高邮麻鸭白细胞介素-2基因的克隆与序列分析

[目的]对高邮麻鸭白细胞介素-2（CIL-2）基因进行克隆和序列分析。[方法]以高邮麻鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,根据已发表的鸭IL-2基因cDNA序列设计并合成1对引物,应用两步RT-PCR技术扩增出IL-2基因的特异性片段。将扩增片段插入pGEM-T-easy载体,并进行测序分析和结果验证。[结果]阳性克隆所含插入片段的DNA序列全长为433bp,与预期大小一致,含有1个423bp大小的开放性阅读框,共编码141个氨基酸的前体蛋白,N端21个氨基酸形成信号肽,成熟蛋白为120个氨基酸,分子量约为13.66kD,含1个糖基化位点。该序列与绿头鸭、绍兴鸭、固始鸭相应序列的同源性均为99.8%,与广州白鸭的同源性为99.3%,存在少量核苷酸差异。[结论]高邮麻鸭IL-2编码区基因相对高度保守,为其用于临床疾病治疗提供了一定参考。     

应用巢式PCR检测鸭圆环病毒浙江株及其全基因序列分析

应用巢式PCR（nested PCR）技术对收集自浙江温州种番鸭进行鸭圆环病毒核酸扩增,并对测定的序列进行分析,结果用套式引物扩增出目的条带片段大小约为340nt。根据序列测定结果设计1对反向引物用于测定病毒基因组余下的基因片段。序列分析表明该圆环病毒基因组全长为1995nt,其ORF-V1编码292个氨基酸,ORF—C1编码257个氨基酸。序列分析表明,本试验株与番鸭分离株（GenBank登录号EF451157）和半番鸭分离株（GenBank登录号EU344804）的同源性最高,均高达99．2％,与鸭圆环病毒欧洲（德国）分离株和北美（美国）分离株在同一支遗传进化关系上。     

地方品种固始鸭与樱桃谷鸭α-干扰素基因的克隆与遗传进化分析

根据GenBank发表的鸭α-干扰素(interferon-alpha,IFN-α)基因序列(AY879230),设计并合成了1对引物,提取固始鸭和樱桃谷鸭基因组DNA,应用PCR技术扩增地方品种固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因,并克隆、测序.测序结果表明获得了固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因,大小均为584 bp,包含1个IFN-α基因完整的开放阅读框,编码191个氨基酸的多肽.推导的氨基酸有2个潜在的 N-糖基化位点,有7个与二硫键形成有关的半胱氨酸.克隆的固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因与北京鸭IFN-α基因的氨基酸序列比较,仅固始鸭IFN-α基因发生突变D38N.固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因与其他IFN-α基因的氨基酸序列遗传进化树分析表明樱桃谷鸭与北京鸭有很近的亲缘关系,固始鸭次之.地方品种固始鸭在非常保守的38位发生了氨基酸突变,推测这可能与该品种鸭具有很强的抗病能力有关.     

H5N1亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及分子进化分析

用RT—PCR法,以1株H5N1。亚型禽流感病毒RNA为模板,扩增了NP全基因cDNA。将NP cDNA克隆于pMD18-T载体,并对其进行测序。测序结果表明：所克隆的NP基因全长1542bp,该核苷酸的片段包含了核蛋白完整阅读框架,其中编码区为1497个核苷酸,编码498个氨基酸。将其序列与6株A型流感病毒NP基因序列进行比较,各毒株之间NP基因核苷酸序列同源性为92．5％～95．9％,编码的氨基酸同源性为97．0％～98．4％。通过分子进化分析揭示了各毒株间的亲源关系。     

貉白介素-18(IL-18)基因的克隆及序列分析

从植物血凝素（PHA）诱导的貉外周血淋巴细胞中提取总RNA,通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）首次对貉IL-18的基因进行扩增。序列分析结果表明,该序列含有1个582bp的开放阅读框架,编码193个氨基酸,与已报道的北极狐和犬IL-18序列同源性高达95．9％和94．8％,氨基酸同源性为93．8％和91．2％,与其它物种的IL-18基因间具有较大种属差异性。     

