适于基因枪转化的棉花茎尖培养及筛选体系初探

将棉花种仁无菌培养40～60h,制备茎尖分生组织,培养在无激素MSB培养基上,直接再生完整植株。植株再生率与品种基因型差异较小,与再生培养基的成分相关。棉花茎尖分生组织制备的优劣与基因枪转化率密切相关。筛选培养过程中,卡那霉素的起始时间和浓度梯度等因素对转化率有直接影响。还描述了非转化植株的表现,探讨了抗生素最高筛选压的确定等问题。     

以棉花茎尖分生组织为受体进行基因枪轰击转化的研究

以棉花茎尖分生组织为受体进行基因枪遗传转化,在不受宿主基因型范围和操作时间的限制等方面优于农杆菌介导法和花粉管通道技术。影响棉花茎尖分生组织基因枪遗传转化率的因素较为复杂,轰击前,外植体制备需考虑茎尖分生组织的取材时间、下胚轴保留的长度、外源生长调节剂及活性炭的使用量,以保证其正常生长;轰击后,抗生素筛选的浓度、筛选培养基的转换时间和抗性苗的壮苗也会影响转化效率;此外,DNA和钨粉或金粉的质量、基因枪参数及操作等对转化效果都有一定的作用。除对影响茎尖分生组织基因枪转化率的因素分析以外,还对近年来在棉花茎尖分生组织遗传转化中的最新动态进行了综述,并对目前存在的问题加以讨论。     

棕色棉茎尖基因枪遗传转化

为了建立高效的棉花茎尖遗传转化体系,以棕色棉品种新彩棉5号为材料,采用茎尖培养和基因枪遗传转化方法,通过对凝固剂种类、活性炭含量、卡那霉素浓度、渗透处理时间、轰击压力、轰击距离等因素的优化,建立了棕色棉新彩棉5号茎尖基因枪遗传转化技术体系。结果表明,不同凝固剂种类、活性炭含量、卡那霉素浓度、渗透处理时间、轰击压力和轰击距离对棕色棉茎尖转化率有明显影响。最佳的遗传转化体系为:前渗处理4 h,轰击压力7.586 MPa(1100 psi),轰击距离9 cm,轰击后恢复培养4 d,然后在MSB+8 g·L~(-1)琼脂+125mg·L~(-1)卡那霉素筛选培养基中筛选25 d。获得抗性芽后,在添加1 g·L~(-1)活性炭的生根培养基中诱导抗性芽生根,并获得抗性再生植株。通过PCR和q PCR检测,5200个茎尖共获得16株阳性转基因植株,转化率为0.31%。该技术体系的建立为棕色棉的遗传转化奠定了基础,为彩色棉育种提供了新的材料。     

陆地棉（G．hirsutumL．）茎尖分生组织培养及其在基因导入上的应用

陆地棉栽培品种的种子无菌发芽１～３天。将萌动种子的顶端分生组织培养在无激素或附加低浓度激素ＭＳ基本培养基上，直接再生完整小植株。从顶端分生组织到再生植株所需的最短培养时间约１０天。顶端分生组织供体种芽的萌芽天数及其所连接的胚轴长度对植株再生频率有明显影响，但与品种的关系较小，不同品种均能获得再生植株。应用基因枪轰击法将ＣＰＴⅠ基因和ＮＰＴⅡ基因的重组质粒导入到棉花茎尖分生组织，培养获得卡那霉素抗性株。     

棉花基因枪茎尖转化研究

对棉花茎尖轰击转化的多种因素进行了分析,建立了较为完善的基因枪茎尖转化体系,使抗性转化率达到4.7％～9.4％,转化周期缩短至2～3个月,改进了抗性筛选程序,建立了4次筛选法,获得91株抗生素抗性植株;同时对部分植株目的基因的表达量进行了初步的遗传分析。结果表明,茎尖的轰击状态与抗性筛选程序对转化周期与转化率具有决定性作用。     

基因枪介导的海岛棉(Gossypium barbadense L.)茎尖遗传转化体系的建立

以新疆海岛棉品种新海13号的茎尖为转化受体,采用基因枪介导法,研究DNA包裹浓度、微载体种类、前渗处理时间、轰击条件、筛选方法等对茎尖转化的影响,建立了基因枪法介导的海岛棉茎尖转化体系。研究结果表明,采用1.5μg·μL-1的质粒DNA包裹1.0μm金粉微载体,前渗处理12 h,轰击压力为7.584 MPa(1100 psi),轰击距离为6 cm,后渗处理16 h,恢复处理24 h,在120 mg·L-1卡那霉素浓度下直接筛选35 d。在添加4g·L-1活性炭粒的生根培养基中诱导抗性幼苗生根,获得抗性再生植株。通过PCR和RT-PCR检测,共得到5株转抗除草剂基因EPSPS的阳性植株。该研究体系的建立为海岛棉的遗传转化奠定了基础,为海岛棉的育种工作提供了材料。     

