基于TksGlfex DNA聚合酶SSR扩增的棉花DNA一步提取法

DNA提取是SSR-PCR检测的前提,但因棉花中富含多酚、多糖和蛋白质等干扰物质,使得提取棉花DNA较其他植物困难,这也导致棉花分子辅助育种明显滞后。本研究探索出适用于SSR技术的一步快速提取棉花DNA的方法。该方法 DNA提取液成份包括0.1 mol/L Na OH、0.7 mmol/L NaCl、20 mmol/Lβ-巯基乙醇、2%SDS和2%PVP。该方法的具体步骤是:将液氮下研磨成粉状的棉花幼嫩叶片,放入含0.5 m L DNA提取液的离心管中。热裂解后加入盐酸离心,取上清,直接用于SSR-PCR扩增。将该方法提取的DNA片段较大,质量较好,能很好地用于TksGlfex DNA聚合酶的SSR-PCR扩增,扩增电泳条带清晰。此棉花DNA提取操作简单、高效,相比传统的棉花DNA提取而言,显著地节约DNA提取时间。     

一种适于SSR-PCR的棉花基因组DNA提取法

本文是一种适合于棉花这样高含酚类植物进行DNA提取的方法,提取程序中增加了DIECA、PVP40等对棉花酚类物质氧化有抑制作用的试剂,简化并改进了本实验室常用的棉花总DNA提取方法的步骤,使棉花总DNA能够快速高质量提取,避免了以往的棉花总DNA提取过程中棉酚的氧化对DNA提取质量的影响,提取的DNA能很好地进行SSR-PCR分析.本法提取的棉花总DNA呈乳白、疏松的丝状、干后为透明状,能很好的溶解在TE或ddH2O中.用本方法提取的棉花总DNA作为模板用JESPR系列SSR标记对其进行SSR-PCR扩增,可以扩增出清晰的条带.     

提取棉花基因组DNA的一点探讨

介绍了两种提取棉花基因组DNA的方法:CTAB法和SDS法,同时比较了对棉花叶片进行不同处理后提取DNA的效果。结果表明:两种方法均获得了较高质量的DNA;新鲜的棉花叶片、在4℃黑暗中饥饿1d的叶片和在室温条件下自然干燥1d的叶片都可以提取到质量满意的DNA,用42℃干燥1至数天的叶片提取到的DNA明显降解,但能够满足PCR等实验的要求。     

一种适用于SSR-PCR的棉花干种子DNA快速简便提取方法

利用改良的SDS法提取棉花干种子的基因组DNA,所得基因组DNA经分光光度计、琼脂糖凝胶电泳和随机SSR引物扩增效果检测,结果表明利用改良的SDS法直接所提取棉花干种子的基因组DNA,符合棉花SSR-PCR反应对DNA质量的要求。本研究为棉花SSR分析建立了一种快速、简便的干种子DNA提取方法,为SSR标记在棉花遗传育种研究中的应用奠定了基础。     

3种制备猪肺炎支原体DNA模板方法的探讨

为了筛选出一种快速、高效、廉价提取猪肺炎支原体模板DNA的方法,本研究分别对试剂盒法、双蒸水煮法、酚-氯仿法进行比较,从中选出最佳提取方法。结果显示：这3种方法均适合由菌液中提取基因组DNA;水煮法不能由组织中提取出基因组DNA,试剂盒法可由组织中提取出基因组DNA且得到的目的DNA较纯,但每次提取量少;酚-氯仿法能大批量提取组织基因组DNA,但操作繁琐,易污染且稍有杂带。针对不同的模板,选择合适的DNA制备方法,有利于做出准确检测、提高检测效率,为疾病的早期诊断提供保障。     

金龟甲基因组DNA提取方法比较研究

摘 要：为了筛选适宜金龟甲RAPD-PCR的基因组DNA提取方法,于2009年在青岛农业大学实验室内,分别采用改良的SDS法、平衡酚法、裂解液法和CTAB法提取棕色鳃金龟(Holotrichia titanis Reitter)的基因组DNA,通过DNA沉淀性状观察、产量和质量分析,以及随机引物PCR (RAPD-PCR)比较,筛选最优的金龟甲基因组DNA提取方法。研究结果表明,改良的SDS法提取的基因组DNA产量较高,但纯度较低,并且降解严重,RAPD-PCR扩增谱带弥散较严重;裂解液法提取的基因组DNA纯度较高,降解程度较低,但产量最低,RAPD-PCR扩增谱带弥散较严重,并且存在非特异扩增现象;CTAB法提取的基因组DNA不仅产量和纯度较低,降解严重,而且RAPD-PCR扩增结果不稳定,具非特异扩增现象;平衡酚法提取的基因组DNA产量和纯度高,降解轻微,RAPD-PCR扩增结果稳定,扩增谱带弥散轻微。因此,在上述4种方法中,平衡酚法是最适合PAPD-PCR的金龟甲基因组DNA提取方法,裂解液法和改良的SDS法次之,CTAB法最差。     

