胶孢炭疽菌致病相关基因Plv2功能分析

胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的橡胶树炭疽病是橡胶树三大叶部病害之一,严重威胁着橡胶树的生长。本研究从构建的胶孢炭疽菌RC178 T-DNA突变体库中筛选获得一株致病力明显减弱的突变菌株T1103,其T-DNA为单拷贝。采用TAIL-PCR克隆了该突变体T-DNA插入位点的侧翼序列,通过比对胶孢炭疽菌全基因组序列,发现该TDNA插入位点所在的序列包含一个5 400 bp的基因,将其命名为Plv2。Plv2基因包含3个外显子,编码一个假定的甾醇C-24甲基转移酶。敲除野生型菌株RC178中的Plv2,发现敲除突变体与T1103的致病力表现基本一致,由此推测Plv2基因为致病相关基因。     

苹果炭疽叶枯病菌CgCMK1基因的克隆与功能分析

 苹果炭疽叶枯病是由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的苹果重要叶部病害,严重威胁苹果树的生长。CMK1-MAPK途径在植物病原真菌致病过程中具有重要的作用。本研究从苹果炭疽叶枯病菌中克隆了黄瓜炭疽病菌(C. lagenarium)CMK1的同源基因CgCMK1。CgCMK1基因ORF全长1 068 bp,编码355个氨基酸。CgCMK1敲除后不影响苹果炭疽叶枯病菌营养生长、色素沉积以及脂滴的转运。ΔCgCMK1突变体产孢能力显著下降、分生孢子萌发但不产生附着胞,外源添加cAMP不能诱导ΔCgCMK1突变体形成附着胞,在ΔCgCMK1突变体中,过表达cAMP信号途径依赖的蛋白激酶催化亚基基因CgCPK1也不能恢复突变体形成附着胞。CgCMK1基因参与氧化胁迫的应答反应,但不参与离子胁迫的应答反应。ΔCgCMK1突变体对苹果叶片完全丧失致病性,即使有伤接种也不能产生病斑。CgCMK1在苹果炭疽叶枯病菌分生孢子和附着胞中均有表达,定位于细胞质。上述结果表明,CgCMK1参与调控苹果炭疽叶枯病菌的分生孢子产量、附着胞的形成、氧化胁迫应答及致病性。     

苹果炭疽叶枯病菌CgCMK1基因的克隆与功能分析

 苹果炭疽叶枯病是由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的苹果重要叶部病害,严重威胁苹果树的生长。CMK1-MAPK途径在植物病原真菌致病过程中具有重要的作用。本研究从苹果炭疽叶枯病菌中克隆了黄瓜炭疽病菌(C. lagenarium)CMK1的同源基因CgCMK1。CgCMK1基因ORF全长1 068 bp,编码355个氨基酸。CgCMK1敲除后不影响苹果炭疽叶枯病菌营养生长、色素沉积以及脂滴的转运。ΔCgCMK1突变体产孢能力显著下降、分生孢子萌发但不产生附着胞,外源添加cAMP不能诱导ΔCgCMK1突变体形成附着胞,在ΔCgCMK1突变体中,过表达cAMP信号途径依赖的蛋白激酶催化亚基基因CgCPK1也不能恢复突变体形成附着胞。CgCMK1基因参与氧化胁迫的应答反应,但不参与离子胁迫的应答反应。ΔCgCMK1突变体对苹果叶片完全丧失致病性,即使有伤接种也不能产生病斑。CgCMK1在苹果炭疽叶枯病菌分生孢子和附着胞中均有表达,定位于细胞质。上述结果表明,CgCMK1参与调控苹果炭疽叶枯病菌的分生孢子产量、附着胞的形成、氧化胁迫应答及致病性。     