基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌介导转化方法的研究

以中棉所49、珂字棉201和YZ-1为受体材料,通过对培养基草甘膦浓度、农杆菌侵染时间和浓度、共培养时间以及恢复培养条件等因素的优化,建立了基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌转化技术体系,并将抗草甘膦基因(EPSPS-G6)导入3个受体材料,获得转基因抗草甘膦棉花植株.研究结果表明,适合于棉花茎尖农杆菌介导的草甘膦筛选浓度为10 mg·L-1;茎尖转化体系为农杆菌菌液OD600为0.9～1.0,侵染时间为20min,共培养时间为48 h,选用SH培养基并加入适量活性炭(0.5 g·L-1)作为恢复培养基.用本研究创制的转化技术体系,转化处理3个陆地棉受体360个茎尖,共获得60株抗性再生植株,经PCR检测,获得阳性抗性植株26株,移栽成活23株.以茎尖外植体数计算,本体系的转化成功率6.4％.该转化体系适合于转化抗草甘膦基因或以抗草甘膦基因为筛选基因的外源基因,具有转化频率高、嵌合体少、转化周期短等优点.     

以茎尖分生组织为受体用农杆菌介导法转化激发子基因pemG1棉花植株的获得

为了解决棉花常规遗传育种周期长,农杆菌介导的转化下胚轴再生难,转化率低,胚变异率高等难题。通过改善茎尖的遗传转化,利用农杆菌介导法转化棉花茎尖,试图缩短转化周期,获得转化苗。构建了稻瘟菌激发子基因pemG1的植物表达载体pCAMBIA2300-pemG1,分别以‘珂字312’、‘中棉24’棉花茎尖分生组织作为外植体,摸索无菌苗的最佳培养方案,确定最佳共培养温度、共培养时间及卡那霉素筛选浓度。经过共培养,茎尖在诱导芽培养基上诱导生芽,从不同浓度的BAP和NAA生长激素的组合中,最终确定0.1 mg/L的BAP和NAA最适合芽的诱导;经过两个月的继代培养,在含有GA3的茎增殖培养基上完成茎的增殖和延伸;切取幼芽并使其在含有0.1 mg/L的IBA生根培养基中生根;生根的抗性植株移栽到温室中成苗,获得了T0代转基因株系4株。进行了转pemG1阳性植株的初步验证。     

基因枪转化小麦主要轰击参数的优化

基因枪转化是目前小麦遗传转化的主要方法。影响基因枪转化效率的主要参数有轰击距离、轰击压力、DNA总量及浓度、金粉颗粒大小及用量等。为改善目前小麦遗传转化效率偏低的现状, 以普通小麦品种科农199为受体材料, 设金粉大小(0.6 μm和1.0 μm)、轰击距离(5.5 cm和8.5 cm)及轰击压力(650、900和1100 psi)三因素共12个处理, 利用pAHC25质粒转化小麦幼胚, 以确定最佳轰击参数, 建立稳定高效的普通小麦基因枪转化体系。结果表明, 3个因素的不同组合对幼胚的愈伤诱导效率没有明显影响, 但对再生率影响较大, 以金粉0.6 μm、轰击距离5.5 cm的再生率最高。3个因素组合的不同处理对GUS瞬时表达有明显影响, 以金粉0.6 μm、轰击距离5.5 cm和轰击压力650 psi处理的GUS瞬时表达量最高。本试验最终获得28株转基因植株, 其中12株来自金粉0.6 μm、轰击距离5.5 cm和轰击压力650 psi的处理, 该处理的平均转化率达2.66%。     

基因枪介导抗除草剂基因2mG2-epsps转化玉米的初步研究

本研究以优良玉米自交系X2211和78599的幼胚胚性愈伤组织为受体材料,采用基因枪介导法将抗除草剂基因2mG2-epsps导入玉米胚性愈伤组织,经草甘膦(glyphosate)筛选,产生抗性愈伤组织并获得320株再生植株,通过喷施除草剂筛选,有65株表现良好的耐除草剂特性。PCR分析表明,其中的7株表现PCR阳性,初步证明2mG2-epsps基因整合到玉米基因组中,平均转化率为2.2%。同时研究了金粉用量和轰击距离对玉米基因枪转化效率的影响。转化时以金粉用量100μg/枪,发射点与靶细胞距离60mm最佳。     

基因枪法对大豆进行CpTI基因的遗传转化

以大豆品种合丰25的球形期体细胞胚为受体,以CpTI基因为目的基因,应用基因枪法进行了遗传转化,同时以抗性体细胞胚筛选率作为转化率的指标,对影响基因枪转化的几个参数进行了优化研究。结果表明,氯化钙浓度2.5 mol/L、氦气压力1 100 Psi、轰击次数为2次,有利于提高转化率;经卡那霉素筛选得到抗性植株,经PCR分析鉴定有2株为阳性,初步证明外源基因CpTI已转到大豆基因组内。     

基因枪介导法转化苎麻获得转基因植株的研究

以苎麻品种中苎1号子叶愈伤组织为受体材料,利用基因枪法将外源双价抗虫基因(CryIA+CpTI)导入苎麻,以期建立基因枪转化苎麻的技术体系.结果表明,基因枪转化苎麻的最佳条件为轰击压力1 300psi、金粉+DNA用量500μg+1.0μg/枪、轰击距离9cm、轰击次数2次,共获得4株阳性转基因植株.苎麻子叶愈伤组织的基因枪转化法是苎麻遗传转化的新方法,为建立苎麻基因枪转化体系奠定了基础.     

