进境澳大利亚绿豆中菜豆细菌性萎蔫病菌的检测

利用NA培养基从澳大利亚进境绿豆样品中分离到一株疑似菜豆细菌性萎蔫病菌（Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens,Cff）的细菌分离物2000-1,对该分离物进行革兰染色试验、PCR检测、多位点序列分析和致病性测试。分离物在NA平板上菌落浅黄色,圆形,隆起,黏性,有光泽且边缘整齐,革兰染色阳性。特异引物CffFOR2/CffREV4可扩增出306 bp的预期产物。分离物2000-1的16S rRNA序列与Cff菌株ATCC 51876完全一致,与GenBank中Cff菌株P990的序列相似性为99.58%,序列差异为3 nt。基于6个看家基因（atpD、dnaK、gyrB、ppK、recA和rpoB）的系统发育树显示,分离物2000-1与Cff相关种处于同一分支,与其中巴西大麦Cff分离物3185 UNESP亲缘关系最近,而与菌株ATCC 51876处于不同分支。分离物人工接种可引起大豆叶片水渍状病斑,大豆叶片出现萎蔫和焦枯,病斑周围伴有金黄色晕圈。根据以上测试结果,将分离物2000-1鉴定为菜豆细菌性萎蔫病菌（Curtobact...     

7种检疫性植物病原黄单胞菌III型分泌系统和效应蛋白编码基因的差异性分析

 γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)的黄单胞菌属(Xanthomonas)的大多数种类可引起植物病害,多数是我国检疫对象。与其他革兰氏阴性植物病原细菌一样,植物病原黄单胞菌可通过高度保守的III型分泌系统(type-III secretion system, T3SS)分泌效应蛋白(T3SS-secreted effectors, T3SEs)进入植物细胞,在非寄主植物和抗病寄主植物上产生过敏反应(hypersensitive response, HR)以及在感病寄主植物上具有致病性。尚不清楚哪些种类的黄单胞菌具有T3SS和缺少哪些T3SE是否可作为检疫的依据。搜集7种检疫性植物病原黄单胞菌,通过PCR和Southern杂交试验结果发现:香蕉细菌性青枯病菌(X. campestris pv. musacearum)的ICMP287和ATCC49084菌株、甘蔗流胶病菌(X. axonopodis pv. vasculorum)ATCC13901菌株、洋葱细菌性叶枯病菌(X. axonopodis pv. allii)的LMG576和LMG578菌株中不含有tale基因,并且ATCC13901菌株既不含有T3SS基因也不含有hpa1和xopQ基因;菜豆细菌性疫病菌(X. campestris pv. phaseoli)ATCC49119菌株不含有hpa1基因。相应地,推测含有2~12个tale基因的黄单胞菌有:大豆斑疹病菌(X. axonopodis pv. glycines)ICMP5732和ATCC43911菌株、豌豆细菌性疫病菌(X. axonopodis pv. vignicola)ATCC11648菌株、棉花细菌性角斑病菌(X. campestris pv. malvacearum)ATCC12131和(X. campestris pv. phaseoli)ATCC49119菌株。大豆细菌性斑疹病菌ATCC43911菌株尽管含有hpa1、xopQ和hrcC基因,但在非寄主烟草上不能激发HR反应;而甘蔗流胶病菌ATCC13901菌株不含有hpa1、xopQ和hrcC基因,却激发烟草产生HR反应。这些结果对于分析比较不同植物病原黄单胞菌的致病性因子和设计特定的植物检疫靶点提供了科学线索。     

进境澳大利亚豌豆细菌性萎蔫病病原菌的分离鉴定

 2008年3月自澳大利亚进口的豌豆种苗病变部位分离到致病性菌株,该菌株能引起豌豆茎部、卷须萎蔫腐烂,叶片褪绿等症状。针刺接种豌豆,发生的病变状态与自然发病的症状相同,且在接种发病植株中又分离到形态上一致的病原菌,得到了柯赫法则的验证。经形态特征、培养性状、生理生化及16S rDNA序列分析,鉴定其为桃色欧文氏菌(Erwinia persicina)。这是我国首次从进境豌豆中检出该病害。     