云南葡萄产区葡萄炭疽病病原鉴定及致病力分析

为了明确引起云南葡萄产区炭疽病的病原种类,利用形态鉴定和特异性引物分子检测相结合的方法对从云南省主要葡萄产区采集的60株炭疽病菌菌株进行了鉴定。葡萄炭疽病菌菌株的菌落形态和生长速率与对照菌株尖孢炭疽菌Colletotrichum acutatum差异不明显,但其分生孢子大小显著小于尖孢炭疽菌,附着胞深褐色,球形或不规则形。胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides特异性引物CgInt/ITS4从供试葡萄炭疽病菌菌株基因组DNA中扩增出1条约500 bp的特异性条带,而尖孢炭疽菌特异性引物CaInt2/ITS4对葡萄炭疽病菌无扩增条带。研究表明,引起云南葡萄主产区炭疽病的病原为胶孢炭疽菌;供试胶孢炭疽菌对红提葡萄均有致病力,但菌株致病力差异较大,对番茄和草莓存在交叉侵染的能力,且对多菌灵的敏感性较尖孢炭疽菌高。     

胶孢炭疽菌G蛋白信号调控因子CgRGS3的生物学功能

G蛋白信号调控因子(regulators of G-protein signaling,RGS)是G蛋白的一类负调控因子,在植物病原真菌生长发育及致病过程中起着重要作用。为探究胶孢炭疽病菌1个RGS基因CgRGS3的生物学功能,利用PCR技术扩增CgRGS3基因并进行生物信息学分析,通过同源重组的方法获得该基因的敲除突变体,并在突变体的基础上获得互补株,通过表型分析确定CgRGS3的生物学功能。结果表明:CgRGS3编码1个含有367个氨基酸的蛋白,包含1个RGS功能域和3个跨膜区域,表型分析发现与野生型菌株相比,敲除突变体营养生长缓慢,分生孢子产量附着胞形成率显著降低,对Cu~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)离子更加敏感,细胞壁完整性发生改变,黑色素产量降低及致病力减弱等。由此可见,CgRGS3参与调控胶孢炭疽菌的营养生长,分生孢子产生及附着胞的分化、细胞壁完整性、黑色素产生及致病性等。     

解淀粉芽胞杆菌TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌的抗生作用

为明确解淀粉芽胞杆菌TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌的抗生作用, 采用平板对峙法和菌丝生长速率法以及孢子萌发法测定了解淀粉芽胞杆菌TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌菌落生长和孢子萌发的抑制作用?结果表明:菌株TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌具有显著的抑制作用, 其菌液对病菌的抑制率高达70.4%; 其发酵液对苹果炭疽叶枯病菌的抑制率随着发酵液浓度的增加而升高, 尤其当发酵液浓度为15%时, 其抑菌率为 59.0%; 发酵液处理苹果炭疽叶枯病菌孢子24 h后, 其萌发抑制率与芽管生长抑制率分别为78.2%与64.3%, 且芽管出现畸形; 利用TS-1203发酵液处理苹果离体叶片后接种炭疽叶枯病菌, 其防效为70.1%?综合分析表明, 解淀粉芽胞杆菌TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌具有良好的抑制作用?     

建兰炭疽病拮抗放线菌的筛选及防治效果

为筛选获得对建兰炭疽病菌胶孢炭疽菌具有良好抑菌效果的放线菌,以野生山地兰花表层土壤为分离样本,从土壤样品中分离获得25株放线菌,初筛出6株对建兰炭疽病菌胶孢炭疽菌具有明显抑制作用的菌株,其中菌株SVFJ-07的抑菌效果最好,抑菌率达83.64%。经形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析,确认菌株SVFJ-07为酒红链霉菌。该菌对多种真菌具有良好的抑菌效果。对建兰炭疽病的室内防效为70.06%,田间防效66.27%～68.54%。可见,酒红链霉菌SVFJ-07对建兰炭疽病菌胶孢炭疽菌具有较好的拮抗作用,生防应用前景良好。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立

