尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Foc4)中是否参与香蕉枯萎病的致病过程,借助尖孢镰刀菌Fo5176菌株(GenBank序列号:AFQF01001482.1)全基因组序列,通过PCR和RT-PCR技术克隆获得了Foc4中AP1转录因子的基因组DNA和cDNA编码序列.利用PEG介导的原生质体转化法获得AP1基因敲除转化子。利用qRT-PCR分析AP1可能调控的下游基因表达。利用灌根法(直接在根部浇菌)检测了AP1缺失突变体的致病能力。结果表明Foc4的AP1转录因子cDNA编码序列长1770bp,编码63.9kDa(589aa)蛋白,是一个典型的bZIP型转录因子,命名为FoAP1;FoAP1缺失突变体的气生菌丝大量减少,菌丝的入侵生长受到严重限制。对外源氧化胁迫不敏感,但致病能力减弱。     

晚疫病抗性相关基因NbMybl的克隆与功能分析

Myb转录因子广泛参与调控植物生长发育以及应对环境胁迫,但有关其对晚疫病抗性调控机制的研究较少。本研究从本氏烟草中克隆获得一个含Myb-like结构域的蛋白编码基因,命名为NbMybl。该基因开放阅读框全长为753 bp,编码250 aa。实时荧光定量PCR(qPCR)结果显示NbMybl受致病疫霉(Phytophthora infestans)侵染诱导表达。亚细胞定位表明NbMybl定位在植物细胞核和细胞质中。利用病毒诱导的基因沉默技术,发现沉默NbMybl能够明显降低本氏烟草对致病疫霉的抗性。分析比较NbMybl沉默和非沉默对照烟草株系应对P.infestans侵染的转录组数据,发现差异表达基因(Differentially expressed genes, DEGs)8486个,其中上调基因4202个,下调基因4284个。使用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库进行基因富集分析,发现鉴定得到的DEGs中共有373个参与植物-病原菌互作,308个参与植物激素信号转导,216个参与植物MAPK信号途径。推测这些DEGs可能与...     

苹果炭疽叶枯病菌CgCMK1基因的克隆与功能分析

 苹果炭疽叶枯病是由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的苹果重要叶部病害,严重威胁苹果树的生长。CMK1-MAPK途径在植物病原真菌致病过程中具有重要的作用。本研究从苹果炭疽叶枯病菌中克隆了黄瓜炭疽病菌(C. lagenarium)CMK1的同源基因CgCMK1。CgCMK1基因ORF全长1 068 bp,编码355个氨基酸。CgCMK1敲除后不影响苹果炭疽叶枯病菌营养生长、色素沉积以及脂滴的转运。ΔCgCMK1突变体产孢能力显著下降、分生孢子萌发但不产生附着胞,外源添加cAMP不能诱导ΔCgCMK1突变体形成附着胞,在ΔCgCMK1突变体中,过表达cAMP信号途径依赖的蛋白激酶催化亚基基因CgCPK1也不能恢复突变体形成附着胞。CgCMK1基因参与氧化胁迫的应答反应,但不参与离子胁迫的应答反应。ΔCgCMK1突变体对苹果叶片完全丧失致病性,即使有伤接种也不能产生病斑。CgCMK1在苹果炭疽叶枯病菌分生孢子和附着胞中均有表达,定位于细胞质。上述结果表明,CgCMK1参与调控苹果炭疽叶枯病菌的分生孢子产量、附着胞的形成、氧化胁迫应答及致病性。     