日本菜豆种子中菜豆晕疫病菌的检疫鉴定

利用MT选择性培养基从来自日本的菜豆种子样品上分离到1株细菌分离物（编号1160）,对该分离物进行培养性状观察、特异引物PCR检测、多位点序列分析、烟草过敏性反应和致病性测试。结果表明：该分离物菌落在MT上呈白色、略扁平、无水解圈,经菜豆晕疫病菌（Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola,Psp）特异引物PHA19/PHA95及P5.1/P3.1扩增,获到437 bp及500 bp目的条带,并与Psp菌株LMG2245及GenBank中Psp（基因登录号：AB237164、CP000058）的序列相似性均为100%。选择gap1、gltA、gyrB、rpoD 4个看家基因进行多位点序列分析（MLSA）,系统发育树显示分离物1160与Psp菌株LMG2245、1448A聚在同一分支。该分离物人工接种菜豆叶片能引起典型的黄色晕疫病害症状,接种菜豆荚果引起水渍及褐变病害症状;接种烟草叶片可产生过敏性反应。根据上述试验结果,将分离物1160鉴定为菜豆晕疫病菌。这也是全国首次从进境商品中截获菜豆晕疫病菌。     

一串红穿孔病病原鉴定和初侵染源分析

 2021年夏季,受台风“烟花”影响,上海市奉贤区海湾镇大面积一串红种苗突发穿孔病,本文按照柯赫氏法则鉴定病原物并进行初侵染源分析。从田间病样中分离出的黄色分离物YchA回接一串红形成穿孔症状,在非寄主本氏烟草上可激发过敏反应。16S rDNA序列分析显示YchA为黄单胞菌属;以持家基因fyuA、gyrB、rpoD进行多位点序列分析(Multi-locus sequence analysis, MLSA)发现,菌株YchA与核桃细菌性黑斑病菌(Xanthomonas arboricola pv. juglandis, Xaj)亲缘关系最近;Biolog鉴定系统分析显示,一串红穿孔病病原为Xaj的可能性约为68%。对育苗基质、种子和灌溉水的检测发现,种子和灌溉水带菌。这些结果表明,一串红细菌性穿孔病的病原为树生黄单胞菌(X. arboricola),可能是一个新致病变种;种子带菌是病害的初侵染来源,灌溉水带菌扩散。     

新疆加工型辣椒细菌性斑点病的发生和病原鉴定

 新疆加工型辣椒主要产区巴音郭楞蒙古自治州发生了一种严重危害辣椒的细菌性病害。从发病辣椒叶片中分离细菌,通过烟草过敏性反应、马铃薯软腐试验和接种辣椒等致病性测定,确定了13个致病菌株,各菌株之间致病力无明显差异。通过菌体形态、培养性状观察、生理生化反应、寄主范围测定,结合16S rDNA和rpoD基因扩增、序列测定和系统发育分析,将病原菌鉴定为丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv. syringae)。病原菌人工接种还能侵染番茄、茄子、马铃薯及黄瓜、四季豆、白菜、萝卜、芹菜等植物。P. syringae pv. syringae引起加工型辣椒细菌性斑点病在国内属首次报道。     

进境油菜籽中十字花科黑斑病菌的检测

 利用MT选择性培养基从加拿大进境油菜籽样品中分离到2株细菌分离物2305-1和5309-1,对分离物进行致病性测定、LOPAT测试、Biolog测试、hrpZ和cfl基因序列分析,以及多位点序列分析。结果表明:2株分离物人工接种油菜、花椰菜和番茄幼苗都能引起典型黑斑症状;LOPAT测试和Biolog测试结果与丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的各项生理指标一致;hrpZ基因序列与十字花科黑斑病菌(P. syringae pv. maculicola)和番茄细菌性叶斑病菌(P. syringae pv.tomato)的序列相似性均为99.18%～100%;cfl基因序列分析表明分离物2305-1和5309-1基因组中存在冠毒素合成基因;选择gyrB、ropD、gltA、 gap1、 acnB和pgi 6个看家基因进行多位点序列分析,系统发育树显示分离物2305-1和5309-1均与P. syringae pv. ma-culicola聚在一起。根据试验结果将分离物2305-1和5309-1鉴定为十字花科黑斑病菌P. syringae pv. maculicola。     

