湿加松的SSR反应体系优化

对湿加松SSR反应体系中模板DNA的用量、Mg^2＋浓度、dNTPs及Taq酶的用量、变性温度、退火温度、反应循环次数共7个影响SSR扩增效果的因素,逐一设置单因素多水平进行试验,以目测比较确定谱带条数、亮度、清晰度、背景透明度以及结果的重复性等为判定反应条件适合程度的指标,其反应体系为25uL,扩增程序经优化后确定为：10ng的模板、1×PCR缓冲液、2．5mM的Mg^2＋、0．2mMdNTPs、0．6UTaq酶、正反向引物各0．2uM;最优反应程序为94℃预变性2min之后进入循环,每个循环94℃变性45s,退火45S,72℃延伸45S。退火温度从Tm开始,每隔2个循环降低1℃,直至（Tm-10℃）,维持40个循环。循环结束,72℃延伸5min。     

云南松SSR—PCR反应体系的优化研究

本项研究以云南松实生苗幼嫩针叶为材料,采用单因素试验设计,分析云南松SSR—PCR扩增反应体系中各组分对扩增结果的影响,并进一步采用正交试验设计对SSR—PCR扩增反应程序进行优化。结果表明,在15μL SSR-PCR反应体系中包括,1×TaqPCRBuffer,模板DNA用量30ng,Taq聚合酶用量1．0U,0．2mmol L-1dNTPs,3．0mmol·L-1Mg2＋以及正、反引物各0．2μmol．L-1;扩增反应程序为,94℃预变性4min;94℃变性30s,退火30s,72℃延伸45s,35个循环;最后72％延伸10min,4℃保存。该反应条件的建立为开展云南松种质资源SSR分子标记研究提供了参考依据。     

美国白蛾SSR反应体系的优化与初步应用

我国于1979年首次在辽宁省丹东市发现美国白蛾(Hyphantria cunea)后,害虫扩散蔓延到山东、陕西、河北、天津和上海。美国白蛾繁殖量大,寄主植物种类繁多,扩散速度快,暴发时常食尽叶片。近     

柳树SSR反应体系的建立与优化

以簸箕柳(Salix suchowensis Cheng)295-2、绵毛柳(Salix erioclada)716为试材,利用正交设计直观分析法和单因子试验优化柳树SSR-PCR反应体系,通过研究,确定柳树10 μLSSR反应体系为:DNA模板20 ng左右;Taq聚合酶:0.5 U;Mg2+:2.5 mmol/L;dNTP:0.1 mmol/L;引物(R&F):0.3 μmol/L.PCR反应程序为:94 ℃ 2 min;94 ℃ 45 s,(Tm-5)℃ 15 s,72 ℃ 45 s,35循环;72 ℃延伸8 min;4 ℃保温.利用优化的反应体系和程序,对杂种109(簸箕柳295-2×绵毛柳716)的90个单株和柳树的其他几个种进行PCR 反应,验证了其可行性.     

兴安落叶松SSR反应体系的建立与优化

采用L16(4^5)正交试验设计,对影响兴安落叶松SSR-PCR反应体系的主要因素(模板DNA、d NTPs、Mg^2+、Taq聚合酶浓度及引物浓度)进行了试验分析,其结果表明:兴安落叶松SSR-PCR体积为20μL的最佳反应体系是模板DNA用量50 ng、正反向引物浓度均为5μmol·L^-1、d NTPs浓度为2.5 mmol·L^-1、Mg^2+的浓度为2.5 mmol·L^-1、Taq聚合酶用量为1.0 U、最佳退火温度为60℃。试验所建立的反应体系可进一步用于兴安落叶松SSR遗传图谱构建、多样性分析、良种选育等方面的研究中。     

李ISSR反应体系的优化

以李品种杏梅(hybrid)和斯顿莱(Prunus domestica)为试材，研究了PCR反应体系的主要成分及退火温度对李ISSR扩增结果的影响。结果表明：在20μl的反应体系中，模板DNA含量对扩增结果影响不大，在10—80ng均能得到较好的扩增；椰用量对扩增无明显影响；而Primer、Mg^2 的最适浓度分别为0．25μmol／L、0.25mmol/L；Taq酶在0．5～1．0U均能得到好的扩增条带；退火温度在50-52．1℃范围内均能得到清晰的条带。     