苹果炭疽叶枯病菌CgCMK1基因的克隆与功能分析

苹果炭疽叶枯病是由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的苹果重要叶部病害,严重威胁苹果树的生长。CMK1-MAPK途径在植物病原真菌致病过程中具有重要的作用。本研究从苹果炭疽叶枯病菌中克隆了黄瓜炭疽病菌(C.lagenarium)CMK1的同源基因CgCMK1。CgCMK1基因ORF全长1 068 bp,编码355个氨基酸。CgCMK1敲除后不影响苹果炭疽叶枯病菌营养生长、色素沉积以及脂滴的转运。ΔCgCMK1突变体产孢能力显著下降、分生孢子萌发但不产生附着胞,外源添加cAMP不能诱导ΔCgCMK1突变体形成附着胞,在ΔCgCMK1突变体中,过表达cAMP信号途径依赖的蛋白激酶催化亚基基因CgCPK1也不能恢复突变体形成附着胞。CgCMK1基因参与氧化胁迫的应答反应,但不参与离子胁迫的应答反应。ΔCgCMK1突变体对苹果叶片完全丧失致病性,即使有伤接种也不能产生病斑。CgCMK1在苹果炭疽叶枯病菌分生孢子和附着胞中均有表达,定位于细胞质。上述结果表明,CgCMK1参与调控苹果炭疽叶枯病菌的分生孢子产量、附着胞的形成、氧化胁迫应答及致病性。     

链孢粘帚霉寄生核盘菌菌核相关基因的EST生物信息学分析

链孢粘帚霉Gliocladium catenulatum是一种重要的菌寄生真菌,为了明确该菌与寄主核盘菌Sclerotinia sclerotiorum互作中参与菌寄生过程的功能基因,本实验室前期采用抑制消减杂交技术(SSH)构建了消减cDNA文库.本文从该库里随机挑选420个阳性克隆进行测序分析,结果表明克隆片段大小在200～600bp的序列占81.07%.去除载体和小于100bp的序列,获得391条有效序列,其平均长度为409bp.通过序列拼接得到181个单值基因(unigenes),其中包括27个重叠群(contigs)和154个单拷贝的ESTs(singletons).将得到的ESTs与NCBI非冗余蛋白数据库(NR)进行BLASTx分析,结果显示有38个基因的编码蛋白与已知功能的蛋白有较高的相似性,其中包括可能与生物防治功能相关的内切葡聚糖酶、脂滴包被蛋白、MFS转运蛋白、过氧化物酶等;有39条序列在NCBI数据库中未找到相似序列,可能为新基因;其他基因的编码蛋白与数据库中功能未知蛋白相似性高.本研究为明确与重寄生功能相关的基因奠定了基础.     

水稻中与白叶枯病菌hrf1基因同源序列克隆及功能分析

利用PCR技术从粳稻R109中克隆到与hrf1同源的序列,命名为hpfr1,与hrf1基因的同源性为92%。推导的氨基酸同源性为74.8%。hpfr1基因连接到含T7启动子的高表达载体pET30a（＋）上构建重组质粒pHOSJ4,并转化宿主菌BL21（DE3）产生表达菌株BL21（DE3）/pHOSJ4。hpfr1与hrf1基因在起始密码子ATG至225个碱基处完全相同。将ATG至225碱基的序列克隆,并构建表达载体pHOSJ4-225,表达产物注射烟草能引起过敏反应。BL21（DE3）/pHOSJ4和BL21（DE3）/pHOSJ4-225的蛋白抽提物诱导烟草抗烟草花叶病毒病均达极显著水平,浓度为60μl/ml时防效最显著,分别为96.35%、95.4%,与harpinXoo防效（95.9%）相近。     

二穗短柄草细胞分裂素氧化酶BdCKX编码基因的克隆及功能分析

细胞分裂素是一类重要的植物激素,通过控制细胞分裂、诱导促进芽萌发生长等方面控制植物发育。细胞分裂素的代谢主要通过细胞分裂素氧化酶来进行,在作物性状改良和抗旱品种培育方面具有重要的研究价值。为研究麦类作物细胞分裂素氧化酶功能,本实验采用同源克隆的方法,在二穗短柄草中获得了一个与拟南芥细胞分裂素氧化酶基因At CKX3高度同源的候选基因,命名为Bd CKX。将该基因与p CXSN质粒连接构建植物超表达载体,并以农杆菌介导法转化二穗短柄草植物幼胚。所获得的阳性转基因植株生长迟缓,茎短,叶片小,地上部分变小。另外,组织表达谱分析表明Bd CKX在二穗短柄草生长发育的不同时期和不同组织中具有不同的表达模式,在生长40天的植株叶片中表达量有明显升高。由于细胞分裂素氧化酶编码基因在早熟禾亚科物种中较为保守,本研究为理解麦类作物的发育调控机制和遗传改良麦类作物生长提供必要的理论基础。     

