马氏珠母贝IKKε同源基因的克隆及表达分析

IKKε（inhibitor of NF-κB kinasesε）是NF-κB（nucleur factorκB）信号通路中的关键成员,参与调控细胞的分化、发育、凋亡及免疫反应。本研究根据马氏珠母贝转录组数据库中注释为IKKε的unigene序列设计引物,应用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆获得了马氏珠母贝（Pinctada martensii）IKKε基因cDNA的全长序列（PmIKKε）并对其序列特征进行分析;同时利用荧光定量PCR（Real-time PCR）技术检测了马氏珠母贝六个组织中PmIKKε基因mRNA的表达。结果表明：PmIKKε基因cDNA全长2 843 bp,其中5＇UTR为116 bp,3＇UTR为516 bp,含有27 bp polyA,开放阅读框为2 211 bp,编码737个氨基酸残基。预测其分子量为85.07 kD,等电点为6.17。多序列比对显示PmIKKε与其它物种IKKε有较高的同源性,与牡蛎的序列相似性有45%。软件分析结果显示PmIKKε的N端含有一个蛋白激酶功能结构域和一个MAPKK（mitogen-activated protein kinase kinase）的激活位点,C端含有一个亮氨酸拉链（leucin zipper,LZ）和一个螺旋-环-螺旋结构（helix-loop-helix,HLH）。荧光定量PCR分析表明PmIKKε在马氏珠母贝肝胰脏、性腺、血淋巴、鳃、外套膜、闭壳肌六个组织中均有表达,肝胰脏中表达量最高。本研究为进一步阐述PmIKKε在马氏珠母贝生长、发育及先天性免疫中的作用提供理论基础。     

马氏珠母贝LST8基因cDNA的分子特征及表达分析

LST8（lethal with SEC13 protein 8）是TOR（target of rapamycin）复合物的重要组成成分,在生物生长和发育的调控中发挥重要作用。本研究根据马氏珠母贝转录组数据库中注释为LST8的unigene序列设计引物,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆获得了马氏珠母贝LST8基因cDNA全长序列（pm-LST8）;同时利用荧光定量PCR（Real-time PCR）技术检测了pm-LST8在马氏珠母贝各个组织中的表达含量。结果表明,pm-LST8基因cDNA全长1 350 bp,其中开放阅读框为948 bp,编码316个氨基酸残基,5＇UTR为104 bp,3＇UTR为298 bp,含有29 bp polyA。预测其分子量为35.4 kD,等电点为6.11。多序列比对显示pm-LST8与其它物种的LST8有较高的保守性,与牡蛎的同源序列高达82%。蛋白质结构预测显示pm-LST8具有典型的WD40结构域。荧光定量PCR分析表明pm-LST8在马氏珠母贝闭壳肌、鳃、外套膜、肝胰脏、性腺、足、血淋巴七个组织中均有表达,其中在性腺中表达量最高。本研究为进一步阐述LST8在马氏珠母贝生长和发育调控中的作用提供理论基础。     

青鳉鱼DBI基因全长cDNA的克隆与蛋白结构分析

地西泮结合抑制因子(diazepam binding inhibitor,DBI)具有抑制由葡萄糖诱导的胰岛素分泌、促进胆固醇跨线粒体膜转运和调节脂肪酸合成与代谢等多种生理功能。本研究使用反转录PCR结合RACE方法克隆了青鳉鱼(Oryzias latipes)的DBI基因全长cDNA序列。该序列全长592bp,包含长度为102bp的5'端非编码区(5'-UTR),长度为220bp的3'端非编码区(3'-UTR),和长度为270bp的开放阅读框,推测其编码89个氨基酸。同源性分析结果显示青鳉鱼DBI蛋白序列与大西洋鲑、鲤鱼、斜带石斑鱼、斑马鱼、非洲爪蟾、大鼠和人的同源性分别为82%、76%、76%、75%、72%、71%和70%,说明DBI基因在脊椎动物的进化过程中非常保守。同源建模显示青鳉DBI蛋白的4个α螺旋结构围成一个脂酰CoA结合口袋,与已测定果蝇DBI蛋白具有非常相似的三级结构。本研究结果为阐明脊椎动物在进化过程中DBI分子结构的演变规律及DBI在低等脊椎动物中的作用机理等提供了有意义的科学参考。     