改良SDS法快速提取小样品量棉花总DNA及其纯化

聚合酶链式反应(Polymerase chain reac-tion,以下简称PCR)对DNA的纯度要求并不十分严格,而且需要的DNA模板量并不是很多。因此水稻、玉米、大豆等作物上都先后发展了满足PCR反应的DNA快速提取方法。由于棉花富含棉酚、多糖、单宁等物质,在细胞破碎时,棉酚等多酚类物质自动氧化,然后跟蛋白质、核酸等发生不可逆反应,结果形成棕色胶状复合物,影响高质量DNA的获取。在提取液中加入PVP40,能与酚类物质结合,使获得的DNA进一步纯化。棉花DNA提取方法还在不断改进,但目前大多采用以CTAB为基础的提取方法,提取液成分比较复杂,DNA提取…     

利用CTAB/酸酚法提取棉花组织总RNA

通过借鉴植物DNA的CTAB提取方法,结合总RNA的LiCl沉淀法,摸索出一套适合于棉花组织总RNA提取和纯化的技术—CTAB 酸酚法。该方法与异硫氰酸胍法或冷酚法等相比具有更简便、得到的棉花组织总RNA完整性好和纯度高等优点。     

利用改良的CTAB法提取棉花叶片总RNA

由于棉花基因组中含有大量的内含子,直接利用由基因组克隆的基因十分困难,目前国内外主要采用由棉花的cDNA作模板克隆基因并进行遗传转化.得到完整的cDNA必须有高质量的RNA,由于棉花组织中棉酚、多糖的含量较高,因此用通用的提取RNA的方法提取棉花RNA比较困难,国内外的许多学者针对棉花的具体情况已经发展形成几种比较有效的棉花总RNA的提取方法,如:高离子强度、高pH值提取法、热CTAB法、异硫氢酸胍法、Trizol reagent kit法、CTAB/酸酚法、热酚法和热硼酸法等;这些方法都能提出棉花的总RNA,但相比较而言,异硫氢酸胍法和Trizol试剂比较昂贵,高离子强度、高pH值提取法步骤繁琐,本文借鉴热CTAB法并进行了改良,提出一套完整可行的提取棉花叶片总RNA的经济简便的方法.     

一种适用于棉花种子的DNA快速提取方法

对已报道的小麦、玉米等作物基因组DNA快速提取方法进行改良,首次在棉花上进行了尝试。以棉花种子为材料,用SDS法、NaOH法和简化法提取基因组DNA。结果表明,3种方法提取的DNA条带均较为清晰,完整性好,PCR扩增效果明显,结果稳定可靠。但DNA简化提取法整个提取过程操作简单、花费时间少、成本低,能在较短时间内完成大量样品的DNA提取。相比常规的以棉花叶片为材料的DNA提取法,本方法在降低试验成本的同时大大提高了工作效率。     

棉花细菌人工染色体文库构建方法探讨

 细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome, BAC）文库是开展基因组测序、基因图位克隆、分子标记、物理作图等研究的重要基因组资源。本文在构建了二倍体野生棉阿非利加棉（Gossypium herbaceum var. africanum）BAC文库的基础上,就棉花细菌人工染色体基因组文库构建过程中高分子量基因组DNA的提取、部分酶切片段选择、DNA的回收、连接转化以及BAC文库的保存等过程中一些细节和注意事项进行了比较详细的分析比较,希望能为棉花BAC文库的构建提供一些可供借鉴的经验。     

高纤维强力棉花种质系苏远7235 BAC文库的构建

苏远7235是我国利用异常棉等多个野生种创造的高纤维强力棉花种质系,是开展棉花纤维品质研究的重要材料。本研究以pIndigoBAC-5(HindIII-cloning ready)为载体,构建了苏远7235的细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)文库,该文库包含30336个BAC克隆。分析结果表明,重组克隆苏远7235 DNA插入片段为50-140 kb,平均120 kb,空载率2.1%,89.6%的克隆插入片段大于100 kb。     

棉花抗黄萎病相关基因筛选与亚克隆文库构建

以黄萎病菌诱导下差异表达的棉花抗病相关基因片段PR8为探针,利用杂交方法,对优质、抗病海岛棉品种Pima90-53 BAC文库进行筛选。从30 336个BAC克隆中筛选到含有PR8基因片段的4个阳性克隆,分别为127K13,128D14,169J3和178C5。用Sau3AI对其中的169J3克隆进行酶切,回收2~4 kb的DNA片段并连接到载体pUC118BamHI-BAP上,构建了含有该基因片段的亚克隆文库,共含有4 224个克隆。经电泳检测,插入片段在1~3 kb,平均为2 kb。该亚克隆文库的构建为克隆PR8基因奠定了基础。     

陆地棉雄性不育恢复系18R的BAC文库构建

 18R雄性不育恢复系农艺性状优良,恢复性状稳定,对不育系能够100%恢复,是研究棉花三系互作的重要材料。本研究以pCC1BAC(BamHI)为载体,构建了18R的细菌人工染色体（BAC）文库。建立的文库包含139,200个BAC克隆。分析结果表明, BAC文库DNA插入片段为50～200 kb,91%的克隆插入片段为80～150 kb,平均102 kb,空载率<2%,覆盖6.3倍基因组。     

Construction and characterization of a BAC library for sunflower (Helianthus annuus L.)

