纳豆激酶分离纯化及其兔抗血清的制

为分离纯化纳豆激酶,使用纳豆激酶粗制液经硫酸铵分级盐析、Sephodex G100和CM-Sephrose-6B FF层析等步骤纯化,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测.以纯化的纳豆激酶作为抗原,结合福氏佐剂,采用多次多点肌肉注射法对兔进行免疫,以琼脂免疫双向扩散法检测效价.试验结果表明,纳豆激酶粗制液经纯化后,得纯酶样品,酶被纯化了28.4倍,比活力为608.6 Uku·mg-1蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一蛋白条带,纳豆激酶兔抗血清效价为1∶64.成功制备的兔抗纳豆激酶抗血清,为研究纳豆激酶的功能提供了物质基础.     

鸡免疫球蛋白MFc(IgMFc)重链的分离纯化及其抗血清的制备

经硫酸铵盐析沉淀并经 DEAE_(32)—纤维素枉色谱分离粗制 IgM,再经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进一步分离纯化鸡血清 IgM。然后用木瓜蛋白酶水解IgM,经 DEAE_(32)—纤维素柱色谱纯化 IgMFc 重链,再用 IgMFc 重链免疫家兔制取兔抗鸡 IgMFc 重链抗血清。     

鸡SIgA的纯化鉴定及免疫小鼠效果的观察

为了探索鸡分泌型免疫球蛋白A(SIgA)分离、纯化及鉴定方法,以新鲜的鸡胆汁为材料,采用硫酸铵盐析法从鸡胆汁中粗提纯鸡SIgA,应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定和纯化SIgA重链,用纯化的鸡SIgA重链蛋白免疫Balb/C小鼠。结果表明,SIgA重链分子量为67~70kD,轻链为26~28kD。免疫Balb/C小鼠抗血清针对SIgA重链的间接ELISA效价可达1∶16000。为进一步研究SIgA生物学特性、单克隆抗体制备和黏膜免疫状况检测提供了技术支持。     

邻苯二甲酸二丁酯人工抗原的制备及免疫鉴定

【目的】制备并鉴定1种新型邻苯二甲酸二丁酯人工抗原。【方法】以4-硝基邻苯二甲酸为原料,经过酯化、还原生成4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP),DBAP再与戊二酸酐反应,衍生生成4-戊二酸单酰邻苯二甲酸二丁酯(DBCP)。将合成的半抗原衍生物DBCP通过活性酯法与牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶联,得到人工抗原。通过免疫新西兰大白兔获得抗血清,经间接竞争酶联免疫法(ic ELISA)检测抗体特异性。【结果】经质谱、氢核磁共振谱图鉴定,半抗原衍生物合成成功,经紫外光谱、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫试验证实偶联成功,并计算得出DBCP与载体蛋白BSA和OVA的结合比分别为11∶1和17∶1。经ic ELISA法检测,兔1和兔2的血清效价均达到1∶128 000,IC50分别为301和308 ng·m L-1,反应特异性较好。【结论】半抗原衍生物的合成是方便、安全的。邻苯二甲酸人工抗原的成功制备使获得DBP多克隆抗体以及建立DBP免疫分析方法成为可能。     

双峰驼血清IgG纯化及其抗血清制备

纯化双峰驼血清IgG并制备兔抗骆驼IgG抗血清,为制备针对特定蛋白的特异性纳米抗体储备材料,利用Protein G纯化双峰驼血清IgG,并用纯化的IgG免疫成年家兔后采用ELISA方法检测抗血清效价;采用间接ELISA方法,利用制备的抗血清检测PCV2 Cap蛋白免疫双峰驼血清中抗Cap蛋白的抗体水平,Western blot技术检测制备的抗血清与从噬菌体纳米抗体库中筛选到的针对不同蛋白的纳米抗体的反应性,以确定抗血清的适用性。结果显示,从双峰驼血清中纯化到骆驼IgG,SDS-PAGE分析显示纯化的骆驼IgG包括3条链,约50ku的传统重链IgG1,约43ku缺失CH1的重链IgG3和约30ku的传统轻链;3次免疫后兔抗骆驼IgG抗血清效价达1∶512 000;应用制备的抗血清检测PCV2 Cap蛋白免疫5次的双峰驼血清中抗Cap蛋白的抗体效价达1∶1 024 000;制备的抗血清可以与原核表达的针对不同病毒蛋白的纳米抗体反应;说明制备的兔抗骆驼IgG抗血清可用于免疫骆驼血清和表达的纳米抗体的检测。研究结果为目标蛋白免疫骆驼后抗体效价检测及纳米抗体文库构建提供关键材料。     