三种诱导马氏珠母贝四倍体方法的比较

摘要：比较了3种诱导马氏珠母贝（Pinctada martensii D.）四倍体产生的方法。①由三倍体马氏珠母贝的卵子与二倍体的精子受精，抑制受精卵第一极体的释放，诱导形成四倍体，四倍体率在D形幼虫期为27.7%～35.9%，幼虫死亡率高，在幼贝以后未能检测到四倍体的存在；②药物直接抑制二倍体马氏珠母贝受精卵第一极体和第二极体的释放，诱导四倍体；此法诱导的四倍体率在担轮幼虫期为30%以上，死亡率也较高，但在中贝（养殖7个月的贝）中检测到四倍体，四倍体率为0.0625%；③抑制二倍体马氏珠母贝受精卵的第一次卵裂形成四倍体；此法产生的四倍体马氏珠母贝在担轮幼虫期可达13.1%，但孵化率极低，早期死亡率极高，不能通过变态。比较研究表明，直接抑制二倍体马氏珠母贝受精卵的极体形成可以获得成活的四倍体马氏珠母贝，此方法值得进一步研究。     

5种常见珍珠贝的系统发育和遗传多样性分析

利用RAPD标记分析了珠母贝属常见的马氏珠母贝、大珠母贝、珠母贝、解氏珠母贝以及珍珠贝属常见企鹅珍珠贝的系统发育,同时分析了马氏珠母贝和大珠母贝不同地理种群的遗传多样性,并以邻接法（neighbor-joining,NJ）构建了种间及种群间的系统分支图。结果表明：（1）在珍珠贝5种9个种群中,大珠母贝的4个种群最早聚在一起分别成为2个姊妹群,这2个姊妹群聚合为1个单元群后,又与珠母贝聚在一起,然后才与马氏珠母贝姊妹群聚合成的单元群聚合,再与解氏珠母贝聚合,最后才与企鹅珍珠贝聚合;（2）珠母贝属4种珍珠贝进化程度由低到高的等级顺序为解氏珠母贝-马氏珠母贝-珠母贝-大珠母贝;解氏珠母贝是最晚形成的种类;（3）比较5种珍珠贝野生种群的Nei＇s多样性和Shannon多样性值为：马氏珠母贝（0.4111和0.5933）〉珠母贝（0.3971和0.5784）〉企鹅珠母贝（0.3831和0.5493）〉大珠母贝（0.3388和0.4999）〉解氏珠母贝（0.3016和0.4452）;（4）无论是马氏珠母贝,还是大珠母贝,野生种群的遗传多样性值均大于养殖种群。     

鸡β-防御素基因的克隆与结构分析

通过RT-PCR扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的部分cDNA序列，大小分别为198、195和297bp。利用PCR技术扩增出鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因组DNA部分序列，大小分别为1176、1053和2454bp。经分析发现，2个内含子将鸡-β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的编码区分成3个外显子部分。第1个外显子编码绝大部分信号肽序列；第2个外显子编码信号肽羧基端极小部分序列、原片段序列与大部分成熟肽序列；第3个外显子编码小部分成熟肽序列。扩增到的鸡β-防御素Ga1-1、Ga1-2和Ga1-3基因的两个内含子长度，分别为482和496bp，183和675bp，980和1280bp。鸡β-防御素基因编码区结构的这种组成与哺乳动物的β-防御素基因的不同，在哺乳动物中为1个内含子将β-防御素基因编码区分成2个外显子部分。Blast比较发现，鸡β-防御素Ga1-1和Ga1-2基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．182上，并且这2个基因转录方向相反。Ga1-3基因位于鸡的3号染色体连续克隆群Contig42．181和Contig42．182上，转录方向与Ga1-1基因相同。     