斗鸡新城疫病毒DQ株融合蛋白基因序列分析

从越南斗鸡暴发的病例中分离出1株新城疫病毒（NDV）,命名为贵州分离株（DQ）。采用RT—PCR方法扩增分离株（DQ）的整个F基因片段,并将其克隆到pMD-18T载体中。序列分析结果表明,DQ株F基因分子长为1662bp,编码553个氨基酸。该毒株与国内2株分离株（CH2000、TW2000）之间的亲缘关系较近,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95．7％-96．6％和96．6％-96．8％;但与LaSota、B1及1748E9等常见毒株的核苷酸和氨基酸同源性仅为84．0％-86．5％和87．2％-89．9％。DQ分离株在F蛋白裂解住点的氨基酸顺序为^112R—R—Q—K—R—F^117,与NDV强毒株特征相符,且具有101处的K（赖氨酸）和121处V（缬氨酸）2个特征性氨基酸,与NDV基因Ⅶ型的特性完全相符。利用MegAlign软件绘制NDV的系统发育进化树表明该分离株为基因Ⅶd亚型。     

红鳍东方纯IL-2基因克隆及序列分析

鱼白细胞介素-2是近年来新发现的一类细胞因子。根据Bird等发表的河豚IL-2基因序列设计一对特异性引物,通过RT—PCR方法扩增和克隆了红鳍东方纯（Fugum6却es）白介素-2的核苷酸序列。该cDNA序列由490nt组成,编码由149个氨基酸组成的前体蛋白。序列分析表明,红鳍东方纯IL-2核苷酸序列和氨基酸序列与目前已知的其它物种IL-2的核苷酸及氨基酸的同源性分别位于34％-44％和24％～43％之间,N端存在长22个氨基酸的信号肽,含有形成2个链内二硫键的4个半胱氨酸。遗传进化分析表明,红鳍东方纯IL-2在遗传进化上具有其独立性。     

黑豆NBS类抗病基因同源片段的克隆与分析

根据已克隆的抗病基因保守结构域设计简并引物,以湖南黑豆（HH）为试材,通过RT-PCR,从cDNA中扩增抗病基因同源序列,测序鉴定出2个含有通读阅读框的DNA片段：FNBSl、FNBS3。FNBS1大小为534bp,编码178个氨基酸;FNBS3大小为513bp,编码169个氨基酸。BLASTP分析表明,2个片段均具有NB-ARC结构域（与植物抗病有关）,并且包含p-loop、Kinase-2、HD等结构域。基因FNBSl与大豆基因RPMl-like编码的氨基酸序列的同源性为98％,基因FNBS3与大豆基因N-like 编码的氨基酸序列的同源性为99％,推测FNBS1、FNBS3可能是黑豆NBS-LRR类抗病基因的核心区域。     

红鳍东方纯IL-2基因克隆及序列分析

鱼白细胞介素-2是近年来新发现的一类细胞因子。根据Bird等发表的河豚IL-2基因序列设计一对特异性引物,通过RT—PCR方法扩增和克隆了红鳍东方纯（Fugum6却es）白介素-2的核苷酸序列。该cDNA序列由490nt组成,编码由149个氨基酸组成的前体蛋白。序列分析表明,红鳍东方纯IL-2核苷酸序列和氨基酸序列与目前已知的其它物种IL-2的核苷酸及氨基酸的同源性分别位于34％-44％和24％～43％之间,N端存在长22个氨基酸的信号肽,含有形成2个链内二硫键的4个半胱氨酸。遗传进化分析表明,红鳍东方纯IL-2在遗传进化上具有其独立性。     

鸡新城疫Ⅰ系疫苗诱导鸡IL-2基因转录及cDNA克隆的研究

应用RT-PCR方法从鸡新城疫 系疫苗接种鸡胚的脾淋巴细胞中扩增出IL-2基因cDNA。结果表明,以鸡新城疫 系疫苗稀释50倍或100倍接种10日龄鸡胚,培养48h的脾脏提取mRNA的扩增效果最好。测序结果显示,所扩增片段的核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列,与已发表的IL-2基因的同源性分别为97.7%～99.8%和95.1%～99.3%。其中第8位、68位和130位氨基酸(分别是L,V和S)的变异是其他品种鸡所没有的。