转Bt基因植物中杀虫蛋白的酶联免疫检测技术研究Ⅱ.Bt杀虫晶体蛋白抗体的制备

用碳酸钠裂解液(50mmol/LNa2CO3,50mmol/LEDTA,pH10)从BacillusthuringiensisHD-1的孢晶混合物中分离提取杀虫蛋白的基础上,进一步用聚丙烯酰胺凝胶制备电泳技术纯化杀虫蛋白,获得了高纯度的杀虫蛋白作为抗原,用于免疫家兔制备抗体。比较了不同抗原注射剂量的免疫效应和免疫过程中(不同注射时间)抗体生成量的变化。结果表明,供试的二种抗原注射剂量对抗体的效价无明显影响,随着免疫次数的增加抗体效价不断上升,最终获得了用琼脂双扩散测定效价为1/120的抗血清。Bt杀虫蛋白的免疫原性低。抗血清中的抗体免疫球蛋白(Ig),首先经硫酸铵分级沉淀粗提,再用DEAE-52纤维素柱层析提取纯化,获得了高纯度的IgG,为抗体的酶标记和ELISA检测杀虫蛋白等研究提供了高特异性的Bt抗体。研究的结果为Bt菌HD-1杀虫蛋白抗体的制备提供了依据。     

兔H-Y抗血清的制备和验证

本研究选取1.5~2.0 kg体重的新西兰兔2窝,提取同窝公兔睾丸H-Y抗原并测定蛋白浓度。采取2种不同的免疫方法,制备兔H-Y抗血清,经Western-blot技术检测兔睾丸H-Y抗原组分,应用ELISA法检测抗血清效价,其中5份抗血清中只有0830#产生较高的效价,达1:100以上。本试验结果为兔睾丸抗原组分的测定和兔H-Y抗血清的效价测定提供了一种新的方法。     

抗莱克多巴胺多克隆抗体的制备

为了制备抗莱克多巴胺多克隆抗体,试验通过连接剂butane-1,4-diol diglyciydyl ether把莱克多巴胺和载体蛋白BSA和OVA偶联成免疫抗原和包被抗原,免疫新西兰大白兔,饱和硫铵沉淀方法纯化抗体,间接ELISA法检测抗血清效价。结果通过免疫兔获得了抗莱克多巴胺的多克隆抗体。经ELISA测定,其效价为1∶12800。     

兔瘟病毒结构蛋白的研究

本文用氯仿处理,PEG沉淀;超离,Sepharose 4B柱层析及蔗糖密度梯度离心等方法纯化了兔瘟病毒(RPeV)。电镜下观察到RPeV为无囊膜,大小为32～34nm。纯化了的RPeV通过SDS-聚丙烯酰胺连续梯度凝胶电泳进行多肽分析。发现RPeV多肽只有1条63～64kd主要结构蛋白组成。用SPF兔肝粉吸收后的抗RPeV抗体作免疫转印。证明这条多肽是RPeV所特有的。     

鸡蛋清中溶菌酶提取技术的研究

对鸡蛋清中溶菌酶的提取及纯化技术进行探究,从而获得纯度、活性、浓度均较高的溶菌酶。采用弱酸性阳离子交换树脂法提取,离心透析纯化,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。结果表明,用此方法提取的溶菌酶纯度较高,酶活力为7793U/mg。     

Harpinxoo多克隆抗体制备、鉴定与应用

 以纯化harpin蛋白为抗原免疫新西兰白兔，制备兔抗Harpin蛋白的多克隆抗体，经ELISA法测定抗体效价为1：2000，经亲和层析纯化，Western blot分析制备抗体与原核细胞体外表达的harpin蛋白可以特异性结合，表明该抗体的特异性良好。应用该抗体验证harpin编码基因在转基因水稻中在翻译水平的正常表达。因此，兔抗harpin抗体的成功制备，为进一步深入研究harpin的生物学功能、细胞定位以及在其他植物中的表达等奠定基础。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)(1354-1802)的原核表达及抗血清制备