A bacterial artificial chromosome (BAC) library was constructed using the sunflower (Helianthus annuus L.) restorer line RHA325, which carries the restorer gene Rf1 and the Pl2-gene conferring resistance to downy mildew. High molecular weight DNA was prepared from nuclei using leaf material from two-week old seedlings. The library was constructed using the HindIII site of pBeloBAC11. The current BAC library comprises 104,736 clones. The insert size of the clones varied between 20 and 270 kb, with an average insert size of 60 kb. The whole 1.9× sunflower BAC library was spotted in duplicate on four high-density filters, each carrying 55,296 clones. The content of organellar DNA, which was estimated by colony hybridisation against the mitochondrial probe coxI and the chloroplast probe rbcL, proved to be less than 0.03 and 0.1%, respectively. BAC pools, allowing PCR-based screening, were made and used to identify positive BAC clones for the markers OP-K13_454, closely linked to the restorer gene Rf1. The PCR-based screening was verified by the results obtained for this marker by colony hybridisation.     

以小麦根尖分生组织细胞核及染色体制备高分子量DNA

为了克服以叶片为材提取HMW DNA的局限性,优化了一套简便、实用的提取方法。该法以细胞周期同步化处理的根尖分生组织为材,利用机械匀浆释放细胞核或中期染色体制备悬浮液,再以蔗糖密度梯度离心和流式分选技术分别分离细胞核和染色体,经去蛋白、酶切,透析获得HMW DNA。经检测,来自200条根尖（10个胶块）的HMW DNA的浓度约为4~20 ng/µL,而连接、转化后的BAC克隆平均插入片段超过100 kb。证明该法适用于提取HMW DNA以构建BAC文库。     

高抗黑胫病烤烟BAC文库的构建及分析

烟草是重要的模式植物。本研究利用pIndigoBAC536-S载体及Hind III限制性内切酶酶解烟草基因组DNA的方法,构建了烟草新品系14-60的细菌人工染色体(BAC)文库。该文库共包含414,720个克隆,保存在1080块384板中。随机挑选的120个烟草BAC克隆检测结果表明,外源插入片段大小为97.0～145.5 kb,平均约为123 kb,空载率极低(0),覆盖烟草基因组11倍。用烟草hem A基因、eIF4E-1基因、NtFT基因的特异引物进一步验证,该文库质量高、可用性强,为烟草黑胫病抗性基因的克隆以及其他重要农艺性状和品质性状等功能基因克隆研究提供了基础资源。     

中国水仙BAC文库构建的研究

为更深入地挖掘中国水仙的基因组信息,筛选与中国水仙品质相关的功能基因,以中国水仙品种‘金盏银台’的黄化叶片为材料,采用改良Zhang法获得高分子量核DNA,经酶切、连接和转化,首次构建了中国水仙基因组BAC文库。结果表明,采用改良zhang法获取的核DNA分子量大于1 Mb,适合BAC文库的构建;优化了连接、转化体系,发现载体和插入片段的摩尔比为5:1时,连接、转化效率最高;经检测,该文库包括69120个克隆,插入片段的平均大小约87 kb,空载率小于1%,大约50%的克隆大小在80~90 kb之间;Southern blot结果表明该文库未受到细胞器DNA的污染。     

Construction and characterization of a BAC library of soybean

We have constructed a soybean (Glycine max (L.) Merrill) bacterial artificial chromosome (BAC) library from green leaf protoplasts of the cultivar, Misuzudaizu. The library contains 53,760 clones with an average insert size of 116 kb. About 2.9% chloroplast DNA origin was revealed by PCR and colony hybridization. Apart from 2.8% clones having no insert, this library represents 5.2 genome equivalents. With this genome coverage, the probability of having any DNA sequence represented in the library is higher than 99.5%. Three-dimensional pools of the BAC library in combination with the use of a high efficiency genome scanning (HEGS) electrophoresis facilitate rapid and efficient PCR-based screening. An average of five positive clones were identified after screening the BAC library with SSR and STS markers. BAC-end walking was performed for three SSR associated BACs. This library will provide a good resource for positional cloning of agronomically and biologically important QTL genes that Misuzudaizu possesses.     

甘蓝型油菜基因组文库的构建及与硼高效基因相连锁克隆的筛选

以甘蓝型油菜宁RS-1为材料,构建了含有82944个克隆的甘蓝型油菜的BAC基因组文库.从文库中随机挑取克隆进行DNA长度检测,BAC克隆平均插入片段大小为80 kb,覆盖甘蓝型油菜基因组的5.1倍.随机挑取108克隆进行继代培养100代,分离质粒酶切检测表明不存在插入片段丢失现象,表明该文库的克隆在大肠杆菌中稳定存在;以与硼高效基因相连