进境柠檬样品上柑桔溃疡病菌的检测

从进境柠檬样品上分离到一株疑似柑桔溃疡病菌的分离物X206,对分离物进行了菌落形态学特征观察、16S r RNA序列测定、PCR检测、Biolog测定及致病性测试。试验结果表明分离物X206在NA培养基上形成黄色,有光泽,圆形,全缘,微隆起,粘稠状的菌落。特异引物Xac01/Xac02扩增分离物X206的DNA得到582bp的预期产物,产物序列与柑桔溃疡病菌序列的相似性为100%。其16S r RNA序列与柑桔溃疡病菌的序列完全一致。Biolog测定将分离物X206和柑桔溃疡病菌阳性菌株FZ01均鉴定为Xanthomonas campestris pv.dieffenbachiae。致病性测试显示分离物X206能导致柑桔叶片产生明显的溃疡病斑。根据试验结果将分离物X206鉴定为柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)。     

进境荷兰风信子种球中马铃薯黑胫病菌的分离鉴定

从进境荷兰风信子种球的软腐组织处分离到1株菌株5318,对菌株进行菌落形态观察、Biolog测定、PCR检测、序列比对、烟草过敏性实验和致病性测定。试验结果表明,菌株5318在NA培养基上菌落淡黄色,煎蛋状。Biolog测定的结果表明,菌株5318为Dikceya sp.。利用马铃薯黑胫病菌(Dickeya solani)特异性引物ds-f/r和探针ds-p对菌株5318的基因组DNA进行扩增,结果为阳性。菌株5318的rec A的序列与Genbank中D.solani的rec A序列(CP015137,KM405241)相似性为100%。基于dna X序列构建的系统进化树显示,菌株5318与D.solani聚在同一分支,亲缘关系最近。接种烟草叶片产生过敏性反应。创伤接种马铃薯幼苗、风信子幼叶,接种组织处出现典型软腐症状。根据以上测试结果,将菌株5318鉴定为马铃薯黑胫病菌(Dickeya solani)。     

进境菜豆种子中普通细菌性疫病菌的分离和鉴定

对经甘肃口岸进境的30批菜豆Phaseolus vulgaris种子进行了普通细菌性疫病菌的检测,利用选择性培养基MT从波兰进境菜豆种子上分离到1株细菌597,对该分离物进行菌落形态特征观察、致病性测定、16S rDNA及16S-23S rDNA ITS序列分析和特异性PCR检测。结果表明,该分离物在MT培养基上菌落呈黄色、圆形、黏稠、表面光滑向外隆起、菌落周围有水解圈。分离物597接种菜豆幼苗后导致叶片枯萎,接种点干枯。结合菌落形态、16S-23S rDNA ITS序列、特异性PCR检测结果,将分离物597鉴定为地毯草黄单胞杆菌菜豆致病变种Xanthomonas axonopodis pv.phaseoli。     

中华常春藤细菌性叶斑病病原菌的鉴定

 2015年春季在昆明市区绿化带种植的中华常春藤上发现一种由细菌侵染而引起的病害,称为中华常春藤细菌性叶斑病。通过发病症状、菌落形态观察、致病性测定、Biolog分析,16S rDNA序列和核糖体DNA内转录间隔区(internal trans-cribed spacer, ITS )序列分析比较,对昆明地区的常春藤叶斑病病原菌及其系统进化关系进行研究。分离病原菌接种中华常春藤叶片完成科赫法则验证,发病初期在叶片表面形成带有黄色叶晕的不规则褐色斑点,后期叶片边缘形成倒V字型坏死并起皱。将菌株CCT1和CCT6测序结果与现有的黄单胞菌菌株的16S rDNA序列和核糖体DNA的ITS序列构建进化树,结果均显示病原菌与野油菜黄单胞菌的序列相似度最大,属于同一支。研究确定该病原菌为野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。这是中国首次报道由X. campestris 引起的中华常春藤叶斑病。     

利用双重PCR-DHPLC技术检测水稻细菌性谷枯病菌的研究

本研究建立了一种应用双重PCR结合变性高效液相色谱技术(polymerase chain reaction-denatured high performanceliquid chromatography,PCR-DHPLC)检测水稻细菌性谷枯病菌的方法。根据水稻细菌性谷枯病菌ITS序列(internal tran-scribed spacer)和gyrB基因序列,设计两对特异性PCR检测引物,对水稻细菌性谷枯病菌株和非水稻细菌性谷枯病菌株分别进行PCR-DHPLC及双重PCR-DHPLC检测,同时进行检测灵敏度及阳性菌株的同源性分析。结果显示,PCR-DHPLC检测的特异性强,灵敏度为菌浓度4×102cfu/mL,7株水稻细菌性谷枯病菌PCR产物同源性一致。该方法能简便、灵敏、高特异性地对水稻细菌性谷枯病菌进行高通量的自动化检测。     