[目的]制备人组织型纤溶酶原激活剂t-PA(1354-1802)抗血清,并测定其效价,为深入研究t-PA基因功能奠定基础。[方法]利用基因克隆技术获得t-PA(1354-1802)催化域基因片段,然后将其重组到pET-32a(+)质粒中,进行鉴定及序列分析;将测序正确的阳性质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导、蛋白纯化及免疫兔试验。[结果]SDS-PAGE结果显示,37 kD处出现特异性条带;对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备t-PA蛋白抗血清,Western blot分析表明,抗血清可与标准品t-PA蛋白特异性结合,间接ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶12 800。[结论]成功制备了t-PA(1354-1802)抗血清,为t-PA基因功能的深入研究奠定了基础。     

Preparation, Characterization, and Application of Antiharpin xoo Antibody

Polyclonal antiharpinxoo rabbit antibody has been prepared successfully using purified harpinxoo protein as an immunogen. The ELISA titer of the antiserum against harpinxoo was about 1：2 000. Western blot analysis showed that the antiserum could bind to the expression harpinxoo protein in particular, hrfl, encoding harpinxoo, is an expression in transgenic rice, detected by antiharpinxoo rabbit antibody. The rabbit antibody against harpinxoo can be used to study further about the biological function, harpinxoo localization, and hrfl gene expression in other plants.     

大肠杆菌内毒素多克隆抗体的制备与纯化

为制备大肠杆菌内毒素多克隆抗体,应用大肠杆菌内毒素作为抗原免疫5周龄家兔,辛酸-硫酸铵法和葡聚糖凝胶层析法分离提纯抗血清,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳方法鉴定多抗纯度,紫外分光光度计测定抗体蛋白含量,ELISA法检测抗血清效价与交叉反应;大肠杆菌内毒素抗体含量和效价分别为6.95mg/ml和1:12800;成功制备出抗大肠杆菌内毒素多克隆抗体,为大肠杆菌内毒素病诊断试剂盒的研制奠定基础。     

灰飞虱原肌球蛋白的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白（tropomyosin,Tm）能与水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因（Tm）,将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框（open reading frame,ORF）。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序分析,利用DNAstar软件分析该基因序列及其编码的蛋白特性。将测序验证正确的Tm通过EcoR V和BamH I限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pET-32a (+)。重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),经终浓度为0.4 mmol?L^-1的IPTG诱导表达4 h后检测Tm融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用Ni-NTA Agarose纯化上清中的可溶性融合蛋白,经100 mmol?L^-1咪唑洗脱和0.01 mol?L^-1 PBST溶液透析后获取纯化的Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备多克隆抗血清,并采用间接ELISA法检测抗血清效价。纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白经SDS-PAGE分离后,用制备的Tm多克隆抗体进行Western blotting检测,分析抗体的特异性。【结果】序列分析显示,灰飞虱Tm的ORF大小为852 bp。采用RT-PCR克隆获得此ORF并进行测序分析,结果表明扩增所得灰飞虱Tm的ORF长为852 bp,编码283个氨基酸,理论分子量大小为32.6 kD。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守。将Tm ORF克隆入pET-32a (+)表达载体后在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。纯化上清中的可溶性Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备了多克隆抗体。抗体效价测定结果显示该抗体具有较好的灵敏度,效价大于1﹕409 600。采用制备的Tm多克隆抗体检测纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白,分别检测到1条约55 kD和约37 kD的特异性条带,表明该抗体有较强的特异性。【结论】克隆获得了灰飞虱Tm的ORF,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行了诱导表达,纯化获得了Tm融合蛋白,制备了高效价的Tm多克隆抗体。     