Towards genetic transformation in the monocot Alstroemeria L.

The successful application of plant biotechnology to Alstroemeria improvement will largely depend on the availability of an efficient regeneration/transformation system. Regeneration in Alstroemeria is accomplished from nodular embryogenic callus initiated from zygotic embryos. Histological studies of embryogenic callus initiation from 4-weeks old cultured ovules revealed that the outermost layers of the protoderm of the embryogenic nodules divided to form either a new nodule or aproembryo. Transient gene expression after particle bombardment of nodular embryogenic callus was optimized using DNA of pAHC25. The highest β-glucuronidase expression was found when the GUS gene was under control of the maize ubiquitin promoter, the target tissue was placed 5 cm below the microcarrier launch assembly and when the rupture disc-breakage point was between 650–900 psi. Kanamycin blocked regeneration of somatic embryos, however, did not block growth of nodular embryogenic callus. With phosphinothricin both callus growth and regeneration were blocked. Bombardment of nodular embryogenic callus with DNA of pAHC25 combined with selection on medium containing phosphinothricin resulted in putative transgenic chimeric. Friable calli were selected from nodular embryogenic callus and used to initiate suspensions. These cell suspensions were subjected to transformation by particle bombardment using DNA of pAHC25 and resulted in a stable transformed friable callus line after selection based on luciferase activity. Even after 2 years of maintenance this callus line was luciferase positive and the Polymerase Chain Reaction analysis demonstrated the presence of the introduced gene in this friable callus line. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

Parameters influencing the regeneration capacity of calluses derived from mature indica and japonica rice seeds after microprojectile bombardment

The microprojectile bombardment procedure has allowed the stable transformation of indica and japonica rice varieties, although at different frequencies of transformation depending mainly on their regeneration capacity and on the specific parameters of the transformation protocol. A study of the process of regeneration to whole plants from primary calli derived from mature indica and japonica rice seeds, via embryogenesis, has shown that somatic embryos are produced by division and differentiation of the external cell layers of callus tissues. Adjusting the bombardment conditions to optimize gene delivery to those regenerable cells, we have evaluated the influence of parameters such as the target distance, particle penetration and the effect of osmotic treatment on the regeneration capacity of bombarded cells. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

转基因防龋生菜叶片转化体系的优化

目的:优化生菜的基因转化系统,为下一步防龋用转基因植物表达载体质粒转化生菜工作提供实验基础。方法:以6种不同的生菜种子为试材,以1/2 MS为基础培养基,经对出芽率比较,苗龄及直接分化培养基的确定以及抗生素敏感性测试,获得正常再生抗性生菜植株。结果:3～4 d的"意大利"生菜子叶在1/2 MS+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA培养基上直接分化率最高,生根培养基为1/2 MS,抗生素巴龙霉素(Paromomycin)选择压浓度为50 mg/L。结论:成功确立了防龋用转基因植物表达载体质粒的生菜叶片转化体系,获得了较高的转化频率。     

沙冬青脱水素基因转化紫花苜蓿的研究

为获得抗旱性较强的转基因苜蓿植株,以紫花苜蓿品种中苜2号作为基因转化受体,通过对外植体选择、菌液浓度、选择压确定、侵染时间和共培养时间等因素进行优化,成功建立了农杆菌介导的遗传转化体系。在此基础上,将沙冬青脱水素基因通过农杆菌的介导,转化到中苜2号中。试验结果显示,子叶和下胚轴作为外植体愈伤组织诱导频率最高,可达100%;获得抗性愈伤组织与转基因植株的卡那霉素最佳筛选浓度为25 mg/L;外植体与农杆菌的共培养时间以5 d为最佳。试验共获得126株T0抗性株,PCR检测30株表现为阳性,表明脱水素基因已转入受体植株中。     

Cry1Ab/1Ac基因在转基因玉米中的表达研究

本研究通过人工合成获得了密码子的优化Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab/1Ac,并以草甘膦抗性基因epsps为标记基因,构建了高效表达载体pBAC174,并用基因枪法将表达载体pBAC174导入受体材料幼胚愈伤组织。对轰击后的愈伤组织进行筛选、分化和植株再生,获得40个草甘膦抗性的玉米再生植株。经PCR和Southern杂交检测表明,外源Cry1Ab/1Ac基因已经整合到玉米的基因组中。转基因植株叶片蛋白粗提物用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试纸条检测,结果表明Bt基因在部分转基因植株后代获得了表达。本研究为进一步利用Cry1Ab/1Ac基因进行玉米抗虫育种奠定了基础。