假禾谷镰孢菌细胞自噬相关基因的鉴定与表达分析

细胞自噬是真核生物中一类包含多种进化保守的Atgs蛋白参与的蛋白质降解途径,该途径也参与多种植物病原真菌的产孢、孢子萌发和致病性过程。本研究利用模式物种已知的Atgs,通过生物信息学分析在假禾谷镰孢菌中鉴定到29个Atgs,分属29种不同蛋白类型。细胞自噬核心调控机制相关蛋白Atg1、Atg6、Atg8和Atg9的氨基酸序列系统进化分析结果显示,Atgs在丝状真菌间非常保守,符合物种进化的特点。通过假禾谷镰孢菌跟亲和与非亲和寄主转录组数据分析发现,与菌丝阶段相比26个Fp Atgs在侵染阶段的表达发生改变,其中Fp Atg1、2、3、4、5、7、8、9、13、22、23、28和Fp Vps34在侵染初期和中后期均诱导表达;Fp Atg6、14、17、20、24、29和Fp Vps15在侵染初期和中后期表达量均降低;Fp Atg10、11除在非亲和互作中后期表达量略有上调,其余阶段均显著下调表达;Fp Atg15、16在亲和互作初期诱导表达,其余阶段均下调表达;Fp Atg26、27在亲和互作初期下调表达,中后期诱导表达,而在非亲和互作初期表达量升高,到中后期下调表达。推测细胞自噬参与调控假禾谷镰孢菌的侵染过程。     

大白菜软腐病新病原菌Pectobacterium aroidearum的鉴定及其生物学特性

细菌性软腐病是大白菜生产上主要发生病害之一,其病原菌通常为胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum(Pcc)。从北京房山区大白菜软腐病样中分离获得一株菌株KC20,其在LB固体培养基上的菌落呈圆形、乳白色、半透明、表面光滑且边缘整齐,在半选择性培养基CVP上产生典型的杯状凹陷。致病性测定结果表明,该菌株侵染引发的大白菜软腐症状与田间大白菜软腐自然发病症状相同。利用果胶杆菌属特异引物Y1/Y2可扩增出预期大小为434 bp的目的片段;ITS-PCR和ITS-PCR-RFLP结果发现,KC20与P.carotovorum菌株带型均不相同。KC20的16S rDNA基因完整序列与已报道的标准菌株P.aroidearum SCRI 109T(JN600323)的相应序列相似性高达99%以上;该序列系统发育关系分析表明,KC20与已报道的P.aroidearum菌株聚集,并形成了明显的P.aroidearum类群,基于pmrA基因序列和基于果胶杆菌8个看家基因(acnA、icd、gapA、mdh、mtlD、pgi、proA和rpoS)的MLSA-多位点序列分析进一步支持了这一结果。以上结果表明,引发北京地区大白菜软腐病的病原菌株KC20为果胶杆菌P.aroidearum。人工接种条件下,KC20还可侵染马蹄莲、虎眼万年青、马铃薯、鳄梨、西葫芦、胡萝卜、生菜和芹菜等植物;该菌株具备在37℃以及含有7%NaCl培养基中生长的能力,能液化明胶;可利用棉籽糖、纤维素二糖、蜜二糖,不能利用异麦芽酮糖、D-麦芽糖、D-阿拉伯糖、D-山梨醇、菊糖等。大白菜软腐病新病原菌Pectobacterium aroidearum的发现加深了我们对该病害的了解,为该病害的有效防治提供了参考。     

苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)果胶裂解酶基因Bdpl1的致病功能分析

 由葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)引起的苹果轮纹病是影响我国苹果安全生产的重大病害之一。因此,本研究基于受苹果轮纹菌侵染的苹果组织中果胶裂解酶基因Bdpl1表达上调这一现象,通过Split-marker PCR技术构建Bdpl1基因敲除载体,并通过PEG介导的原生质体转化获得转化子,经常规PCR和qRT-PCR对所获得的转化子进行筛选,成功获得1个Bdpl1基因缺失阳性突变子。该转化子在PDA上的培养基性状与野生型没有明显差异,但在果胶培养基上菌落直径明显小于野生型。其胞外果胶酶活相比野生型明显下降,但在离体“早富”苹果枝条上的致病力并没有明显的下降。通过qRT-PCR技术发现在基因Bdpl1敲除后,其家族内有3个基因在病菌侵染过程中相比野生型明显上调表达(>3倍)。这些现象表明果胶裂解酶基因Bdpl1与病原菌的营养生长过程关系不大,但其参与对寄主果胶类物质的降解。Bdpl1基因对轮纹病菌致病力的影响较小,有可能是Bdpl1基因敲除后,该基因家族内其他基因的上调表达补偿了Bdpl1基因的功能。     