谷子脂转移蛋白cDNA的克隆及特性研究

摘要：首次报道了从谷子(Stetaria italica )未成熟种子cDNA文库中克隆到1个与其它物种脂转移蛋白（LTP）具有较高同源性的脂转移蛋白基因Siltp。将核苷酸序列和推断的氨基酸序列在GenBank中进行比较，发现Siltp与大麦脂转移蛋白LTP7a2b和LTPcw-19,玉米脂转移蛋白，欧洲油菜的脂转移蛋白基因的核苷酸序列的同源性分别为72%,70%,60%,54%；氨基酸序列的同源性分别为79%,73%，65%，57%。序列分析表明，编码区含363个碱基 ，编码121个氨基酸，其中包括26个氨基酸的信号肽序列，分子量为9.3 kD。基因组Southern杂交结果表明，Siltp在基因组中以单拷贝存在。Northern杂交研究Siltp的时空表达特异性，发现Siltp仅在茎、叶、穗中表达。利用软件PAUP对17种植物的LTP进行进化分析，从进化系统树可以看出LTP有4个分支，其中，小麦发生分化较早，其它几种单子叶植物如玉米、谷子、大麦和水稻分化较晚，说明发生了早期的基因复制事件。在整个系统图中，双子叶比较分散，说明LTP基因的进化是个复杂的过程；禾本科作物的脂转移蛋白基因是由一个原始基因分化而产生的不同分支，Siltp与大麦LTP亲缘关系最近。     

荔枝铜锌超氧物歧化酶基因的克隆与序列分析

以"三月红"荔枝基因组DNA为模板,用Cu*ZnSOD基因特异寡聚核苷酸为引物,进行PCR扩增,得到特异基因片段,将其克隆到pGEMT载体上,转化感受态大肠杆菌TG1中,对转化子中重组pGEMT上的Cu*ZnSOD基因片段的PCR扩增检测和序列分析,表明克隆成功;该基因片段有478个核苷酸,由4个外显子和3个内含子组成;外显子由234个核苷酸组成,编码78个氨基酸;该基因片段编码的氨基酸序列与水稻、玉米、番茄、大白菜和松树的Cu*ZnSOD基因编码的氨基酸序列的同源性分别为79.5%、73.1%、73.1%、71.8%和75.7%.     

鸡γ-干扰素cDNA的克隆和在大肠杆菌中的温度诱导型表达

克隆了鸡(Gallus gallus)的γ-干扰素cDNA，并用大肠杆菌(Escherichia coli)进行了温度诱导型表达。用PCR方法扩增了鸡γ-干扰素基因组基因，将其克隆到载体pGEM-T上。对重组载体的插入片段进行酶切分析和部分序列测定：证明了基因的正确性；克隆的鸡γ-干扰素基因的编码序列中存在一个点突变(G→A)，这一突变导致一个三联体密码子GAA变为AAA，编码的氨基酸由谷氨酸(Glu)变为赖氨酸(Lys)。用鸡γ-干扰素基因组基因构建了真核表达载体pCI-ChIFN。将这一真核表达载体转染兔成纤维细胞的细胞系中进行表达实验：提取转染后细胞裂解物中的RNA，再以此为模板进行RT—PCR，获得了完整的鸡γ-干扰素cDNA基因，同时证明鸡γ-干扰素基因组基因能在兔成纤维细胞系中表达。用鸡γ-干扰素cDNA构建了温度诱导型原核表达载体pBVcDNA，并将其转导到大肠杆菌DH5α中，经细菌发酵和温度诱导，表达了一个18kD的特异蛋白，其表达量占细菌总蛋白的8．75％。     

边鸡胰岛素样生长因子1基因（IGF-1）外显子3的多态性及其与繁殖性能的关系

根据GenBank中发表的鸡胰岛素样生长因子1基因(IGF-1)的序列针对外显子2和外显子3分别设计1对引物,采用PCR-SSCP技术检测边鸡(Gallus gallus)及2个对照群体(京海黄鸡(Gallus gallus)和尤溪麻鸡(Gallus gallus))的单核苷酸多态性,并与边鸡的繁殖性能进行相关性分析.结果表明,3个品种在IGF-1外显子2中未检测到多态,而在外显子3中都检测到3种基因型(AA,AB和BB).在边鸡和京海黄鸡中A等位基因为优势等位基因,而在尤溪麻鸡中B等位基因为优势等位基因.克隆测序表明,AA型与BB型相比有两处突变(93A→G和148G→A),其中148 bp处的突变导致氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸,通过与Gen-Bank中的鸡IGF-1基因序列比对,发现两处突变分别位于IGF-1基因外显子3的62 bp和117 bp.最小二乘分析表明,AA与BB基因型个体300日龄的产蛋数存在显著差异(P<0.05).     