红松SSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立红松SSR-PCR最佳反应体系,以CTAB法提取的红松针叶DNA为模板,应用单因子试验及L16(45)正交试验系统分析了DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶浓度等对SSR-PCR扩增结果的影响,并对延伸时间、热循环参数进行了探讨,建立了稳定的、可重复的红松SSR-PCR最佳反应体系及PCR扩增参数。结果表明,PCR的最佳反应体系为:10μL体系中,1×PCRbuffer1μL、DNA模板50～120ng,Mg2+3mmol/L,dNTP0.4mmol/L,引物0.5μmol/L,Taq酶0.75U。利用该体系筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物13对。在此反应体系下,所扩增谱带清晰、稳定、多态性高。     

湿地松、加勒比松及其杂交种DNA的提取与微卫星PCR反应体系的优化

文章归纳总结了湿地松、加勒比松及其杂交种湿加松DNA提取的操作流程及其质量检测等方法,并就湿加松的微卫星PCR反应体系的优化问题,进行了一系列的试验,包括Mg2 浓度的梯度试验、不同退火温度和不同循环次数下的扩增试验。试验结果表明,用CTAB法在冰浴下研磨就可以得到质量较好的 DNA用于PCR扩增;PCR的最优反应体系使用20μl的反应体积,2．0 mM镁离子浓度,经30个循环后可扩增出较好的谱带。     

龙眼SRAP-PCR反应体系的优化

为建立龙眼的SRAP-PCR体系,对影响SRAP-PCR的退火温度、引物浓度、dNTP、模板DNA、Mg2+等因素进行优化。确定优化的龙眼SRAP-PCR反应体系为:10×buffer(Mg free)2.5μl,dNTP mixture(10 mmol.L-1)2.0μl,primer(10μmol.L-1)(0.7+0.7)μl,Mg2+(25 mmol.L-1)1.0μl,模板DNA 40 ng,Taq DNA聚合酶1.5 U,以双蒸水补足至25μl。退火温度51℃。利用该优化的体系对来自中国、泰国、印度尼西亚的16份龙眼种质进行SRAP扩增,电泳显示获得了清晰、稳定的扩增结果。     

七叶树RAPD反应体系的优化

以七叶树新鲜叶片为材料,研究了七叶树RAPD分析过程中的影响因素包括Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间、循环次数等,建立了适合七叶树RAPD反应的PCR体系。即20μl反应体系中含有dNTP 0.25 mmol/L,Mg2+2.5 mmol/L,Taq酶1.0U,引物0.8μmol/L,DNA模板50ng。扩增程序为:94℃预变性5min,然后40个循环(94℃变性30 s,33℃退火40 s,72℃延伸60 s),最后72℃延伸10min,4℃保存。     

班克松SRAP-PCR反应体系的优化

以班克松幼叶为试材,采用L16（45）正交设计对SRAP-PCR反应体系进行优化,结果表明：班克松SRAP-PCR最佳反应体系为：1.5 mmol/L Mg2＋、0.1 mmol/L dNTPs、0.2μmol/L引物、1.5 UTaq酶和30 ng模板DNA。运用优化的反应体系对班克松进行验证,电泳结果显示扩增条带清晰,多态性高,证明该体系稳定可靠。这一优化体系的建立为今后利用SRAP标记技术,对班克松分子生物学研究提供了技术参考。     

松口蘑与栎松口蘑RAPD反应体系的优化

以长白山松口蘑与栎松口蘑为材料,建立了松口蘑与栎松口蘑RAPD反应优化体系。即在20μl反应体积中,模板DNA 10ng,引物0.3μmol.L-1,dNTP 200μmol.L-1,MgCl22mmol.L-1,Taq DNA聚合酶1unit,1×Buffer;反应程序为预变性94℃5min,94℃45s、36.3℃60s、72℃90s共循环45次,最后72℃延伸7min。     

杠柳ISSR引物的筛选及PCR反应体系的优化

为建立适用于杠柳ISSR分子标记研究的扩增体系,进一步利用ISSR标记研究杠柳遗传多样性,探讨了杠柳ISSR分子标记中的各影响因素,分别对河北11个不同地区杠柳基因组DNA进行PCR扩增,在Taq MasterMix(康为世纪)基础上对影响ISSR-PCR扩增结果的模板DNA浓度、循环次数、引物退火温度进行梯度筛选。结果表明:在100条通用引物中共筛选出34条扩增条带清晰、整齐的ISSR引物;确立了适合杠柳ISSR分子标记的反应体系:总反应体积25μL,其中Taq MasterMix(含DNA聚合酶、MgCl_2、dNTPs、反应缓冲液以及稳定剂)12.5μL,模板DNA 1μL(70ng/μL),正向引物和反向引物各1μL(10μmol/L)。该体系的确立为今后利用ISSR技术对杠柳种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