云南省珠芽魔芋(Amorphophallus bulbifer)软腐病病原菌鉴定

 魔芋 (Amorphophallus spp.) 是我国西南地区广泛种植的一种重要经济作物。2016~2018年在云南省发现一种由细菌侵染引起的珠芽魔芋新病害,症状表现为茎秆或叶片出现水渍状病斑,茎秆软化下垂,根部及球茎腐烂变褐,甚至整株倒伏。根据病害发病症状,并通过菌落形状、致病性测定、Biolog和16S rDNA测序分析,结果显示该病原菌在LB培养基上菌落呈近圆形,中央隆起,淡奶油色,质地均匀,表面光滑发亮;扫描和透射电子显微镜下观察显示,菌体形态呈短杆状,周生鞭毛,两端稍钝圆;基于16S rDNA扩增序列系统进化分析与已报道的Pectobacterium aroidearum strain CL1904-3 (MK875007) 相似性达99%以上,构建的系统进化树表明与P. aroidearum菌株亲缘关系最近,Biolog测定和16S rDNA序列分析均将该病原菌鉴定为软腐果胶杆菌 (P. aroidearum)。这是我国首次报道由P. aroidearum引起的珠芽魔芋软腐病害。研究结果进一步加深了人们对该病害的认识,为其防治提供了科学依据。     

一株拮抗水稻白叶枯病菌的淡紫灰链霉菌的筛选鉴定及其生防效果研究

 为发现绿色安全的水稻白叶枯病天然生物防治微生物,本研究从植物根际土壤中分离获得165株放线菌。利用共培养法和牛津杯法,筛选获得了5株拮抗水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)的放线菌,其中拮抗能力最强的是Sl-10菌株,发酵液抑菌圈直径为62.1 mm ± 1.5 mm。根据形态特征、生理生化实验、16S rDNA序列和系统发育分析,鉴定Sl-10菌株为淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)。Sl-10菌株发酵液对大豆斑点病菌(Pseudomonas syringae pv. glycinea)、烟草野火病菌(P. syringae pv. tabaci)、油菜黑腐病菌(X. campestris pv. campestris)、大豆斑疹病菌(X. axonopodis pv. glycines)、水稻条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola)、烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和番茄叶斑病菌(P. syringae pv. tomato)7种植物病原细菌均有拮抗作用。Sl-10菌株发酵液具有较好的耐光、耐酸碱和热稳定性。SDS-PAGE电泳结果显示,Sl-10菌株可抑制Xoo的蛋白质合成。4个品种水稻(甬优15、湘两优900、嘉丰2号和甬优1540)喷施Sl-10菌株发酵液,水稻白叶枯病的病斑抑制率达到82.27%~91.78%。研究结果显示,淡紫灰链霉菌Sl-10菌株具有较好的水稻白叶枯病生物防治潜能。     

草莓丝核菌根腐病的病原菌鉴定

 由丝核菌引起的根腐病是草莓生产上的重要病害之一。本研究基于形态学、菌丝细胞核荧光染色、菌丝融合群测定、rDNA-ITS序列分析和柯赫氏法则验证,对北京地区引起草莓根腐病的丝核菌进行了鉴定。2014年从北京市昌平区温室草莓根腐病病样中分离纯化获得的3个代表菌株,经形态学和细胞核荧光染色,确定均为双核丝核菌(binucleate Rhizoctonia, BNR),且与双核丝核菌AG-A融合群菌株发生菌丝融合,菌株CP-Z的rDNA-ITS序列与GenBank中丝核菌属的有性型角担菌属(Ceratobasidium)AG-A融合群 4个菌株的相似性达100%。菌株CP-Z接种草莓根部,引起根系变黑、腐烂,植株死亡,从接种发病的根部可重新分离到双核丝核菌。双核丝核菌AG-A融合群引起草莓根腐病为国内首次报道。该病原菌菌丝生长适温为25℃~28℃。