草莓多主棒孢霉小柱孢酮脱水酶基因CcSCD1的功能研究

 多主棒孢霉(Corynespora cassiicola)是世界范围内重要的植物病原真菌,其引起的草莓棒孢霉叶斑病对草莓产业的健康发展具有潜在威胁。小柱孢酮脱水酶(scytalone dehydratase,SCD)是真菌多聚二羟萘类(DHN)黑色素生物合成途径中的关键酶,在植物病原菌致病过程中发挥重要作用。本研究通过同源重组的方法获得了草莓多主棒孢霉小柱孢酮脱水酶基因(CcSCD1)的敲除突变体,并进行了回补和RT-PCR验证。与野生型相比,敲除突变体△CcSCD1-2表现为菌落无色素沉积、菌丝稀疏、产孢量显著下降、分生孢子无色较小以及致病力明显减弱。结果表明,CcSCD1参与调控多主棒孢霉的黑色素生物合成、营养生长、分生孢子产量及致病力。     

Investigation and rapid detection of fungal pathogens causing mulberry sclerotial disease in south-west China

Mulberry sclerotial disease is a destructive disease that afflicts mulberry fruits throughout the world. In recent years, the impact of mulberry sclerotial disease has increased with the development of the mulberry fruit industry. Ciboria carunculoides, C. shiraiana, and Scleromitrula shiraiana are all pathogens causing mulberry sclerotial disease, but the dominant pathogen may be different in different mulberry planting areas. In this study, we investigated the causal agents of mulberry sclerotial disease in Chongqing and Sichuan, the main mulberry planting areas in south-west China. The results showed that C. carunculoides was the dominant pathogen in the investigated areas, and the disease incidence rate on some widely cultivated mulberry varieties exceeded 90%. Based on the differences in internal transcriber spacer sequences of different pathogens, we developed a method using cleaved amplified polymorphic sequences (CAPS) from digestion with the three restriction enzymes HindIII, EcoRI, and MluI for rapid detection of pathogens on mulberry fruits. Use of this method confirmed that the diseased fruits of some mulberry varieties were infected by a mixture of C. carunculoides and S. shiraiana. Long-fruit mulberry, which was considered to be resistant to sclerotial disease in the past, was also infected by C. carunculoides. Diseased fruit infected by C. shiraiana or by S. shiraiana alone were not detected. Our results suggest that C. carunculoides is probably the dominant pathogen causing mulberry sclerotial disease in south-west China. The CAPS method for rapid detection of pathogens could assist diagnosis, epidemiology, and disease monitoring.     

二点螟几丁质酶1基因CiChi1的克隆和功能分析

为明确几丁质酶1(chitinase 1,Chi1)编码基因在二点螟Chilo infuscatellus中的潜在功能,对Chi1基因进行全长序列克隆和生物信息学分析,使用实时荧光定量PCR技术检测该基因的时空表达模式,利用RNA干扰技术探究其在二点螟生长发育方面的功能。结果表明,二化螟Chi1基因序列全长为1 788 bp,开放阅读框为1 653 bp,编码550个氨基酸,并命名为CiChi1;CiChi1基因在二点螟不同发育阶段及不同组织中均有表达,其中在成虫期的相对表达量最高,在6龄幼虫期的相对表达量次之,且在6龄幼虫表皮中的相对表达量最高;在RNA干扰试验中,注射ds CiChi1的二点螟3龄幼虫试验组在第14天的最终死亡率为62.0%,显著高于注射ds EGFP的阴性对照组（27.8%）和注射蒸馏水的空白对照组（33.9%）;此时试验组的平均虫重为0.024 g,显著低于阴性对照组（0.039 g）和空白对照组（0.040 g）,且试验组试虫还伴随有外表皮急剧变黑、消解软化的致死表型;实时荧光定量PCR检测结果表明,试验组试虫体内CiChi1基因表达量较阴性对照组和空白对照组...     

东亚飞蝗FK506结合蛋白基因克隆及其免疫功能分析

为明确东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis免疫相关FK506结合蛋白(FK506 binding protein,FKBP)的功能,了解FKBP对金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae侵染东亚飞蝗的影响,分离克隆获得FKBP46基因及其纯化蛋白,采用荧光定量PCR方法测定...     