黑番鸭血管活性肠肽受体-1基因(VIPR-1)的cDNA克隆及其组织表达特性分析

最近的研究表明,血管活性肠肽(VIP)与家禽的就巢习性密切相关。本研究采用反转录PCR方法从黒番鸭(Cairina moschata)母鸭下丘脑组织中克隆了血管活性肠肽受体(VIPR-1)基因的cDNA序列,长度为1125bp,编码355个氨基酸(GenBank登录号:JN625215)。序列比对结果表明,该序列与家禽(鸡、火鸡、鹌鹑)和哺乳动物(人、小鼠、猪、牛)的基因序列分别有93%~94%和69%~71%的同源性,而相应氨基酸序列的同源性分别为96%和70%~72%。荧光定量PCR结果发现,黒番鸭VIPR-1基因的表达量在产蛋期、就巢期和休产期差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),就巢期表达量最高,休产期次之,产蛋期表达量最低,表明VIPR-1基因与繁殖阶段变化密切相关;对不同组织VIPR-1的表达量分析发现,VIPR-1在垂体、下丘脑和卵巢中均有表达,其中垂体最多,其次是下丘脑,卵巢中的表达量最低,差异极显著(P<0.01)。研究结果提示,VIPR-1基因具有高度保守性,参与下丘脑-垂体-卵巢轴(特别是垂体)对黑番鸭就巢行为的调控。     

猪MYL4基因的克隆及其在猪胚胎骨骼肌中的差异表达分析

克隆了猪MYL4基因的cDNA序列,并利用生物信息学方法进行验证。所得cDNA序列全长1105bp,包含一个完整的开放阅读框,编码197个氨基酸。序列分析表明,该基因与已报道的狗、人、黑猩猩和恒河猴等物种的MYL4基因高度同源,氨基酸序列同源性分别为98.4%、95.9%、95.4%和95.4%。该基因编码的蛋白具有EFH和FRQ1保守功能域。荧光定量分析该基因在猪胚胎骨骼肌（妊娠33 、65 和90 天）中的表达规律,发现MYL4基因在通城猪和长白猪中呈波浪式表达模式,在妊娠第33 天时中外猪品种间无显著差异,但在65 和90 天时长白猪中显著高于通城猪。     

鲤CC型趋化因子CCL-C5a样基因的克隆、组织表达与进化分析

趋化因子家族是一类能诱导白细胞激活和迁移的趋化性细胞因子家族,是鱼类先天免疫的重要组成部分.CC类家族是趋化因子家族中最大的家族之一.为研究鲤CC类家族成员的组织表达和进化模式,以及进一步研究鲤CC类趋化因子的免疫调控机制,本研究选择该家族其中的一个基因,CCL-C5a样基因,根据EST序列结合RACE方法从鲤(Cyprinus carpio)脾脏中克降了该基因的全长cDNA序列(GenBank登录号:JQ026408).该序列全长830 bp,5端非翻译区174 bp,3端非翻译区296 bp,开放阅读框360 bp,编码一个由119个氨基酸组成的蛋白.结构域分析发现,该蛋白质含有分泌信弓肽和保守的趋化因子结构域;Gene Ontology注释该基因参与免疫细胞迁移的生物学过程.CCL-C5a基因在鲤10个组织中表达,其中在脾和肝的表达量最高.脂多糖刺激鲤外周血白细胞和头肾白细胞后,该基因表达量出现显著上升.氨基酸序列保守性分析表明,鲤CCL-C5a样趋化因子与斑马鱼(Danio rerio)的同源性最高,为61％,与蓝鲶(Ictalurus futrcatus)、沟鲶(Ictalurusp unctatus)和大西洋鲑(Salmo salar)的同源性分别为47％、47％和42％;与人(Homo sapiens)CCL19蛋白的同源性为37％.适应性进化分析发现,鲤与斑马鱼CCL-C5a的Ka/Ks小于1,说明CCL-C5a基因在鱼类的进化过程受到负选择压作用.本研究结果表明,鲤CCL-C5a主要在免疫器官上高表达,并受到脂多糖诱导表达上升;同时该基因在鱼类中受到负选择作用.这些结果提示CCL-C5a可能是一个与免疫相关的基因.     