葡萄卷叶伴随病毒3号抗血清的制备及应用

为获得特异性抗血清用于批量检测葡萄苗木中的葡萄卷叶伴随病毒3号(Grapevine leafroll associatedvirus 3,GLRaV-3),本研究用含有GLRaV-3CP蛋白基因的载体pMD18-CP为模板,PCR扩增CP蛋白基因。将PCR产物定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选得到阳性克隆pET-G3CP。用终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析显示,GLRaV-3CP在大肠杆菌中得到高效表达。纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。经分析,抗血清效价为1/214,试验结果显示,此抗血清能用于葡萄植株样品中GLRaV-3不同分离物检测。     

鸭肠炎病毒US10基因的原核表达及抗血清的制备

以鸭肠炎病毒 (DEV) C-KCE株基因组DNA为模板,PCR扩增获得US10基因。构建了其 原 核表达载体pET-32a-US10,经1.0 mmol／L IPTG诱导,目的蛋白在Rosetta(DE3) pLys宿主菌中获得了表达。SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白以包涵体形式表达,与预期大小相符。利用 亲和层析法纯化目的蛋白,以纯化的蛋白为免疫原制备其抗血清,琼脂扩散法测得抗体效价为 1∶4,间接ELISA法测定抗体效价为1∶102　400。间接免疫荧光试验证实制备的抗血清可特 异性识别鸭肠炎病毒的US10基因编码产物。     

植酸酶鼠源多克隆抗血清的制备

 【目的】制备灵敏性高、特异性强的植酸酶多克隆抗体。【方法】将初步纯化的麸皮植酸酶蛋白经凝胶电泳鉴定纯度后,按50 μg蛋白/只?次免疫Balb/C小鼠,共免疫4次,每次间隔4周,最后一次免疫60 d后,摘眼球取血,制备抗血清。利用间接ELISA方法测定抗血清效价,间接竞争ELISA测定敏感性和特异性。【结果】凝胶电泳的麸皮植酸酶只有一个条带;血清植酸酶抗体效价达1×104;半数抑制浓度达148.87 ng?mL-1。此抗血清对市售的普通微生物植酸酶、市售包被微生物植酸酶及浓缩的微生物植酸酶的半数抑制浓度分别达到165.59 、163.80和166.51 ng?mL-1,交叉反应率分别为89.85%、90.88%和89.41%。100℃煮沸5 min后的麸皮、市售普通微生物植酸酶、市售包被微生物植酸酶及浓缩酶半数抑制浓度分别为2 871.34、5 208.85、7 914.12和5 804.24 ng?mL-1,交叉反应率分别为5.18%、2.86%、1.88%及2.56%。【结论】制备出了具有高效价、高灵敏度和特异性的鼠源植酸酶多克隆抗体,为植酸酶单克隆抗体制备及植酸酶ELISA检测试剂盒研制奠定了基础。     

兔抗猪瘟高免血清的制备及纯度鉴定

利用猪瘟弱毒疫苗(C株)免疫新西兰大白兔,制备抗猪瘟高免血清IgG。运用间接ELISA方法测血清效价,再经饱和硫酸铵盐析沉淀法提纯血清IgG,SDS-PAGE电泳法鉴定提纯IgG的纯度,结合无菌检查试验和仔猪接种试验,检测血清IgG的安全性。结果表明,获得了蛋白含量为6 mg/mL,效价为1∶6400的高效价、安全性高、成本低的抗猪瘟高免血清IgG。为猪瘟病毒的检测和猪瘟的防制提供了理想的生物制剂。     

犬γ干扰素多克隆抗体的制备及生物活性检测

将犬γ干扰素基因和表达载体pET30a双酶切后构建了重组质粒pET30a-CaIFN-γ,并转化到E.coliRosetta感受态中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示,重组蛋白约23 ku并主要以包涵体形式存在。包涵体通过切胶纯化后肌注家兔,制备出CaIFN-γ的抗血清,测得血清效价为1:12 800。对复性后的包涵体通过细胞试验进行抗病毒活性检测,表明重组犬γ干扰素在终浓度为0.09 mg·mL-1时具有一定的抗病毒活性。本试验成功的原核表达、纯化了犬γ干扰素蛋白,制备CaIFN-γ的抗血清,为CaIFN-γ蛋白生物学特深入研究和生产应用奠定基础。