柑橘黄龙病菌过氧化物还原酶基因CLasPrx的克隆及功能分析

为解析柑橘黄龙病菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）逃逸活性氧伤害的机理,通过克隆其过氧化物还原酶（peroxiredoxin,Prx）编码基因的全长序列,对CLasPrx蛋白序列进行生物信息学分析、多重比对及系统发育分析,采用实时荧光定量PCR方法检测CLasPrx基因在柑橘不同组织中的表达模式,并在本氏烟Nicotiana benthamiana叶肉细胞瞬时表达CLasPrx分析其编码蛋白的亚细胞定位,利用碘化钾法测定 CLasPrx 蛋白清除 H₂O₂的活性。结果显示,克隆得到的CLasPrx基因序列全长为534 bp,编码177个氨基酸;CLasPrx蛋白包含1个Redoxin保守结构域;多重比对分析发现CLasPrx蛋白活性位点含有保守基序PGAFTPTC;系统发育分析表明CLasPrx蛋白与近缘物种的同源蛋白聚为一类;CLasPrx基因在感染黄龙病柑橘树秋梢中的表达水平显著高于在春梢中的表达水平;CLasPrx定位于本氏烟叶肉细胞的细胞质基质中;过表达CLasPrx蛋白能够显著降低本氏烟叶肉细胞内H₂O₂的含量。表明CLasPrx可能参与柑橘黄龙病菌清除H₂O₂的过程。     

玉米大斑病菌黑色素的一些理化性质和光谱吸收特征

 黑色素是某些植物和动物真菌病害的致病相关因子,不同来源的黑色素其生物合成途径可能不同。对玉米大斑病菌细胞壁结合黑色素和从培养滤液中提取的黑色素进行理化性质、紫外吸收光谱和红外光谱扫描测定,并与标准品黑色素进行比较分析,明确了玉米大斑病菌黑色素具有与标准品黑色素相似的理化性质。DHN黑色素的特异性抑制剂——三环唑,对玉米大斑病菌0号和1号小种黑色素的产生均有抑制作用;以玉米大斑病菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增,得到了1,3,8-三羟基萘还原酶基因的同源片段,推测玉米大斑病菌黑色素合成于DHN途径。     

小菜蛾Toll-6基因的克隆及功能分析

为探究Toll-6基因在小菜蛾Plutella xylostella先天免疫中的功能,对克隆鉴定的Toll-6基因序列进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测Toll-6基因的时空表达模式及微生物侵染响应模式,体外验证其在微生物结合、病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern,PAMP）结合和细菌凝集等方面的功能。结果表明：Toll-6基因全长2 313 bp,编码770个氨基酸,预测Toll-6蛋白具有富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeats,LRR）胞外区、跨膜区和Toll/白介素-1受体同源（Toll/interleukin-1 receptor homologous,TIR）胞内等典型Toll受体家族特征;Toll-6基因在不同发育阶段及不同组织中均有表达,其中成虫期表达量最高,4龄幼虫期次之,在4龄幼虫中肠表达量最高;此外,苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis菌株Bt8010侵染小菜蛾4龄幼虫6 h后,Toll-6基因表达被显著抑制,而黏质沙雷氏菌Serratia marcesc...     

特异性抑制剂三环唑对玉米大斑病菌致病力的影响

为明确DHN黑色素合成抑制剂三环唑对玉米大斑病菌Setosphaeria turcica致病力的影响,通过含毒介质系统研究了三环唑作用下玉米大斑病菌的黑色素生物合成量、附着胞的细胞孔径、膨压和病菌的致病力。结果显示,当三环唑浓度≤5μg/mL时,玉米大斑病菌菌落生长量和产孢量变化不显著,但黑色素的生成量降至对照菌株的43%;三环唑处理的病菌附着胞细胞壁孔径增大至2.7～3.3 nm,膨压降至3.75 MPa,侵染率下降37.5%,同时病斑面积显著减小。表明三环唑通过抑制玉米大斑病菌DHN黑色素合成,降低了病菌附着胞的膨压,从而导致致病力下降。