油料植物光皮树SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

建立稳定可靠的SSR-PCR反应体系、筛选具有多态性SSR引物,是木本油料植物光皮树分子标记辅助育种与良种选育的重要基础研究。为给SSR标记技术在光皮树遗传图谱构建、亲缘关系鉴定及分子育种等方面的应用研究奠定基础,利用"Cf-05"正反向引物,采用L16(45)正交试验设计和单因素试验相结合的研究方法,对影响光皮树SSR-PCR反应体系的主要因素(模板DNA、引物、d NTPs、Mg~(2+)、Taq聚合酶浓度及退火温度)进行了试验分析。试验结果表明,光皮树SSR-PCR总体积为15μL的最佳反应体系为:模板DNA用量37.5 ng,正反向引物浓度均为0.6μmol·L~(-1),d NTPs浓度为0.3 mmol·L~(-1),Mg~(2+)的浓度为1.5 mmol·L~(-1),Taq聚合酶用量为1.5 U,最佳退火温度为50℃。运用优化了的光皮树SSR-PCR反应体系,可从71对引物中筛选获得11对能适用于光皮树的SSR引物。研究结果表明,试验所建立的反应体系可进一步用于光皮树SSR遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等方面的研究中。     

山茶ISSR扩增条件的优化

以山茶基因组DNA为材料,测试山茶ISSR扩增的最适退火温度,并采用单因素试验,测试了模板DNA量,Mg2+浓度,dNTP浓度,BSA浓度,引物用量,Taq酶用量等6个因素对山茶ISSR扩增的影响。结果显示:山茶ISSR扩增的最适退火温度为56.3℃;适宜的扩增体系为:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris.HCl pH 9.0,50mmol.L-1KCl,0.1%Triton X-100),2 mmol.L-1MgCl2,0.6 mmol.L-14×dNTP,2 mg.ml-1BSA,16 ng模板DNA,10 pmol引物,0.5 U Taq酶。     

杉木SSR-PCR体系优化

SSR-PCR反应体系优化是杉木SSR标记研究的基础.利用正交L16 (45)设计实验对杉木SSR-PCR反应体系的Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和DNA浓度5个因素的4个水平进行优化试验.并在正交直观分析和方差分析的基础上,分别对Mg2+、dNTPs进行单因素确定.获得的最佳反应体系为:在20 μL反应体系中,Mg2浓度为1.0mmol/L,引物浓度为0.25 μμmol/L,dNTPs浓度为0.15 mmol/L,Taq酶为0.05 U/μL,DNA为30 ng,10×PCR Buffer 2μL,不足部分用双蒸水补齐至20μL.在最佳反应体系的基础上,采用单因素实验确定了引物的最佳退火范围为63～53℃.利用此反应体系对10个F1代杉木材料及其亲本,进行4对SSR标记进行PCR扩增并电泳检测,其结果清晰、稳定.说明此体系适合进一步的杉木SSR研究工作.     

野杏SSR-PCR反应体系优化

为建立稳定可靠的野杏SSR-PCR反应体系,以3个野杏无性系170号、240号、263号和1个西伯利亚杏无性系508号为试验材料,采用L16(45)正交试验设计对影响野杏SSR-PCR反应的5个因素在4个水平上进行优化。结果表明:各因素对反应体系的影响由大到小依次为DNA模板浓度、引物、dNTP、Mg2+、Taq聚合酶。野杏SSR-PCR最佳反应体系(总体积20μL):dNTPs 0.45 mmol/L、Mg2+2 mmol/L、Taq酶1.125 U、引物0.125μmol/L、DNA模板20 ng。选用引物X128和60个野杏样木对该体系进行稳定性验证,扩增产物集中在100～200 bp,稳定度高,多态性良好,该体系可应用于野杏分子标记辅助育种等方面的研究中。     

润楠ISSR-PCR优化反应体系建立及引物筛选

以润楠基因组总DNA为材料,利用单因素试验设计方法,对影响ISSR-PCR扩增的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Tag DNA聚合酶以及去离子甲酰胺等试验因子进行了优化试验,筛选出16条有效引物并确定了它们的退火温度,并检测了体系的重复性。优化后的反应体系为:20μL PCR反应体积中,10×PCR Buffer 2μL,2.0mmol/L Mg2+1.6μL,0.2 mmol/L dNTPs 2μL,0.4 mmol/L引物0.8μL,0.5U Taq DNA聚合酶0.1μL,40 ng DNA模板1.0μL,1.5%去离子甲酰胺0.3μL,ddH2O 12.2μL。扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,据不同引物的退火温度复性45 s,72℃延伸90 s,反应37个循环,最后在72℃延伸7 min。润楠ISSR-PCR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术研究润楠的遗传多样性奠定了良好的基础。