本研究基于农杆菌介导的遗传转化方法,建立了芒果胶孢炭疽菌高效的遗传转化体系,获得一批炭疽菌的T-DNA插入突变体,其目的是为炭疽菌的功能基因组学研究和致病相关基因的克隆奠定基础。结果如下:通过摸索并优化了体系的各项因子,在潮霉素筛选浓度为200μg/mL,菌液浓度为OD₆₆₀=0.15条件下,AS为200μmol/L,选择pH5.5的IM共培养基中转化效果最好;进一步通过对转化子的继代稳定性和PCR检测,结果发现潮霉素抗性稳定遗传和假阳性率低;通过菌落形态观察和产孢能力的测定获得3个菌落形态异常突变体,6个产孢能力下降突变体。     

一种优化的辣椒尖孢炭疽菌遗传转化体系

由辣椒尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)侵染引起的炭疽病是辣椒生产中最具有破坏性的真菌病害,严重影响辣椒的品质和产量。本研究以辣椒尖孢炭疽病菌HHDL02为对象,采用1 mol·L^-1 NH₄Cl 2%的酶裂解液裂解分生孢子萌发2 h的芽管,裂解2～3 h可以高效制备原生质体,结合PEG介导转化法成功将GFP基因导入,其转化菌株菌落形态、菌丝生长速率、分生孢子形态、孢子萌发、附着胞形成、产孢量和致病性与野生型菌株无明显差异,且后代荧光信号遗传稳定。PEG介导的原生质体转化适合辣椒尖孢炭疽菌遗传操作,有助于其致病机理的研究。     

胶孢炭疽菌CgSho1基因的克隆与功能分析

HOG-MAPK(high osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase)信号途径是真菌MAPK途径中参与渗透压响应的一条重要通路,在植物病原菌生长发育及致病过程中发挥着重要的作用。Sho1(synthetic high osmolarity-sensitive protein1)是HOG-M APK信号途径上游的一个重要感受器,在不同真菌中常具有不同的功能。本研究从胶孢炭疽菌中克隆了Sho1的同源基因,命名为Cg Sho1,该基因编码一个291个氨基酸的蛋白,含有4个跨膜结构域和一个SH3功能域。利用同源重组的方法获得了该基因的敲除突变体,与野生型相比,敲除突变体表现为营养生长缓慢,菌丝稀疏且疏水性增强,产孢量下降,对氧化压力和渗透压更加敏感,致病力明显减弱。上述结果表明,Cg Sho1参与调控胶胞炭疽菌的营养生长、分生孢子产量、氧化应激反应、渗透压响应及致病性。     

橡胶树胶孢炭疽菌复合群LAMP检测方法的建立及应用

由胶孢炭疽菌复合群(Colletotrichum gloeosporioides species complex)引起的炭疽病是我国橡胶树的主要病害之一。本研究以β-tubulin基因为靶标基因,设计橡胶树胶孢炭疽菌复合群特异性引物,以SYBR Green I为指示剂,建立了特异性强、灵敏度高的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,进行了室内侵染和田间自然发病样品的检测验证。结果表明,该方法能在63℃恒温条件下60 min内检测出病原菌,且能特异性识别我国主要植胶区的橡胶树胶孢炭疽菌。该方法最低检测限为1 pg DNA或100个分生孢子。室内和田间样品检测结果表明,该方法可同时检测出潜伏侵染期和发病期的胶孢炭疽菌。本研究建立的LAMP检测方法为橡胶树胶孢炭疽菌的快速鉴定提供了新技术。     

苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)果胶裂解酶基因Bdpl1的致病功能分析

 由葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)引起的苹果轮纹病是影响我国苹果安全生产的重大病害之一。因此,本研究基于受苹果轮纹菌侵染的苹果组织中果胶裂解酶基因Bdpl1表达上调这一现象,通过Split-marker PCR技术构建Bdpl1基因敲除载体,并通过PEG介导的原生质体转化获得转化子,经常规PCR和qRT-PCR对所获得的转化子进行筛选,成功获得1个Bdpl1基因缺失阳性突变子。该转化子在PDA上的培养基性状与野生型没有明显差异,但在果胶培养基上菌落直径明显小于野生型。其胞外果胶酶活相比野生型明显下降,但在离体“早富”苹果枝条上的致病力并没有明显的下降。通过qRT-PCR技术发现在基因Bdpl1敲除后,其家族内有3个基因在病菌侵染过程中相比野生型明显上调表达(>3倍)。这些现象表明果胶裂解酶基因Bdpl1与病原菌的营养生长过程关系不大,但其参与对寄主果胶类物质的降解。Bdpl1基因对轮纹病菌致病力的影响较小,有可能是Bdpl1基因敲除后,该基因家族内其他基因的上调表达补偿了Bdpl1基因的功能。     

贝莱斯芽胞杆菌HN-2的鉴定及对杧果炭疽菌的抑菌活性研究

菌株HN-2为本实验室分离得到的一株生防细菌，通过采用形态学观察结合现代分子生物学的手段鉴定生防菌HN-2为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis，以杧果炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Penz作为靶标，其发酵上清液的正丁醇萃取粗提物的活性最好，抑菌圈大小为20.93 mm，半最大效应浓度（EC₅₀）为70.62 μg/mL。通过飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）数据结合基因检测的结果分析发现，正丁醇提取物中主要活性成分为脂肽类物质，其中含有表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturins）和泛革素（fengycin）等。通过显微观察发现正丁醇粗提物可以造成杧果炭疽病菌菌丝扭曲、膨大、畸形，从而抑制杧果炭疽病菌的生长，菌株HN-2正丁醇提取物处理后的杧果15 d内未出现杧果炭疽病病状，对杧果果实具有较好的保护作用。贝莱斯芽胞杆菌HN-2的主要活性物质为脂肽类物质，其对植物病原真菌有较好的防治效果，具有进一步深入研究和开发应用的潜力。     

青苹果竹芋平脐蠕孢叶斑病病原菌的鉴定

A new leaf spot disease on Calathea rotundifolia cv. fasciata was observed in Guangdong, China. The pathogen of this disease was identified by pathogenicity, morphological characteristics and multi-gene sequences analysis of ITS, TEF and GAPDH. The result showed that leaf spot of C. rotundifolia cv. fasciata was caused by Bipolaris sivanesaniana. This is the first report of leaf spot disease on C. rotundifolia cv. fasciata caused by B. sivanesaniana.The results of host range determination showed that B. sivanesaniana could also infect Calathea veitchiana and cause leaf spot. This study will facilitate the timely detection and management of Bipolaris leaf spot.     

辣椒炭疽病菌对嘧菌酯的敏感性测定

 从江苏和海南省随机采集分离获得45个辣椒炭疽病菌单孢菌株,根据孢子形态鉴定其病原菌为Colletotrichum gloeosporioides和C.capsici,其中C.gloeosporioides占总菌株数的64.4%.筛选出甘油琼脂(AEA)培养基和水琼脂(WA)培养基,分别作为产孢法和孢子萌发法测定辣椒炭疽病菌对嘧菌酯敏感性的适宜培养基.通过孢子萌发法测定2种病原菌45个菌株对嘧菌酯的敏感性范围在0.009~0.091μg/mL之间,平均EC₅₀为(0.047±0.040)μg/mL.其中29个C.gloeosporioides菌株和16个C.capsici菌株的平均EC₅₀值分别为(0.051±0.047)μg/mL和(0.041±0.024)μg/mL.研究发现旁路氧化酶抑制剂水杨肟酸(SHAM)对嘧菌酯抑制分生孢子萌发有协同增效作用,且嘧菌酯抑制辣椒炭疽病菌菌丝生长的能力较弱.