肌肉生长抑制素基因(MSTN)外显子1的多态性及其与边鸡生长性状的关联分析

为了对边鸡生长性状的标记辅助选择提供基础资料,本研究采用PCR-SSCP技术检测边鸡(Gallusgallus)及3个对照鸡(G.gallus)群体(京海黄鸡、尤溪麻鸡和Arbor Acre鸡)肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因外显子1的单核苷酸多态性,并与边鸡的生长性状进行相关性分析。结果表明,在边鸡、京海黄鸡和尤溪麻鸡中都检测到6种基因型(AA、AB、BB、BC、AC和CC),而在Arbor Acre鸡中只检测到4种基因型(AB、BC、AC和CC)。总共检测到3个多态位点(G2100A、G2109A和C2244G)。在6～8和12周龄时,BB基因型个体的体重显著高于AA基因型个体(P<0.05)。在14周龄时,BB基因型个体的体重显著高于AA和AC基因型个体(P<0.05)。在16～18周龄时,BB基因型个体的体重显著高于其余5种基因型个体(P<0.05)。研究结果提示,MSTN基因可能是影响边鸡生长性状的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个标记。     

鸡性别决定与分化分子机制研究进展

鸡(Gallus gallus)是重要的模式生物和农业动物,性别是其主要的生长发育性状和经济性状.目前鸡性别决定和分化的分子机制还不十分清楚.已有研究证明,尽管鸡有明确分化的性染色体(ZZ/ZW),性别决定和分化主要由遗传决定,但其性腺和成体性别形成和分化一定程度受到环境因素,特别是机体性激素的调控和影响.此前对鸡性别决定和分化机制的解释,主要集中在W染色体显性效应与Z染色体剂量效应两个假说,分别有一定实验证据支持但都不能令人完全信服.本研究在阐述已有假说及其相关研究的基础上,重点介绍了表观遗传学在鸡性别决定和分化研究中取得的最新进展,以及新近发现的鸡性别决定的细胞自主性问题.     

广西德保猪MC1R基因的克隆与分析

近年来含有天然黑色素的动植物黑色食品得到青睐,为探讨广西地方品种德保猪全黑毛色形成的分子机制,本文克隆了广西德保猪MC1R基因并进行了系统生物信息学分析。根据NCBI已公布的猪MC1R基因序列（GI：347618788）设计特异性引物,以从德保猪血液中提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆获得长1 519 bp的MC1R基因序列片段。多重序列比较结果显示克隆片段与已公布的猪、牛、人、狗、绵羊、小鼠和鸡的相似性依次分别为99%、87%、86%、85%、84%、81%和77%,表明MC1R基因在不同哺乳动物间具有较高的保守型。德保猪MC1R蛋白结构预测结果显示,其理论分子质量为34.65 ku,等电点为8.70,为弱碱性蛋白,N-末端不存在信号肽,定位于细胞质膜,具有1个低复杂度结构域和7个跨膜结构域,具有典型的细胞膜受体蛋白结构。多项研究报道表明MC1R基因是动物毛皮颜色重要的决定基因,德保猪MC1R基因克隆为揭示其全黑色形成的分子机制奠定了较好的实验基础。     

番茄果实中LeERFl、LeERF2基因的克隆及序列分析

乙烯反应元件结合蛋白属于植物特有的一个转录因子家族,这个家族保守的DNA结合域称为ERF结构域.根据对番茄(Lycopersicon esculenturm)和其它植物物种中EREBP基因家族的同源性比较,在保守区(ERF区域)设计合成一对简并引物,通过RT-PCR扩增得到一个114bp的片段,用此片段作探针筛选番茄cDNA文库(粉红期),得到两个基因LeERFl和LeERF2.通过BLAST工具在GenBank中搜索表明,LeERFl和LeERF2基因属于EREBP家族,LeERFl与EREBP-4和DDTFRl0/A在氨基酸水平上的序列相似性为35%,LeERF2与EREBP-3和pti5在氨基酸水平上的序列相似性为46%,是新的基因.LeERFl和LeERF2的核酸序列在GenBank发表,登录号分别为AY077626和AY275554.     

鸡解耦联蛋白基因型与活性氧含量、初生重的相关性分析

为了研究解耦联蛋白基因(uncoupling protein,UCP)对鸡(Gallus gallus)初生重及活性氧含量的影响,本实验通过对3个品种鸡初生重、UCP C353T多态位点基因型以及肌肉组织活性氧(ROS)含量的测定,发现丝羽乌鸡ROS值显著低于白莱航、寿光鸡,UCP TT基因型ROS值显著高于CT和CC基因型,而ROS含量与雏鸡初生重之间存在着正向的相关性(r=0.5011),UCP TT基因型的初生重显著高于CT和CC基因型。实验结果揭示了鸡UCP基因型对初生重性状具有选择效应。